Revista Peruana de Biología     Vol. 7   •    Nº 2     •      2000

 

PRODUCCIÓN DE ENZIMAS EXTRACELLARES POR BACTERIAS AISLADAS DE INVERTEBRADOS MARINOS

Jorge León, Fabiola Pellón, Verónica Unda, Janeth David,
César Anaya y Victoria Mendoza *

 


ABSTRACT

In order to select marine bacteria with the ability to produce extracellular enzymes (EEC), samples from Argopecten purpuratus and Crassostrea gigas in cultivation as well as from other interticlal and benthic invertebrates were analyzed. The selection of producer EEC strains was carried out in Marine Agar (MA) with addition of the relevant substratum (starch, casein, tween-80, lecithine, DNA and gelatine). The EEC producer strains evaluation was carried out on 102 isolates.

The results show that bacteria associated toA. purpuratusand C. gigashave the best multienzymatic activities; however, Semimytilus algosus, Tetrapigus niger and Thais chocolata are also important sources of bacteria producers of EEC. The qualitative multienzymatic activity in MA (clear or opaque zones around the colonies in mm of diameter) varied from 6 to > 16 mm. The frequency of multienzymatic production was caseinase 62,74%, tween-esterase 57,84%, amylase 52,94%, gelatinase 38,23%, DNAse 33,3%, agarase 5,43% and lecithinase 90,0%. The results suggest the possibility of using native strains for biotechnological purposes.

Key words: extracellular enzymes, metabolites, marine bacteria, invertebrate, marine biotechnology.

 


 

En ambientes marinos, la búsqueda y aislamiento de cepas de bacterias nativas productoras de substancias bioactivas se ha realizado a partir de diversas muestras (Martín, 1976; Martín y Bianchi, 1980; Prieur, 1989). Entre estas substancias destacan las "Enzimas Extracelulares" (EEC), cuyo desarrollo en el sector industrial se ha producido en forma explosiva en los últimos años (Chandrasekaran, 1997). Las enzimas microbianas procedentes de microorganismos de ambientes acuáticos incluyen amilasas, glucamilasas, glucosaisomerasas, proteasas, pectinasas (Stanley & Stanley, 1986) y otros como agarasas, quitinasas, alginasas, lipasas, Dnasas y esterasas (Fenical y Jensen, 1993). La mayoría de estas enzimas tienen aplicación biotecnológica, especialmente en la industria alimentaria (Stanley y Stanley, 1986).

Las enzimas proteolíticas y lipolíticas actúan sobre diversos substratos naturales y sintéticos y son principalmente utilizadas en la industria como detergentes, en tanto las amilasas, gelatinasas, caseinasas y agarasas se emplean como aditivos en la industria alimentaria (Barzana y López-Munguía, 1995).

El presente estudio tiene como objetivo central seleccionar cepas nativas de bacterias marinas hiperproductoras de EEC. Para ello, muestras de invertebrados intermareales y bentónicos fueron recolectadas en la Bahía de Ancón ("San Francisco" y "Punta LA CRUZ", respectivamente). Asimismo, muestras de Argopecten purpuratus "concha de abanico" y Crassostrea gigas "ostra" fueron recolectadas en las zonas de cultivo "El Carbón" y "La Tiza" (Bahía de Pucusana) y en la Isla San Lorenzo (Callao). Los organismos intermareales y bentónicos fueron obtenidos mediante recolección directa y por buceo respectivamente, y las muestras de Argopecten purpuratus y Crassostrea gigas fueron tomadas directamente de las "linternas de cultivo". Las muestras fueron procesadas según la metodología descrita por León (1996), utilizando el Agar Marino de ZoBell (AM) como medio de aislamiento bacteriano.

Para la selección de cepas productoras de EEC, se utilizó el método de formación de "macrocolonias". El AM sirvió como medio base al cual se incorporaron los substratos correspondientes (almidón, caseína, tween-80, lecitina y DNA) en una concentración de 1% (p/p). La actividad frente a la gelatina fue evaluada en el medio AM con adición de gelatina microbiológica al 12% (p/p). Las cepas cultivadas fueron Incubadas a 22 oC hasta por 10 días. La actividad enzimática de las cepas sobre los substratos en prueba fue determinada por la presencia y tamaño de las zonas de hidrólisis alrededor de las macrocolonias. Asimismo, 6 cepas aisladas de Argopecten purpuratits y 4 de Crassostrea gigas en cultivos fueron identificadas a nivel de género utilizando esquemas de identificación para bacterias marinas según Oliver (1982) y Sawabe et al. (1995).

Se aislaron un total de 102 cepas de bacterias (45 provienen de organismos intermareales, 47 de bentónicos, 6 de Argopecten purpuratus y 4 de Crassostrea gigas), las cuales fueron evaluadas por su capacidad de producir substancias con actividad multienzimática (Tabla 1, 2 y 3). La acción enzimática de las cepas en estudio sobre diversos substratos muestra resultados homogéneos. Sin embargo, cabe resaltar que las cepas provenientes de Semimytilus algosus "chorito negro" (cepa Chol-AI) y de Tetrapigus niger "erizo negro" (cepas Eri5-AI y Eri7-AI) cuentan con mejor actividad multienzimática, llegando inclusive a actuar frente a 5 substratos diferentes, siendo las más importantes la actividad amilolítica (amilasa), proteolítica (caseinasa) y lipolítica (tween esterasa) (Tabla 1). Las cepas provenientes de A rgopecten purpuratus de vida libre (cepa Cab3-AII), Tetrapigits niger "erizo negro" (cepas Er12-AII, Er13-AII) y Thais chocolata "caracol" (cepa Cch1-AII) mostraron igualmente mayor actividad multienzimática (Tabla 2). Resultados similares fueron obtenidos por Harris (1993), quien analizó la actividad multienzimática de bacterias aisladas del tracto intestinal de varias especies de invertebrados acuáticos, demostrando que una gran proporción de crustáceos y moluscos estudiados eran portadores de bacterias con actividades enzimáticas principalmente proteolíticas, lipolíticas y quitinolíticas; en cambio, las bacterias celulolíticas eran escasas. Relacionado a este último, queda por investigar la relación de ciertos miembros de la microflora intestinal capaces de producir exoenzimas con los requerimientos alimenticios de especies de invertebrados herbívoros y detritíboros. En el presente estudio también se reporta la actividad agarolítica de ciertas cepas; sin embargo, fueron pocas las bacterias aisladas con capacidad de producir agarasas. Al respecto, León et al. (1998) en aislamientos previos lograron obtener cepas hiperproductoras de agarasas a partir de otros invertebrados intermareales.


Tabla 1

Tabla 2

La Tabla 3 y Figuras 1, 2, 3, 4, 5 y 6 muestran los resultados de la actividad multienzimática de EEC de 10 cepas provenientes de Argopecten purpuratus y Crassostrea gigas en cultivos (Pellón, 2000).
Cabe resaltar que la totalidad de las cepas mostraron actividades más contundentes comparadas con aquellas producidas por cepas provenientes de organismos intermareales y bentónicos. La identificación preliminar de estas cepas determinó a Vibrio como el género que predomina. Otras cepas identificadas pertenecen a los géneros Flavobacterium, Moraxella y Flexibacter.

Tabla 3. Actividad multienzimática de 10 bacterias marinas con identificación preliminar y aisladas de Argopecten purpuratus "concha de abanico" y Crassostrea gigas "ostra" en cultivo

CEPAS Gelatina Caseína Almidón DNA Tween-80 Lecitina GÉNERO
CA.5* ++ +++ ++ ++ ++ + No identificados
CA.6 - ++ +++ +++ + + Vibrio
CA.8 + + ++ + - - Flexibacter
CA.21 ++ ++ + ++ ++ ++ Vibrio
CA.25 ++ +++ ++ - +++ ++ Moraxella
CA.34 - ++ + ++ ++ + Vibrio
OS.13** +++ +++ ++ ++ ++ ++ Vibrio
OS.16 ++ +++ + ++ +++ ++ Flavobacterium
OS.26 ++ +++ ++ + ++ ++ Flavobacterium
OS.49 ++ + - - ++ + Vibrio
* Cepas CA proceden de Argopecten purpuratus "concha de abanico"
** Cepas OS prodeden de Crassostrea gigas "ostra".
- : sin actividad
+:< 8mm
++: 8-16mm
+++: >16mm

 

Tabla 4. Frecuencia de bacterias marinas con actividad exoenzimática expresada en porcentaje

SUBSTRATO EEC Cepas con actividad enzimáticas
N°/total %
CASEÍNA caseinasa 64/102 62,74
TWEEN-80 Twee-esterasa 59/102 57,84
ALMIDÓN Amilasa 54/102 52,94
GELATINA Gelatinasa 39/102 38,23
DNA DNAsa 34/102 33,33
AGAR Agarasa 5/92 5,43
LECITINA Lecitinasa 9/10 90,0



Figuras 1-6


Es importante resaltar que de un total de 102 aislados (100%) previamente seleccionados por tener alguna actividad enzimática extracelular, la frecuencia de cepas que presentan actividades multienzimáticas es como sigue: caseinasa 62,74, tween-esterasa 57,84%, amilasa 52,94%, gelatinasa 38,23% y DNAsa 33,3%. La producción de agarasa (5,43%) y lecitinasa (90%) fue evaluada en 92 y 10 cepas respectivamente (Tabla 4). Al respecto, Marty y Martín (1992), estudiando bacterias marinas asociadas a organismos marinos (cepas epibiontas), aislaron numerosas cepas nativas productoras de exoenzimas. Por su parte, León (1996) aisló cepas de Pseudomonas, Vibrio, Alteromonas, Flavobacterium, Cytophaga y Micrococcus provenientes del neuston marino que, además de mostrar actividades inhibitorias de amplio espectro frente a bacterias ictiopatógenas, también evidenciaron capacidad de producir EEC. En este estudio, nuestros resultados muestran la presencia de numerosas cepas nativas productoras de EEC con actividad multienzimática asociadas a invertebrados poco explorados. Estas propiedades de las bacterias marinas podrían ser aprovechadas para un posible o eventual explotación biotecnológica. Estudios subsiguientes determinarán las potencialidades microbianas de origen marino de producción de otras enzimas de interés industrial (quitinasas, celulasas, pronasas, alginasas y otras).

AGRADECIMIENTOS

Al Consejo Superior de Investigaciones de la UNMSM, por su financiamiento económico a través del Proyecto 91001171-1999. Así mismo, al equipo de Investigaciones Marinas Grupo DePSEA (Laboratorio de Ecología Marina, Facultad de Ciencias Biológicas, UNMSM) a cargo del Dr. Juan Tarazona B. por su valiosa colaboración en la obtención de muestras bentónicas.


Ver referencias

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· Microbiología Ambiental y Biotecnología, Facultad de Ciencias Biológicas-Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Perú.
E-mail: D190026@unmsm.edu.pe

 


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