| SUPEROVULACIÓN CON PMSG APLICADA EN FASE FOLICULAR Y FASE LUTEAL EN ALPACAS Carlomagno Velásquez V.1 y César Novoa M.2
ABSTRACT Superovulatory response after PMSG and LH hormones administration during follicular phase and induced luteal phase was evaluated in alpacas. The experiment was carried out (luring march and April, 1996, at la Raya, IVITA Camelids Research Station, located at 4 200 m. above sea level, 15º south, and 71º west. For this, fifteen empty females alpacas of the Huacaya breed, ranging from 2 to 11 years of age were divided in 3 equal groups (n=5) and assigned to the following treatments: TI (control): day 0, 2 ml destilled water, i.m. injection; T2 (follicular phase): day 0, 1000 IU PMSG, i.m.; day 6, 1000 IU hCG, 1.m.; and T3 (induced luteal phase): day -7, progesterone application (vaginal pessaries); day 0, 1000 IU PMSG, i.m.; day 2, remove progesterone pessaries; day 6, 1000 IU hCG, i.m. The ovarian response to the superovulation stimulation was ascertained by recording the number of corpora lutea (CL) through laparotomy and by measuring progesterone levels in blood circulation by RIA. The number and size of corpora iutea were significantly higher (P<0,05) in T3 vs T, (17,80±8,34 vs 8,20±2,34 CL, and 13,64±2,00 vs. 1,0,48±0,78 mm, respectively). As regards the blood progesterone levels (nmol/l), the results on day 0 were basal (T,= 0,96±0,76; T,= 1, 1 7±1,03 and T,= 3,51±0,97). However on day 16 these levels in T, (44,27±30,17) and T, (46,98±22,91) increased drastically but in T, remained low (1,09±0,39). The correlation between CL formed and blood progesterone levels measured on day 16, was very low (r=-0,078; P>0,05). We conclude that PMSG followed by hCG represent a good alternative for inducing superovulation in alpacas. However, from our results it would be advisable to investigate the effects of such hormones in lower dosis upon superovulation. Key words: alpaca, superovulation, progesterone, corpus luteum. RESUMEN Se comparó la respuesta ovulatoria a la estimulación con PMSG aplicada en fase folicular versus fase luteal inducida, en alpacas. El estudio se realizó en la estación experimental del IVITA "La Raya" - Cusco (15º latitud sur, 71º longitud oeste), durante los meses de marzo - abril de 1996. Se usaron 15 alpacas Huacaya, vacías, entre 2 a 11 años de edad, que fueron divididas en tres grupos iguales, los que recibieron al azar los siguientes tratamientos: T, (testigo): día 0,2 ml de agua destilada; T, (fase folicular): día 0, 1000 UI PMSG; día 6, 1000 UI hCG; T3 (fase luteal inducida): día 7, aplicación vaginal de Progesterona (CIDR); día 0, 1000 UI PMSG; día 2, retiro del dispositivo CIDR; día 6, 1000 UI hCG. La respuesta ovulatoria fue medida verificando el número de cuerpos lúteos (CL) mediante laparatomía y determinando los niveles de progesterona plasmática con la prueba de RIA. El número y tamaño de los cuerpos lúteos formados en T3 (17,8±8,3 CL y 13,6±2,0 mm) fueron mayores (P<0,05) a los registrados en T2 (8,2±2,3 CL y 10,5±0,8 mm). Con respecto a los niveles de progesterona plasmática (nmol/L), el día 0, fueron basales en T1 y T2 (0,96±0,76 y 1,17±1,03 nmol/L, respectivamente) y ligeramente elevadas en T3 (3,51 ±0,97 nmol/L); mientras que en el día 16 mostraron un incremento marcado tanto en T2 como en T3 (44,27±30,17 y 46,98±22,91 nmol/L, respectivamente), en cambio T1 continuó con niveles basales (1,09 ±0,39). La correlación entre el número de cuerpos lúteos formados y los niveles de progesterona plasmática medida al finalizar el experimento (día 16) fue prácticamente inexistente (r=-0,78; P>0,05). Se concluye, que el uso de la PMSG seguido de hCG es una alternativa para estimular la superovulación en alpacas. Sin embargo, se requiere probar dosis menores que las empleadas, particularmente en el T3 donde se observó un crecimiento ovárico excesivo con fuerte presión en la pared de la bolsa ovárica. Palabras claves: alpaca, superovulación, progesterona, cuerpo lúteo. INTRODUCCIÓN El fomento de la crianza de Camélidos Sudamericanos, particularmente de la alpaca, debe contribuir al bienestar de un sector importante de población que habita los andes altos; dichos recursos son fuente de ocupación e ingresos, de carne, fibra y de otros bienes de gran valor. Para dicho propósito se requiere, entre otros aspectos, mejorar las prácticas tecnológicas de las crianzas a fin de elevar la producción y productividad. En esta consideración, un aspecto que merece atención es el mejoramiento genético y para ello varias instituciones están trabajando en la formación de núcleos genéticos orientados a la selección y producción de animales genéticamente superiores desde el punto de vista productivo, los mismos que son usados como reproductores en los rebaños que se desean mejorar. Sin embargo, existe una limitante, para difundir rápidamente este material genético deseado, la tasa reproductiva de los animales es muy lenta; en efecto, una hembra produce un promedio de cuatro crías durante toda su vida productiva. Esta limitación se podría superar usando la técnica de ovulación múltiple (OM) y transferencia de embriones (TE) que harían posible que una hembra selecta pueda tener una descendencia numerosa. En los camélidos, los estudios sobre la OM y TE son escasos y con resultados variables e inconsistentes. Los métodos superovulatorios ensayados han logrado estimular la formación de 2 a 11 cuerpos lúteos por animal, logrando recuperar sólo el 50% de los embriones (Del campo et al., 1995). Estas respuestas son inferiores a las obtenidas en otras especies domésticas como, la vaca (Kacmarick et al., 1987); oveja (Evans et al., 1994) y la cabra (Rosnina et al., 1992). Por otro lado, de 65 transplantes de embriones realizados en camélidos se ha registrado el nacimiento de sólo 7 crías, a nivel mundial. Por lo antes expuesto, se requiere ampliar los estudios sobre este tema incluyendo procedimientos para estimular la superovulación. Este trabajo tiene como objetivo principal comparar el efecto de la PMSG aplicada en la fase folicular y en fase luteal inducida, sobre la superovulación. MATERIAL Y MÉTODOS Ubicación El estudio se realizó en la estación experimental de camélidos "La Raya", perteneciente al Instituto Veterinario de Investigaciones Tropicales y de Altura (IVITA) - Universidad Nacional Mayor de San Marcos, durante los meses de marzo y abril de 1996. Este centro experimental está ubicado en el distrito de Maranganí, provincia de Canchis, región Inca, Perú; a una altitud de 4 200 metros; 15º latitud sur, 71º longitud oeste. Tratamientos Se seleccionaron 15 hembras adultas, que mostraron celo ante la presencia de macho. Estas hembras fueron divididas en tres grupos iguales (n=5) y recibieron al azar los siguientes tratamientos:, Testigo (T1): día 0; inyección de 2 ml de agua destilada, vía i.m. Fase folicular (T2): día 0, inyección de 1000 UI PMSGI, vía i.m.; día 6: inyección de 1000 UI hCG 2 vía i.m. y Fase luteal inducida (T3): día -7: aplicación del dispositivo CIDRI, vía vaginal; día 0: inyección de 1000 UI PMSG, vía i.m.; día 2, retiro del dispositivo CIDR; día 6: inyección de 1000 UI de hCG, vía i.m. Mediciones realizadas Para evaluar la respuesta ovárica a los tratamientos se midieron los cambios en niveles de progesterona sanguínea y el número y tamaño de los cuerpos lúteos. Los niveles de progesterona se midieron antes y después de la aplicación de PMSG y para tal efecto se colectaron 5 ml de sangre de la vena yugular, los días 0, 6 y 16 del período experimental. Adicionalmente en el grupo T3, se colectó sangre, 7 días antes del día 0 (inmediatamente antes de la inserción del dispositivo CIDR). La sangre fue centrifugada durante 10 minutos a 1500 r.p.m. y el sobrenadante transvasado a frascos de vidrio estériles, los que permanecieron almacenados bajo temperatura de congelación (-20º C), hasta su procesamiento. La determinación de progesterona plasmática se realizó mediante la técnica de fase sólida de Radioinmunoensayo (RIA), siguiendo el procedimiento establecido por la Agencia Internacional de Energía Atómica (IAEA, 1990). El análisis se efectúo en el laboratorio de Reproducción animal de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Para el registro del número y tamaño de los cuerpos lúteos se realizó una laparatomía a través de la línea media ventral, de acuerdo al procedimiento establecido por Dietz et al. (1975); con base en los estudios sobre formación, desarrollo y regresión del cuerpo lúteo realizados por Fernández- Baca et al. (1970) y Adams et al. (1990), esta intervención se realizó a los 10 días postinyección de hCG. Análisis de los Datos Se utilizó un Diseño Completamente Aleatorio (DCA) con tres tratamientos y cinco repeticiones. El número de cuerpos lúteos fue analizado usando la prueba de Chi cuadrado (X2). El tamaño de los cuerpos lúteos y los niveles de progesterona plasmática fueron analizados mediante el Análisis de Varianza (ANVA) y para la comparación entre promedios se utilizó la prueba de tukey. Para determinar el grado de asociación entre el número de cuerpos lúteos y los niveles de progesterona plasmática se utilizó el análisis de correlación (Calzada, 1983).
1. Gonadotropina sérica de yegua gestante ("Folligon", Laboratorio Interved - Holanda). 2. Gonadotropina coriónica humana ("Pregnyl", Laboratorio OSS - Holanda). 3. Liberador Interno controlado de drogas, que contiene 0,33 g de Progesterona (EAZI BREED, Inter-Ag.- Nueva Zelandia).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN Formación de cuerpos lúteos En el Cuadro 1 se muestra el número de cuerpos lúteos formados en los diferentes tratamientos.
Nótese que ningún animal del grupo T1 ovuló; sin embargo todos los animales tratados con PMSG (Fig. 1) tuvieron una gran respuesta ovulatoria, pero en el grupo T3 (17,80±8,34 C.L.) fue significativamente mayor (P<0,05) que en el grupo T2 (8,20±2,58 C.L.). Estos resultados, tanto en T2 como en T3 son mayores a los informados por otros estudios en la alpaca (Sumar y Franco, 1974) y en la llama (Bourke et al., 1992; Bravo et al., 1995). Una mayor respuesta superovulatoria, como consecuencia de la estimulación con PMSG en fase luteal, también ha sido descrita en la vaca (Betteridge, 1977 y Bevers et al., 1993) y en la cabra (Moore, 1974; Rosnina et al., 1992 y Córdova et al., 1992); probablemente la mayor respuesta se deba a la acción de la PMSG sobre un ovario con una población numerosa de folículos pequeños retenidos por acción de la progesterona, como ha sido descrito en vacas (MacMillan and Vishwananth, 1994). Del total de cuerpos lúteos formados (n=130) en T2 y T3 el 54,6% se localizó en el ovario derecho y el 45,4% en el ovario izquierdo, diferencia que no es significativa (P<0,05). Estos resultados son similares a los descritos en la llama por Aller y Alberio et al. (1996) y Bravo et al. (1995) e indican que ambos ovarios son igualmente funcionales. En el Cuadro 2 se podrá apreciar que el diámetro de los cuerpos lúteos en T3 (13,64±2,00 mm) fue significativamente mayor (P<0,05) que en T2 (10,48±0,78 mm). Esta observación también ha sido registrada en la vaca y se explica que este mayor tamaño se debe a que los cuerpos lúteos se originan de folículos preovulatorios grandes de mayor masa celular (Mac Millan and Vishwananth, 1994). Es interesante destacar que en el grupo T3 dos animales presentaron en total 8 quistes foliculares (15 a 35 mm de diámetro); esta anormalidad también ha sido descrita en la alpaca, por Correa et al. (1994) y en la llama, por Bravo et al. (1995). Estos últimos autores registraron un 20% de animales con quistes foliculares luego de administrar PMSG, increnientando a 90% cuando la dosis de PMSG aumentó a 2000 UI.
Niveles de progesterona plasmática La variación en los niveles de progesterona plasmática registrada en los diferentes tratamientos, se encuentra resumida en el Cuadro 3.
En el dia 0 se podrá notar que los niveles de progesterona plasmática fueron basales en T1 y T2 en cambio en T3 estuvieron ligeramente incrementados. Estos resultados se encuentran dentro de lo esperado; el incremento de progesterona en el T3 se explica por el tratamiento con progestágeno (CIDR) que se empleó para inducir la fase luteal en dicho grupo. Similares respuestas, luego de utilizar CIDR, fueron descritas en la vaca (Mac Millan and Vishwananth, 1994). Por otro lado debe destacarse que tanto en T, como en T, se registró un animal con elevación de niveles de progesterona, compatible con ovulación (12,4 y 7,5 nmol/L). Es probable que estos animales ovularon espontáneamente como ha sido registrado en otros estudios en la alpaca (Fernández- Baca et al., 1970; Sumar 1993) y la llama (Adams et al., 1990). Los niveles elevados de progesterona plasmática registrados el día 6 del experimento, tanto en los animales del T2 y T3 podría ser consecuencia del efecto prolongado de la PMSG; que, además de su efecto sobre el desarrollo folicular, también tiene efecto luteinizante. Resultados similares luego de aplicar PMSG fueron registrados en la vaca (Newcomb and Rowson, 1976) y en la oveja (Jabbour and Evans, 1991). Al finalizar el experimento (día 16), los niveles elevados de progesterona plasmática registrados en los animales del T2 y T3 es consecuencia del efecto de la PMSG, que estimuló un gran desarrollo folicular múltiple, estos folículos luego de la aplicación de hCG se transformaron en muchos cuerpos lúteos. Similares observaciones, luego de aplicar PMSG, fueron reportados en la llama (Bravo et al., 1995) y en la vaca, donde la progesterona plasmática alcanzó niveles de 60 a 100 nmol/L (Spilman et al., 1973). La falta de correlación (r=-0,78; P<0,05) entre el número de cuerpos lúteos y los niveles de progesterona plasmática, registrados al finalizar el experimento, se debería a la gran variación de la respuesta ovulatoria (C.V. = 47%). Resultados similares, luego de aplicar PMSG, fueron reportados en la llama (Bravo et al, 1995). Sin embargo, en otras especies, como en la vaca (Saumandé et al., 1985) y cabra (Córdova et al., 1992), se ha registrado una correlación positiva entre ambas variables. CONCLUSIONES La aplicación de PMSG + hCG (fase folicular) y de P4 + PMSG + hCG (fase luteal inducida) resultó en una gran respuesta ovulatoria en alpacas. La respuesta ovulatoria del tratamiento en fase luteal inducida (T3) fue mayor que la registrada en fase folicular (T2), tanto en el mayor número y tamaño de los cuerpos lúteos formados. La respuesta ovulatoria en T2 y T3 fue muy variable, no existiendo correlación entre el número de cuerpos lúteos y los niveles de progesterona plasmática, medidos 10 días después de la aplicación de hCG. Se recomienda experimentar con menores dosis de PMSG, para evitar una excesiva estimulación del crecimiento Folicular y la formación de quistes foliculares, particularmente en el T3 (fase luteal inducida). AGRADECIMIENTOS Nuestro reconocimiento al CONCYTEC por su contribución al financiamiento del estudio y al personal profesional de la estación experimental "La Raya", por las facilidades brindadas para la ejecución de la parte experimental del estudio.
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