Hermelinda Riverab, Alberto Manchego, Nieves Sandoval, Amelia Vargas, Abelardo Araujo, Armando Gonzales, Raúl Rosadio.
ABSTRACT The rol of infectious agents on seven (7) dairy farms in Lima Valley was investigated by, serology and microbiological examinations or aborted fetuses. Sera samples included 52 (52/110) cows with history of abortions and 44 aborted fetuses. The prevalence of antibodies to BVD and HBV-1 viruses infectious were 53% and 26% respectivily. The prevalence of antibody to BVD was statistical y significant (P<0.05) in cows with history of abortion when compared with those without history. Testing of sera against a 5 different Leptospiral serovars, 4% reacted against two serovars (L. bratislava and L. icterohemorrhagiae) but none to Brucella abortus. In only 20%, (9/44) of aborted fetuses the causative agent was identified. Seven of those cases had infectious origen and two congenital malformations. The serological survey evidenced BVD virus as important pathogen associated with abortions in Lima Valley. Key words: bovine, calves, virosis, BVID, HBV-1,
RESUMEN Con la finalidad de identificar las posibles causas de origen infeccioso del aborto bovino, se realizó un estudio de seroprevalencia en 110 vacas de 7 hatos lecheros del valle de Lima. En el muestreo se incluyó 52 animales con historia de aborto as¡ como 44 fetos abortados. Los virus de la diarrea viral bovina (BVD) y Herpes bovino-1 (HBV-1) resultan prevalentes en los hatos estudiados con 53% y 26% respectivamente. La prevalencia de anticuerpos contra BVD fue significativamente mayor (P<0.005) en vacas con antecedentes de aborto comparadas con las que no tuvieron abortos; similar comparación para HBV-1 no fue estadísticamente significativa. Además encontró 4% de reactores a dos (2) de los 5 serovares de Leptospira y ningún reactor a Brucella abortus en los hatos estudiados. En solo 20% de los fetos estudiados (9/44) se determinó la causa del aborto, de las cuales 7 tuvieron origen infeccioso y 2 por malformaciones congénitas. El estudio serológico permite concluir que el virus BVD es un importante patógeno en la presentación de abortos en los animales de los hatos estudiados del Valle de Lima y es necesario continuar con el examen sistemático de los fetos abortados y ampliar el estudio a otras cuencas lecheras. Palabras clave: bovino, ternero, virosis, BVD, HBV-1.
El comité para la Nomenclatura en Reproducción Bovina1, define al aborto como la pérdida del producto de la concepción durante el período comprendido entre los 42 días, hasta ante, de los 260 días de la gestación. Los abortos constituyen un factor limitante del desarrollo ganadero y considerables pérdidas económicas2 . Las causas que ocasionan el aborto son múltiples y varían desde el origen genético (mal formaciones congénitas, aberraciones cromosómicas, etc.), infeccioso (protozoos, hongos, bacterias, virus) hasta el ambiental (deficiencias nutricionales, planta, tóxicas, temperatura elevada, mal manejo, estrés, etc.). Cualquiera de estas causas pueden interferir con el desarrollo del embrión o feto en forma directa o indirecta3,4,5 La esperada ocurrencia de abortos en un hato de ganado lechero no debe exceder el 10% anual6,7. Sí el número de abortos sobrepasa este porcentaje, es necesario la identificación de la causa o causas con ayuda del laboratorio de diagnóstico para adoptar medidas adecuadas. El diagnóstico de la causa del aborto bovino no es tarea fácil, debido a la múltiple etiología y características propias del proceso patológico. Solamente en 30-40% de los abortos a nivel mundial es posible establecer el diagnóstico4,8,9. A pesar de los continuos esfuerzos de los países como Australia, USA y Canadá para definir las posibles causas del aborto, las pérdidas fetales tienden a incrementarse en la última década y al parecer por causas de naturaleza no infecciosa debido al estrés a que están sometidos los animales productores de leche10,11. En el Perú, igualmente la ocurrencia de aborto en bovinos de leche en el Valle de Lima en los últimos tiempos superan la frecuencia esperada en muchos de los hatos. Se desconocen las causales de este incremento pero se cree que con la importación de animales sin el adecuado control sanitario, se ha introducido al país microorganismos como el virus de la enfermedad de las mucosas (BVD) que habría encontrado una población bovina susceptible. Otro aspecto importante que podría estar contribuyendo a la presentación del aborto, es el aumento inusual de la temperatura ambiental en la Costa, como ocurrió durante el verano de 1992, así como también la crisis económica que afecta fuertemente al sector pecuario. El objetivo del presente estudio fue identificar las causas de origen infeccioso del aborto bovino con énfasis en los microorganismos conocidos por sus efectos abortigénicos y de prevalencia mundial incluyendo el Perú8,12 y que sirva de base para iniciar estudios que involucren el aspecto infeccioso y no infeccioso de modo integral y empleando tecnologías modernas que sin duda incrementarán la especificidad diagnóstica.
MATERIAL Y METODOS
1. ESTUDIO DE SEROPREVALENCIA. Microorganismos. Dado que las bacterias como la Leptospira y Brucella y los virus Herpes bovino-1 (IBR) y Diarrea Viral Bovina (BVD) son conocidos por sus efectos abortigénicos y prevalentes en la población bovina del Valle de Lima (Rivera H., datos no publicados), se consideró estudiar el rol de estos microorganismos en la presentación de los abortos.
Animales. En 7 hatos sin historia previa de vacunación contra BVD, HBV-1 y Leptospira se colectaron 110 muestras de suero colectados al azar del 10% de las vacas en producción (Cuadro 1), representando el tamaño muestral requerido para comprobar el menor intervalo de confianza en base a la prevalencia límite del 25% para el virus Herpes bovino-1 (Rivera H. et al, dato no publicado) y con un nivel de confianza del 95%. De las 110 muestras, 52 correspondieron a vacas con historia de abortos y 58 a vacas sin historia de abortos. Para determinar la significancia entre el aborto y la presencia de anticuerpos contra los microorganismo en estudio se empleó el método del Chi Cuadrado.
Cultivos celulares. Se utilizaron como sistema indicador en la prueba de Virus-Neutralización, cultivos celulares secundarios de cornete nasal de feto bovino libre de virus BVD endógeno . Los cultivos celulares fueron preparados por el método de explante13 empleando el medio de cultivo L-15 (Leibovitz) y ME M (Minimum essencial medium, "Sigma") en una proporción de 50:50, suplementado con 10% de suero fetal bovino, libre de anticuerpos contra BVD y BHV-1 ("Sigma") y antibióticos.
Pruebas serológicas Para la detección de anticuerpos contra BVD, HBV-1 (IBR) se empleó la conocida prueba de Virus-Neutralización. La detección de anticuerpos contra cinco (5) serovares de Leptospira fue realizado mediante la prueba de microaglutinación empleando antígenos vivos de: L. pomona, L. hardjo, L. icterohemorrhagiae, L. bratislava y L. canicola procedentes del Centro Panamericano de Zoonosis-Argentina. Los anticuerpos contra Brucella fueron detectados mediante la prueba de Bang empleando el antígeno a base de Brucella abortus preparado por el Instituto Nacional de Salud.
2. ESTUDIO SISTEMATICO DE LOS FETOS BOVINOS ABORTADOS. Entre Enero 1991 y Marzo de 1993, fueron remitidos al Laboratorio 44 fetos bovinos abortados. Los fetos fueron necropsiados para observar lesiones macroscópicas y obtener los diferentes tejidos (riñón, pulmón, bazo) y fluidos (abdominal o toráxico) para el análisis virológico, bacteriológico e histopatológico, según el estado de conservación de los mismos. De tales muestras, se intentó el aislamiento de los virus BVD y HBV-1 así como la Leptospira. Las muestras de fluido toráxico fue utilizada para la detección de anticuerpos contra BVD, HBV-1 y Leptospira. La detección de antígenos de BVD y HBV-1 en las muestras de los tejidos se realizó mediante la prueba de inmunofluorescencia (IF) empleando conjugados policlonales y monoclonales producidos comercialmente (NVS-Ames-Iowa).
RESULTADOS Los resultados del estudio serológico de las 110 muestras, se muestran en el Cuadro 2; habiéndose encontrado una prevalencia de 53 y 26% para los virus BVD y HBV-1 respectivamente. De 52 vacas con antecedentes de abortos, 41 (79%) tuvieron anticuerpos contra BVD y 14 (27%) contra el virus HBV-1 (Cuadro 3), y de 58 vacas sin historia de abortos, 20 (34%) tuvieron anticuerpos contra BVD y 19 (33%) contra HBV-1 (Cuadro 4). El Chi Cuadrado indicó que la prevalencia de anticuerpos contra BVD fue significantemente mayor (P<0.005) en vacas con historia de abortos comparadas con aquellas sin antecedentes de abortos. La comparación similar referente al virus HBV-1 no fue estadísticamente significativo (P>0.005). La distribución de los títulos de anticuerpos contra BVD y BHV-1 en las vacas con y sin historia de abortos se encuentran entre los rangos de 1:2 a mayores a 1:256; sin embargo, el número de vacas con títulos mayores a 1:256 fue mayor en el grupo de vacas con historia de abortos, aunque estadísticamente no tuvo significancia (Cuadro 5). De las 110 muestras, 4 (4 %) fueron reactores a Leptospira (3 a L. icterohemorragica y 1 a L. bratislava) con títulos no mayor a 1:100. Los animales reactores correspondieron a 2 de los 7 hatos (C y G) estudiados y no hubo relación con la presentación de aborto en dichos animales. En ambos grupos de animales no se encontraron vacas reactores a Brucella abortus. De los fetos estudiados, el 90% (presentaron autolisis fetal. No mostraron lesiones macróscopicas aparentes en los diferentes órganos excepto uno de ellos que presentó lesiones circulares blanquecinas en la piel. En la mayoría de los casos se observó abundante fluido de color rojo oscuro en la cavidad abdominal y cápsula renal y el resto no mostró cambios significantes, En 9 (20%) de los 44 fetos abortados fue posible establecer la causa del aborto, siendo 7 de ellos abortados por microorganismos infecciosos y 2 por malformaciones congénitas (Cuadro 6). En 35 (80%) de los fetos no fue posible determinar la causa del aborto. En los tejidos de 4 de los 7 fetos se observó antígeno de BVD mediante la prueba de inmunofluorescencia empleando anticuerpos monoclonales contra BVD, y en otro feto se encontró antígeno del virus de Parainfluenza 3 bovina (PI-3). No se observaron antígenos de HBV-1 (Cuadro 6). El examen serológico del fluido toráxico de los fetos mayores a 5 meses fueron negativos a BVD pero una muestra (feto de 7 meses) tuvo anticuerpos contra HBV-1 con un título de 1:16 (virus-neutralización), indicando que hubo una infección prenatal. La madre de este feto abortado tuvo un título de anticuerpos contra HBV-1 mayor a 1:256 al momento del aborto, y un título de 1:16 contra BVD.
Al examen directo de las muestras de contenido estomacal de algunos fetos en el microscopio de campo oscuro no se observaron bacterias parecidas a Leptospiras sp. El cultivo bacteriológico de las muestras de tejidos no mostraron el desarrollo de bacterias patógenas, en algunos casos hubo desarrollo de escasas colonias de E. col¡. Del cultivo de pulmón y contenido estomacal de uno de los fetos de 4 meses de edad, con lesiones circulares de la piel se aisló Aspergillus fumigatus (Cuadro 6). Los intentos de aislamientos de los virus BVD, HBV-1 y Leptospira fueron negativos. En dos de los fetos (2/44) se observaron lesiones de malformación congénita caracterizadas en uno de ellos por fiacidez de la musculatura cardiaca con dilatación de las arterias y venas así como congestión pulmonar y hepática, y el otro feto presentó hidroencefália y lordosis moderada. Otro feto de 6-7 meses de edad presentó hepatomegália y de aspecto cirrótico. Las lesiones histopatológicas del hígado de este último feto indicaron principalmente degeneración de los hepatocitos, congestión de los vasos sanguíneos con inflamación granulomatosa en los espacios periportales, posiblemente de origen tóxico.
En general los resultados histopatológicos no fueron de mucha ayuda para el diagnóstico porque los fetos no siempre estuvieron bien preservados, v la placenta que es uno de los tejidos importantes para el estudio no fue remitido en ningún caso para el examen.
DISCUSION Basados en estudios previos de seroprevalencia de los principales microorganismos con habilidades abortigénicas, se consideró oportuno tratar de correlacionar la presencia de anticuerpos contra estos agentes con la ocurrencia de abortos en 2 grupos de animales (Cuadros 1 y 2) de cada uno de los 7 hatos, como antecedente al propósito principal de estudiar a los fetos abortados.
La baja prevalencia (4%) y los títulos de anticuerpos inferiores a 1:100 indican una previa exposición a Leptospira pero aparentemente no asociada a la presentación de los abortos. En un estudio similar Norton11 encontraron una prevalencia de L. harjo mayores de 42%, pero los exámenes de campo oscuro y los cultivos fueron siempre negativos; asimismo, las observaciones de Leptospira en cortes histopatológicos coloreados con Levaditi fue muy escasa. Jerrett14 notifican que a pesar de la alta prevalencia de Leptospira, los casos de abortos fueron poco frecuentes en el sur-este de Australia. Sin embargo, en algunos hatos (no considerados en esta publicación) con frecuencias de abortos superiores al 20%, se encontró un mayor número de animales con anticuerpos contra uno o más serovares de Leptospira (datos no publicados), por lo que se considera necesario continuar con el estudio sistemático tanto del feto como de la madre en busca de Leptospira a fin de definir el rol en la presentación del aborto bovino en el país.
El análisis estadístico de los resultados de prevalencia de BVD fue significativamente mayor (P<0.005) en el grupo de vacas con historia de abortos frente al grupo de vacas sin historia de abortos (Cuadros 3 y 4). Así mismo, en el grupo con antecedentes de abortos se encontró un número mayor de vacas con títulos de anticuerpos contra BVD mayores a 1:256, sugiriendo que los abortos fueron debidos al virus BVD (Cuadro 5). Dado que la serología por sí sola no decide el diagnóstico del aborto, generalmente se recomienda la necesidad de correlacionar el resultado serológico con el incremento del número de abortos, nacimientos de terneros o abortos de fetos con defectos congénitos, nacimientos de terneros débiles, vacas que repiten el celo después de haber sido diagnosticadas preñadas8,9. Estos acontecimientos son fuertes indicadores de una infección activa por el virus del BVD y generalmente utilizadas como antecedentes por los clínicos de campo. El virus HBV-1 es otro de los virus capases de ocasionar aborto sobre todo en el ganado carnicero en donde puede producir brotes de hasta de 25% de abortos15,8. El virus también es conocido como agente productor del complejo respiratorio bovino y las vacas pueden abortar debido a una secuela del problema respiratorio11,16,17. En el Perú, se ha demostrado que este virus juega un rol importante en la presentación del complejo respiratorio en terneros (Rivera H, datos no publicados) pero su importancia como agente productor de abortos al parecer es menor de lo esperado. El análisis estadístico del presente estudio evidencia esta baja correlación; pero no se debe descartar la posibilidad de observar abortos en forma esporádica, como secuela del leve proceso respiratorio. A pesar que la presentación clínica típica de IBR no fue observada en las vacas adultas, pero fueron evidentes problemas respiratorios en terneros de algunos de estos hatos. El examen sistemático de los fetos abortados permitió arribar al diagnóstico en 20% (9/44), porcentaje inferior a lo registrado a nivel mundial (30-40%). Sin embargo, es significante la detección de antígeno del virus del BVD en tejidos de 4 de los fetos procedentes de diferentes hatos. De acuerdo a la característica biológica del virus BVD, la observación del antígeno viral en los tejidos de un feto bovino abortado no indica necesariamente que fue la causa del aborto. Sin embargo, factores como: alta prevalencia (53%) en vacas sin vacunar, la significancia estadística en vacas con historia de abortos frente a las sin antecedentes de abortos y al incremento del porcentaje de vacas que retornan al celo posterior al diagnóstico de preñez (Elías Flores, Comunicación personal) en el Valle de Lima, sustentan que el virus BVD es causa de abortos y tal vez, origen de trastornos reproductivos en el ganado lechero de Lima. Por otro lado la detección de anticuerpos contra el virus HBV-1 en el fluido torácico de uno de los fetos indicaría una infección vía placentaria. En este último caso no se observó antígeno de HBV-1 en tejidos mediante la prueba IF, tampoco se pudo aislar el virus. La falla en la detección y aislamiento viral probablemente es debido a la capacidad inmunológica del feto (7 meses) para defenderse a la infección desarrollando anticuerpos neutralizantes y controlando la infección. Observaciones similares han sido descritas por Lucas18, quienes tampoco observaron antígeno de HBV1, pero sí aislaron el virus. Experimentalmente ha sido demostrado que el virus Para influenza 3 bovino (PI-3), miembro importante del complejo respiratorio bovino, puede causar aborto16 pero en condiciones naturales el aborto puede ocurrir como consecuencia del estado febril que acompaña al proceso respiratorio y es posible que el virus pase al feto durante la viremia y seria la explicación del hallazgo del antígeno de PI-3 en uno de los fetos estudiados. Los hongos también pueden ser causa importante del aborto bovino, cuando el ganado es alimentado con granos conservados inadecuadamente, como fue el caso de un hato en donde se presentaron varios abortos con fetos de 2-4 meses de edad, uno de ellos fue remitido al laboratorio observándose lesiones tipo micóticas en la piel, de donde se aisló Aspergillus fumigatus (Cuadro 6). De los fetos que fue posible realizar el cultivo bacteriológico no se aislaron bacterias patógenas excepto escasas colonias de E. col¡ que al parecer es producto de contaminación posterior. Las bacterias Salmonella, E. col¡, Staphylococcus entre otras, son a veces asociadas con abortos en el ganado bovino y con frecuencia se aislaban del contenido estomacal y otros tejidos, pero en estos casos, la interpretación del resultado debe ser cuidadoso considerando: la cantidad y pureza del microorganismo aislado, lesiones presentes en el tejido fetal, historia del hato, etc., que provean evidencias razonables que soporten el diagnóstico presuntivo8. Obviamente la adopción de cualquier medida de control del aborto bovino, requiere la identificación de la causa o causas que lo producen; desafortunadamente, la frecuencia de acierto en el diagnóstico no es más del 30-40%3,8. Las razones de este reducido éxito son varias pudiendo citarse: el envió inadecuado de muestras al laboratorio, los fetos a menudo son retenidos en el útero horas a días después de la muerte y la autólisis enmascara cualquier lesión que pudiera ser útil para el diagnóstico, los factores tóxicos y genéticos no son detectados en el feto, el tiempo que transcurre desde el momento del aborto hasta la recepción del material en el laboratorio, este último es crítico para la viabilidad de los microorganismos, falta de educación sanitaria. Hay mucho por aprender acerca del diagnóstico de las causas del aborto no solo en la especie bovina sino también en los camélidos, ovinos, caprinos y porcinos que sin duda no están exentos de este problema.
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