| ARTÍCULOS PRIMARIOS PERSISTENCIA DEL VIRUS DEL CÓLERA PORCINO DE BAJA VIRULENCIA EN EL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL DE LECHONES DE GRANJAS TECNIFICADAS1 Hermelinda Rivera2, Ruth Angeles3, Nieves Sandoval2 y Alberto Manchego2
Abstract The distribution of hog cholera virus (HCV) antigen in the central
nervous system (CNS) of 28 piglets with subclinical hog cholera (HQ infection from 10 well
managed farms in the Department of Lima was studied. The pigs, aged I to 20 days, included
animals with diarrhea (n=5), pneumonia (n=5) and retarded growth (n=6), as well as normal
specimens (n=7) and others which died from trampling (n=5). The presence of viral antigen
in lymphoid and/or nerve tissue was used as a criteria to identify the persistence of low
virulent strains of HCV. Tissue samples from tonsils, spleen, and regional lymph nodes
were taken to perform the immunofluorescence test (IF). The brain, including the pituitary
gland, was fixed in formalin at 10% for subsequent viral identification using the
immunoperoxidase test (IP). Viral antigen was present in tonsils, spleen, lymph nodes and
CNS in 42,9% (12/28) of the animals sampled. In the CNS, HCV antigen was detected in both
neurons and groups of neurons in different areas of the brain. All the pigs (12/12) showed
viral antigen in the cerebral cortex, 83,8% (10/12) in the cerebellum, 41,7% (5/12) in the
thalamus and hypothalamus, 33,3% (4/12), in the hyppocampus, 16,7% (2/12) in the medulla
oblongata, and the 50% (6/12) in the pituitary gland. No viral antigen was detected in the
leptomeninges or choroid plexus. The frequency of antigenic detection was found to
increase as the pigs aged. The results show that low virulent HCV is present in well
managed pig farms in the Department of Lima and the strains persist in the CNS, pituitary
gland, and lymphoid tissues. A high percentage of pigs with diarrhea and pneumonia had
viral antigen suggesting the immunosupresive role of the HCV. Resumen El objetivo del presente estudio fue determinar la persistencia del
virus del cólera porcino (VCP) en el sistema nervioso central (SNC) y tejidos linfoides
de lechones con infección subclínica de cólera porcino a través de la detección del
antígeno viral mediante la prueba de inmunofluorescencia e inmunoperoxidasa. Con este fin
se estudiaron 28 lechones de 1 a 20 días de edad procedentes de 10 granjas tecnificadas
del Valle de Lima. Al momento del muestreo los lechones fueron de apariencia normal (n=7),
otros presentaron diarrea (n=5), neumonía (n=5) crecimiento retardado (n=6) y algunos
murieron por aplastamiento (n=5). De todos los lechones se obtuvieron: tonsilas, bazo,
nódulos linfáticos regionales para realizar cortes congelados para la prueba de
inmunofluorescencia (IF). El encéfalo incluyendo la glándula pituitaria de cada uno de
los lechones fueron fijados en formalina al 10% para posterior identificación del
antígeno del VCP mediante la prueba de inmunoperoxidasa (IP). El antígeno estuvo
presente en las tonsilas, bazo y nódulos linfáticos, así como, en el SNC en el 42,9%
(12/28) de los lechones estudiados. En el SNC fue detectado en neuronas o grupos de
neuronas de las diferentes áreas del encéfalo. El 100% (12/12) de los lechones
presentaron antígeno en la corteza cerebral, en el cerebelo 83,3% (10/12), en el tálamo
e hipotálamo 41,75 (51 12), en el hipocampo 33,3% (4/12), en la medula oblonga 16,7%
(2/12) y el 50% (6/12) en la glándula pituitaria. El antígeno viral no fue detectado en
las células de la leptomeninge ni plexo coroideo de los ventrículos laterales y tercer
ventrículo. Sólo el 20% (2/10) de los lechones de 1 a 5 días de edad fueron positivos
al VCP incrementándose progresivamente la presencia del antígeno en los lechones de
mayor edad. Este incremento del antígeno viral evidencia transmisión postnatal de las
cepas de baja virulencia. La presencia de cepas de baja virulencia es corroborada al
detectarse que el 100 y 60% de los lechones diarréicos y neumónicos, así como, el 40 y
33,3% de los lechones con crecimiento retardado y muertos por aplastamiento presentaron
antígeno viral. Los resultados indican que cepas de VCP de baja virulencia persisten en
el SNC y glándula pituitaria además de los tejidos linfoides y que es prevalente en
granjas porcinas tecnificadas muestreadas en el Valle de Lima. Los lechones con problemas
diarréicos y respiratorios tuvieron antígeno del VCP evidenciando el rol inmunodepresor
del virus.
INTRODUCCIÓN El cólera porcino (CP) es una enfermedad infecciosa enzoótica en la población porcina del Perú. Es producida por el virus del cólera porcino (VCP), con orenoma ARN, relacionado antigénicamente a los virus de la Diarrea Viral Bovina (V1)VB) y Enfermedad de la Frontera (EF) que afectan al bovino y ovino, respectivamente (Nettleton et al., 1980). Además, estos tres agentes comparten similares características biológicas; como: el tropismo por las células del sistema inmune, el ocasionar infecciones interespecies, el inducir infecciones subclínicas y persistentes, etc. (Dahle, 1993; Rumenapf et al., 1993). Como todos los miembros de los pestivirus, el VCP posee muchas cepas las cuales pueden ser agrupadas en dos biotipos: citopático y no eltopático. Las cepas del biotipo citopático no son frecuentes en la naturaleza (Meyers et al., 1995). Por otro lado, las cepas del VCP existentes pueden tener diversos grados de virulencia asociados con la presentación de varias formas clínicas de la enfermedad. Las cepas virulentas son recuperadas de casos agudos mientras que cepas de moderada y baja virulencia inducen formas crónica y subclínica de la enfermedad (Terpstra, 1991; Moennig y Plagemarm, 1992). A diferencia del CP agudo que es ampliamente descrito, la forma subclínica usualmente es poco reconocida. Las cepas de baja virulencia se difunden silenciosamente y persisten en el animal. Estas cepas probablemente van surgiendo como un mecanismo de selección ante presiones inmunológicas (Wensvoort et al., 1989). La infección de los animales adultos, lechones o animales de engorde con cepas de baja virulencia es de tipo subclínico, pero el virus se replica en los tejidos linfoides del animal ocasionando inmunodepresión (Potgieter, 1995). En marranas gestantes estas cepas producen infecciones trasplacentarias y dependiendo del período de gestación pueden inducir un conjunto de fetopatías. Así mismo, por su capacidad inmunodepresora, predispone a los animales sobre todo jóvenes a infecciones secundarias del tracto respiratorio y/o digestivas (Ríos et al., 1997). Una de las consecuencias de la infección transplacentaria con cepas del VCP de baja virulencia es el nacimiento de lechones inmunotolerantes y persistentemente infectados. Estos lechones son los reservorios del virus y son incapaces de responder adecuadamente a desafíos vacunales o infecciones por virus de campo como ocurre con terneros inmunotolerantes al VDV13 (Bezek, 1995). En estos animales, el virus persiste en células de los tejidos linfoides y tejidos inmunológicamente "privilegiados", como el sistema nervioso central (SNC), glándula pituitaria (Fernández, et al., 1989) y/o gónadas (Brownlie et al., 1997) donde permanecen protegidos de los mecanismos de defensa del animal (Rojas, 1995). Estudios recientes por investigadores del IVITA de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, reportan alta incidencia de infecciones de CP de tipo subclínico en animales de granjas porcinas tecnificadas, mientras que, el CP agudo es más incidente en animales criados bajo condiciones de pobre tecnología, como en la región de la sierra y selva y animales de los parques porcinos. Este aspecto epidemiológico del CP indujo a hipotetizar que las cepas de baja virulencia son mas prevalentes en animales de granjas tecnificadas y que el virus persiste en algunos tejidos burlando los mecanismos de defensa del animal. El objetivo del presente estudio fue conocer la persistencia y distribución histológica del VCP de baja virulencia en el SNC y glándula pituitaria de lechones con infección subclínica de CP.
MATERIALES Y MÉTODOS Animales Se estudiaron 28 lechones escogidos de 1 día de nacido a 20 días de edad procedentes de 10 granjas tecnificadas del Valle de Lima. Los lechones no presentaron signos clínicos de CP agudo, pero en general fueron de pobre condición física comparado con el resto de su camada. Cinco de estos lechones presentaron cuadros diarréicos, cinco problemas respiratorios, cinco murieron por aplastamiento, seis tuvieron evidente retardo en el crecimiento y siete fueron de apariencia normal. Muestras Cada uno de los lechones, excepto los muertos por aplastamiento, fueron sacrificados en el lugar de origen o en las instalaciones de la Facultad de Medicina Veterinaria. Estos animales fueron necropsiados en busca de posibles lesiones macroscópicas y obtener muestras de tonsilas, nódulos linfáticos retrofaríngeos, bazo, cerebro o encéfalo, incluida la glándula pituitaria. De todos los tejidos colectados, sólo el cerebro y la glándula pituitaria fueron fijados en formol al 10%, para ser utilizados en la prueba de inmunoperoxidasa en caso de resultar previamente positivo al VCP mediante la prueba de inmunofluorescencia. Detección de antígeno del VCP. Prueba de inmunofluorescencia (IF). El antígeno del VCP fue detectado en cortes congelados de las muestras de tonsilas, bazo, nódulo linfático y timo, mediante la técnica de IF utilizando un conjugado policlonal (National Veterinary Services, Ames - Iowa, USA), de acuerdo al procedimiento descrito en el manual del Organismo Internacional de Epizootias (OIE, 1996). Detección de antígeno del VCP en cerebro y glándula pituitaria. Prueba de inmunoperoxidasa (IP). Diferentes porciones del cerebro y glándula pituitaria fijadas, fueron incluidas en parafina y procesadas hasta el desparafinado dentro de las 96 horas de incluidas según la técnica histológica convencional (H&E). El procedimiento de la técnica de IP fue de acuerdo a lo descrito por Fernández et al., (1989) utilizando un conjugado monoclonal contra la proteína 55 del VCP marcado con peroxidasa (Institute for Animal Science and Health, Lelystad, The Netherlands). Tamaño muestral El tamaño de la muestra fue obtenida en base al método no paramétrico de muestreo simple al azar, tomando como referencia una prevalencia del 50% de la presencia de antígeno del VCP en tejidos de animales de granjas porcinas obtenido previamente por investigadores del IVITA y un nivel de confianza del 99%.
Resultados El 42,9% (12/28) de los lechones de 1 a 20 días de edad presentaron antígeno del VCP en sus tejidos linfoides: tonsilas, bazo y nódulos linfáticos, mediante la técnica de IF. La distribución del antígeno en el SNC no fue uniforme en todos los lechones y sólo en uno se observó antígeno en todas las áreas del cerebro incluyendo glándula pituitaria (Cuadro 2).
La corteza cerebral (100%), seguida por el cerebelo (83,3%), glándula pituitaria (50%), tálamo e hipotálamo (41,7%), hipocampo (33,3%) y médula oblonga (16,7%) fueron las áreas de preferencia del VCP (Cuadro 3). El antígeno Viral fue observado en el citoplasma de escasas neuronas de la capa granular externa, capa de células piramidales y capa de células polimórficas. Las células que tapizan los ventrículos laterales no presentaron antígeno viral en ninguno de los lechones.
En el hipocampo, tálamo y médula oblonga el antígeno del VCP fue observado en neuronas individuales de la capa granular externa y capa de células piramidales, pero no se observó en las células del epitelio que recubre el tercer ventrículo. En el cerebelo, el antígeno del VCP se observó principalmente en las células de purkinge. No se observó antígeno viral en las células de la leptomeninge que recubre el cerebro. El 50% (6/12) de las muestras de glándula pituitaria presentaron antígeno viral en las células de la región de la adenohipófisis pero no en las células de la región de la neurohipófisis (Cuadro 3, Figura 1). Presentaron antígeno viral el 100 y 60% de los lechones con cuadros diarréicos y respiratorios, así como, el 40 y 33,3% de los muertos por aplastamiento y aquellos con retardo en el crecimiento respectivamente. Las muestras de los lechones con apariencia normal no presentaron antígeno del VCP (Cuadro 4).
DISCUSIÓN Estudios realizados previamente por nuestro grupo demostraron que 30 a 60% de los lechones, de 1 a 30 días de edad, procedentes de granjas porcinas tecnificadas y muertos por problemas respiratorios y/o digestivos sin signos clínicos agudos de CP, presentaban el antígeno viral (datos no publicados). Estos resultados sugirieron que las infecciones subclínicas de CP prevalentes en crianzas porcinas no tecnificadas (Ríos et al. 1997), lo eran también en algunas granjas tecnificadas del Valle de Lima. El 42,9% (12/28) de los lechones estudiados presentaron antígeno del VCP en tejidos linfoides y el SNC, esta alta prevalencia del virus en lechones de 1 a 20 días de edad sin presentar signos clínicos de la enfermedad indican, sin duda, infecciones pre y postnatales con cepas del VCP de baja virulencia y que el virus persiste en el SNC y tejidos linfoides de los animales infectados (Cuadro 1). Estudios sobre VDVB, indican que la persistencia viral es producto de infección por cepas no citopáticas durante el primer tercio de la gestación (Bolin et al., 1985; McGowan et al., 1995) y que el virus persiste en los tejidos linfoides y otros tejidos "privilegiados" como el SNC (Fernández et al., 1989). El presente estudio determinó también que el SNC es uno de los lugares de persistencia del VCP, pues el 100% de los lechones con antígeno viral en sus tejidos linfoides también presentaron antígeno en el SNC mediante la prueba de inmunoperoxidasa (Cuadro 2). Como ocurre con el VDVB, probablemente el VCP alcanza el SNC vía sanguínea durante los estadíos tempranos del desarrollo fetal, cuando la barrera hematoencefálica es más permeable; luego, en el SNC, el virus podría difundirse vía célula- célula (Fernández et al., 1989; Wohrmann et al., 1992). A diferencia, durante la infección postnatal aguda y sistémica del CP, el virus se replica activamente en las células del sistema inmune, así como en las células del endotelio de los vasos sanguíneos de todo el organismo incluyendo el SNC, causando, en este último, un proceso inflamatorio y probablemente favoreciendo su acceso al mismo. Las células del tejido nervioso tienen poca habilidad de expresar antígeno de histocompatibilidad mayor de clase I (MHC-I), evitando así reacciones inflamatorias fatales en este tejido. Ciertos virus como el de la Coriomeningitis linfocítica (VCML) y el VDVB encuentran en las neuronas sitios favorables de persistencia (Joly et al., 1991; Hewicker et al., 1992). El VCP de baja virulencia podría tener el mismo mecanismo que los virus arriba mencionados. El VCP tuvo amplia distribución en el cerebro de los lechones estudiados como lo indica la presencia de antígeno en la corteza cerebral del 100% de los lechones, seguido por el cerebelo (83,3%), glándula pituitaria (50%), tálamo e hipotálamo (41,7%), hipocampo (33,3%) y médula oblonga (16,7%) (Cuadro 3). Al parecer la alta frecuencia de infecciones prenatales, la prolongada viremia y la inmunotolerancia, que caracterizan a ciertas infecciones virales, son factores que facilitan el acceso del virus al SNC como lo indica estudios referentes al VCML en el ratón (Oldstone et al., 1982). El antígeno del VCP fue observado en el citoplasma de las neuronas de las diferentes áreas del encéfalo, pero no en las células epiteliales que recubren el tercer y cuarto ventrículo ni en las células de la leptomeninge. Joly et al. (1991), observaron que durante infecciones con el VCML de tipo agudo, la replicación viral en el cerebro estaba restringida a las células de la leptomeninge y plexo coroideo, más no en las neuronas; mientras que, durante infecciones persistentes, el antígeno fue localizado principalmente en las neuronas. La ausencia de antígeno del VCP en las leptomeninges, así como, la amplia distribución en las neuronas de las diferentes áreas del cerebro de los lechones (Cuadro 3) concuerda con lo indicado por Joly et al. (1991) y constituye un fuerte argumento a favor de que muchos de los lechones fueron infectados durante la etapa prenatal, es decir, por vía sanguínea y no por fluido cefaloraquídeo y que el SNC es también un lugar de persistencia del VCP. En el presente estudio no se realizó el examen histopatológico detallado de las muestras, pero no se observó lesiones histopatológicas en los cerebros. Fernández, et al. (1989) y Wohrmann et al. (1992) reportaron que las neuronas de terneros infectados persistentemente con el VDVB no presentaron aparentes lesiones morfológicas y aunque no fue posible conocer la integridad funcional de dichas neuronas, los autores mencionan que probablemente el periodo de vida de estas neuronas podrían ser mas cortas, y así mismo el daño funcional de las neuronas del sistema límbico podría ocasionar alteraciones en la conducta del animal. Es relevante la presencia de antígeno viral en las células epiteliales de la adenohipófisis de la glándula pituitaria del 50% de los lechones. No existe información referente al efecto del VCP en la función de estas células, pero estudios similares con el VCML se asocia la replicación viral en la adenohipófisis con disminución de la síntesis de la hormona de crecimiento, produciendo retardo en el crecimiento del ratón (Wohrmann et al., 1992). Se menciona también que algunos terneros infectados persistentemente con el VDVB tienen igualmente retardo en el crecimiento en relación a su edad. En este estudio la mayoría de los lechones muestreados tuvieron evidencias de pobre desarrollo corporal. El VCP sólo fue detectado en 2 (20%) de los lechones de 1 a 5 días de edad. Sin embargo, se observó incremento progresivo en la detección de antígeno viral en los lechones de 6, 15 y 20 días de edad, respectivamente (Cuadro 1). Esto podría explicarse por la posible reactivación y replicación viral en los tejidos y/o nuevas infecciones postnatales con cepas de baja virulencia prevalente en las granjas como lo indica On-schot (1980). Por otro lado, el 100 y 60% de los lechones con problemas diarréicos y neumónicos, respectivamente, presentaron antígeno del VCP, tal vez como consecuencia del rol inmunodepresor del virus y predispone sobre todo en lechones a infecciones secundarias (Cuadro 4). En las granjas tecnificadas la prevención del CP es mediante la inmunización sistemática con vacunas preparadas a base de la cepa china lapinizada o preparada en cultivo celular. La presencia del VCP en las granjas a pesar de inmunización de los animales sugiere la existencia de cepas capaces de escapar a los anticuerpos neutralizantes de origen vacunal o inducidos por virus de campo como está ocurriendo con el pestivirus bovino (Paton et al., 1992; Ridpath el al., 1994).
CONCLUSIONES El VCP de baja virulencia es prevalente en granjas porcinas tecnificadas del Valle de Lima. Estas cepas inducen infecciones subclínicas y persisten en los tejidos linfoides y el SNC incluyendo la glándula pituitaria. Un 20% aproximadamente de los lechones de 1 a 20 días de edad de pobre condición física nacen persistentemente infectados con el VCP. El porcentaje de infección subclínica se incrementa a lo largo de la vida del animal. Altos porcentajes de lechones con problemas diarréicos y respiratorios
procedentes de granjas tecnificadas tienen antígeno del VCP en sus tejidos. AGRADECIMIENTOS Los autores agradecen a los porcicultores que colaboraron donando los
lechones para el estudio. Igualmente al Dr. Raúl Rosadio por sus valiosas sugerencias y
comentarios. LITERATURA CITADA 1. Bezek, M.D. 1995. Bovine diarrhea virus infection: individual and herd diagnosis. Comp. Continuing Education. 17(8): 57-63. 2. Bolin, S.R., A.W. McClurkin y M.F. Coria. 1985. Frequency of persistent bovine viral diarrhea virus infection in selected cattle herds. Am. J. Vet. Res. 46: 2385-2387. 3. Brownlie, J., P.J. Booth, D.A. Stevens y M.E. Collins. 1997. Expression of noncytopathogenic bovine viral diarrhea virus (BVDV) in oocytes and follicles of persistently infected cattle. Vet. Rec. 141: 335-337. 4. Dahle, J., G. Schagemann, V. Moennig y B. Liess. 1993. Clinical, virological and serological findings after intranasal inoculation of pigs. J. Vet. Med. 40: 46-54. 5. Fernández, A., M. Heweker, G. Trautwein, J. Pohlenz y B. Liess. 1989. Viral antigen distribution in the central nervous system of cattle persistently intfected with bovine viral diarrhea virus. Vet Pathol. 26: 26-32. 6. Hewiker-Trautwein, M., G. Trautwein, V. Moenning y B. Liess. 1992. Infection of voine fetal brain cell culture with cytopathogenic and non-cytopathogenic bovine viral diarrhea virus. Vet. Microbiol. 33: 239-248. 7. Joly, E., L. Mucke y M.B.A. Oldstone. 1991. Viral persistence in neuronas explained by lack of major histocompatibility class I expresion. Science. 253: 1283-1285. 8. McGowan, M.R y PD. Kirkland. 1995. Early reproductive loss due to bovine pestivirus infection. Br. Vet. J. 151: 263-270. 9. Meyers, G. y H-J Thiel. 1995. Cytopathogenicity of clssical swine fever caused by defective interfering particles. J. Virol. 69(6): 3683-3689. 10. Moennig, V. Y P.G.W. Plagemann. 1992. The pestivirus. Adv Virus Res. 41: 53-93. 11. Nettleton, P.F., J.A. Herring y W. Corrigall. 1980. Isolation of bovine virus diarrhea virus from a Scottish red deer. Vet. Rec. 107: 425-426. 12. Oldstone, M.B.A., N.Y. Sinha, P. Blount, A. Tshon, M. Rodríguez, R. Von Wedely P W. Lampert. 1982. Virus induced alterations in homeostasis: alterations in differentiated functions of infected cells in vivo. Science. 218: 1125-1127. 13. Paton, D.J., J.P. Lowings y A.D.T Barrett. 1992. Epitope mapping of the gp53 envelope protein of bovine viral diarrhea virus. Virol. 190: 763-772. 14. Potgieter, L.N. 1995. Immunolgy of bovine viral diarrhea. Vet. Clin. North Am.: Food Animal Practice. 11(3): 501-520. 15. Rumenapf, T., G. Unger, J.H. Strauss y H-J Thiel. 1993. Processing of the envelope glycoproteins of pestivirus. J. Virol. 67(6): 3288-3294. 16. Ridpath, J., S. Bolin y E. Dubovi. Segregation of bovine viral diarrhea virus genotypes. J. Virol. 205: 66-74. 17. Ríos, M., H. Rivera, N. Sandoval, A Manchego, C. Camacho y R. Rosadio. 1997. Asociación del virus del cólera porcino con mortalidad neonatal en crianza porcina no tecnificada. Rev. Inv. Pec. IVITA (Perú); 8(1): 10-18. 18. Rojas, M.W. 1995. Inmunología. Corporación para investigaciones biológicas. 10.ª ed. Colombia. p. 5657, 216-219, 336-343. 19. Terpstra, C. 1991. Hog cholera: An update of present knowledge. Br. Vet. J. 147: 397-400. 20. Van Oirschot, J. 1980. Persistent and inaparent infections with swine fever virus of low virulence their effects on the immune system. Drukkerij Elinwijk B V-Utrech. The Netherlands. 67-82. 21. Wensvoort, G., C. Terpstra, E.R De Klujver, C. Kragten y J.C. Warnaar. 1989. Antigenic differentiation of pestivirus strains with monoclonal antibodies against hog cholera virus. Vet. Microbiol. 21: 9-20. 22. Wohrmann, T., M. Hewiker-Trautwein, A. Fernández, V Moennig, B. Liess y G. Trautwein. 1992. Distribution of bovine virus diarrhea viral antigens in the central nevous system of cattle with various congenital manifestations. J. Vet. Med. 39: 599-609.
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