Estandarización de la prueba de Ensayo Inmunoenzimático para la detección de anticuerpos IgG en sueros de humanos para el virus Phlebotomus fever. Cruz Malpica, Cristhopher Donat's


 

PARTE EXPERIMENTAL



IV 1. ESTANDARIZACIÓN DEL ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO ELISA IgG INDIRECTA.


IV 1.1. PREPARACIÓN DE ANTÍGENO LISADO


IV 1.1.1 MATERIALES Y EQUIPOS

1. Suero OBS 6528 ( muestra de brote epidémico).

2. Ratones lactantes de 1 o 2 días de nacidos (cepa CFW-Charles River).

3. Cultivo celular de línea VERO E-6 (riñón de mono verde africano Cercopithecus aethiops).

4. Medio de crecimiento: E-MEM (calidad biológica) con 10% de suero bovino fetal (Sigma).

5. Medio de mantenimiento: E-MEM (calidad biológica) con 2% de suero bovino fetal (Sigma).

6. Solución de Borato salino pH 9.0.

7. Guantes de Látex.

8. Frascos para cultivo celular de 250ml.

9. Pipetas serológicas de 1, 5, 10, 25ml.

10. Tubos de centrífuga Oakridge de polipropileno de 50ml.

11. Crio – viales NUNC™ de 1.8ml.

12. Incubadora de 37ºC (Forma Scientific- Modelo 3315).

13. Pipeteador electrónico (Drummond).

14. Centrífuga refrigerada (International Equipment Company IEC-B 22M).

15. Cabina de flujo laminar (Bellco Glass Inc., Modelo 8001-76000).

16. Sonicador (Virsonic 300 cell Disrupter Virtis Company).

17. Congeladora de -70ºC Harris Ultra low.

18. Hielo.

IV 1.1.2 PROCEDIMIENTO

1. Preparación de semilla viral:

Esta etapa se realizó con el fin de incrementar la carga viral en ratones lactantes a partir del suero OBS 6528.

1.1. Se realizó una dilución 1 en 5 del suero y se inoculó 20ul por vía intracraneal a 7 camadas de ratones, empleando una jeringa de 1ml. con una aguja N°27 3/8".

1.2. Se observó los ratones diariamente. Cuando éstos, presentaron signos de morbilidad (ausencia de leche en su estómago, coloración oscura, delgados, descoordinación de movimientos, temblores y postración), se procedió a aplicar la eutanasia, colocándolos en una bolsa, que se saturó con CO2 y mantuvo cerrada durante 30min.

1.3. Se extrajo el cerebro de los ratones con una jeringa de 10ml. y aguja N°18 1.5", colocándolos en frascos estériles puestos en baño de hielo; luego se procedió a ser triturados. Toda esta operación se realizó dentro de la cabina de flujo laminar.

1.4. Con el volumen de cerebro obtenido se preparó una suspensión al 10% v/v en H-MEM con 2% de suero bovino fetal (FBS), luego se centrifugó a 10 000 rpm por 10min. a 4°C.

1.5. El sobrenadante se repartió en viales de 1.8ml. conservándolos a una temperatura de -70°C.

2. Preparación del Antígeno lisado:

2.1. Se utilizó 10 frascos en “T” para cultivo celular de 250cm² conteniendo una monocapa de células Vero E-6 de 3 a 4 días de cultivo.

2.2. Se decantó el medio de crecimiento (E-MEM con 10% de FBS) de los frascos, quedando sólo la monocapa de células adheridas a la superficie del frasco.

2.3. En 5 frascos se inoculó 1ml. de medio de mantenimiento (E-MEM con 2% de FBS) a cada uno, los cuales servirán para obtener el control sin virus de antígeno.

2.4. En los 5 frascos restantes se inoculó 1ml. por frasco del antígeno viral obtenido en cerebro de ratón.

2.5. Se incubó los frascos a 37ºC por 1 hora, mover cada frasco suavemente cada 15min. con la finalidad de distribuir uniformemente el inóculo.

2.6. Se agregó a cada uno de los 10 frascos, 50ml. de medio de mantenimiento (E-MEM con 2% FBS).

2.7. Se observó diariamente los 5 frascos inoculados con el virus mediante un microscopio invertido; cuando se observó un efecto citopático (ECP) producido en la monocapa celular de 50% a 75% se procedió a cosechar desprendiendo totalmente la monocapa con la ayuda de una espátula estéril. Se procedió de la misma forma con los 5 frascos controles.

2.8. Se verificó la presencia del virus en la línea celular mediante un ensayo de inmunofluorescencia indirecta.

2.9. Se trasvasó el barrido de células a tubos de centrífuga Oakridge de 50ml., luego se centrifugó a 10 000rpm por 30min. a 4ºC.

2.10. Se descartó el líquido sobrenadante y lavó el pellet con 3ml. de borato salino a pH 9, después se centrifugó como en el paso anterior. Se repitió este procedimiento 2 veces, en la tercera juntar los pellet de las células infectadas en un tubo de centrífuga y los pellet de las células control en otro.

2.11. Se resuspendió el pellet lavado, con 5ml /tubo. de borato salino pH 9 (1ml. por frasco de 250cm² cosechado) conteniendo 1% de triton 100X.

2.12. Se inactivó la suspensión adicionando tris 1M a una concentración final de 0.1M, luego se agregó
b-propiolactona a una concentración final de 0.2%. La suspensión final se dejó a 4°C durante 72 horas agitando cada cierto tiempo.

2.13. Se sonicó la suspensión 3 veces durante 15 segundos para lisar las células que deben estar en un recipiente con hielo.

2.14. Se centrifugó a 5 000rpm. durante 30min, luego se dispensó en criotubos de 1.8ml y rotuló


IV 1.2 TITULACIÓN DEL ANTÍGENO

El antígeno lisado de Phlebotomus fever se somete a esta prueba con el objetivo de determinar la óptima concentración para ser usada en la prueba de ELISA IgG indirecta.

IV 1.2.1 MATERIALES Y EQUIPOS

1. Tubos de centrífuga:

2. Pipetas serológicas de 10, 5 y 1ml.

3. Pipeta multicanal de 10 - 100ul.

4. Micropipetas de 0,5 - 20ul, 10 – 100ul y 100 – 1000ul.

5. Puntas de pipetas (tips).

6. Placa flexible fondo en U (Dinex).

7. Antígeno lisado.

8. Fluido ascítico hiperinmune de ratón (HMAF); liofilizado.

9. Buffer de dilución (pH 7.4): Leche descremada al 5% en buffer fosfato salino (PBS 1X) y tween 20 al 0.5%.

10. Medio Esencial Mínimo con sales de Hank conteniendo 1% de antibiótico (H-MEM 1% Ab).

11. Buffer de lavado: PBS 1X y Tween 20 al 1%

12. Conjugado IgG: Anti IgG humano de cabra purificado y marcado con peroxidasa.

13. Sustrato ABTS: 2.2’-azino-di [3-etil-benzotiazolin sulfonato (6)].

14. Lavador de placas para ELISA (Dynatech Ultra Wash-II).

15. Lectora de placas para ELISA (DYNEX MRX Revelation).

IV 1.2.2. PROCEDIMIENTO

1. Se preparó diluciones de 1:500, 1:1000, 1:1500, 1:2000, 1:3000 y 1:6000 del antígeno, utilizando PBS 1X como diluyente (ver cuadro 1).

2. Se colocó 100ul/pozo de cada dilución en las placas para ELISA de 96 pozos. El antígeno se coloca en las filas A, C, E y G; mientras que el control de antígeno en las filas B, D, F y H. Empleándose dos filas por cada dilución, una para el antígeno y otra para el control. (Ver esquema 1.)

 

ESQUEMA 1. PLACA DE ELISA CON DISPOSICION DEL ANTIGENO Y CONTROL DE ANTIGENO

 

 

CUADRO 1. PREPARACION DE LAS DILUCIONES DEL ANTIGENO

  1:500 1:1 000 1:1 500 1:2 000 1:3 000 1:6 000
PBS 6 986 ul 2 000 ul 2 000 ul 3 000 ul 2 000 ul 2 000 ul
ANTIGENO
LISADIO
14 ul
(puro)
2 000 ul
(1:500)
1 000 ul
(1:500)
1 000 ul
(1:500)
1 000
(1:1 000)
1 000
(1:2 000)
VOLUMEN
LISADO

7 000

4 000

3 000

4 000

3 000

3 000

NOTA: 1 El control del antígeno se trabaja a las mismas diluciones.
          2 El volumen final es sufieciente para sensibilizar dos placas.

 

3. Se cubrió las placas con papel aluminio e incubar a 4°C por toda la noche.

4. Al día siguiente se lavó las placas por un ciclo (5 lavados), usando 250ul/pozo de buffer de lavado por vez.

5. Después de cada lavado se removió el exceso de buffer, golpeando la placa sobre un papel absorbente.

6. Se colocó 100ul/pozo de buffer de dilución en las columnas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 12; en la columna 1 se colocó 200ul/pozo de una dilución 1:100 del fluido ascítico hiperinmune (HMAF) con buffer de dilución y en la columna 11 se agregó 100ul/pozo de suero humano normal (SHN) como control negativo diluido 1:100 con buffer de dilución. (Ver esquema 2.)

 

ESQUEMA 2. PLACA DE ELISA CON DISPOSICION DEL FLUIDO ASCITICO HIPERINMUNE (HMAF), SUERO HUMANO NORMAL (SHN) Y BUFFER DE DILUCION

 

Cuadro 2. Diluciones seriadas del HMAF
pg28_cuad2.jpg (14084 bytes)


7. Usando una pipeta de 8 canales se mezcló y transfirió 100ul de la columna 1 a la 2, luego se continuó mezclando y transfiriendo de la misma forma hasta la columna 10, eliminando los 100ul sobrantes. (Ver esquema 2.)

8. Se cubrió las placas con papel aluminio e incubó a 37°C por una hora.

9. Se lavó las placas y secó como en los pasos 5 y 6.

10. Se agregó 100ul/pozo de conjugado diluido 1:8000.

11. Se procedió como se describe en los pasos 8, 5 y 6 sucesivamente.

12. Se agregó 100ul/pozo de sustrato.

13. Se incubó cubriendo las placas con papel aluminio a 37°C por 30 minutos.

14. Luego se procedió a leer las placas en un espectrofotómetro a 405 nm.

15. El título óptimo está dado por la concentración de antígeno que proporciona el título más alto con el fluido ascítico hiperinmune (HMAF); y que de una lectura baja para el control negativo y para el blanco (Ver esquema 3).

 

ESQUEMA 3. RESULTADO DE LA TITULACION

 

 

La lectura de la primera dilución del HMAF (1:100) debe estar entre 1.5 - 3.0 de O.D. y las lecturas de las siguientes diluciones deben bajar gradualmente, describiendo una curva.


IV 2. PRUEBA INMUNOENZIMÁTICA ELISA IgG INDIRECTA

IV 2.1. OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS:

Los 400 sueros analizados en la prueba inmunoenzimática fueron proporcionados por el Instituto de Investigación de Enfermedades Tropicales NMRCD. Muestras procedentes de Iquitos de los años 95 al 98.

Los criterios de inclusión son: Pacientes con fiebre mayor de 38ºC. Y que posteriormente a las tres semanas de iniciada la enfermedad se requirió una segunda toma de muestra


IV 2.2. MATERIALES Y EQUIPOS

1. Tubos de centrífuga.

2. Pipetas serológicas de 10, 5 y 1ml.

3. Pipeta multicanal de 10 - 100ul.

4. Micropipetas de 0,5 - 20ul, 10 – 100ul y 100 – 1000ul.

5. Puntas de pipetas (tips).

6. Placa flexible fondo en U de 96 pozos (12x8) (Dinex).

7. Lavador de placas para ELISA (Dynatech Ultra Wash-II).

8. Lectora de placas para ELISA (DYNEX MRX Revelation).

9. Antígeno lisado.

10. Sueros controles positivo y negativo.

11. Buffer de dilución (pH 7.4): Leche descremada al 5% en PBS 1X y Tween-20 al 0.5%.

12. Medio Esencial Mínimo con sales de Hank conteniendo 1% de antibiótico (H-MEM 1% Ab).

13. Buffer de Lavado: PBS 1X y Tween 20 al 1%

14. Conjugado IgG: Anti IgG humana de cabra, purificado y marcado con peroxidasa.

15. Sustrato ABTS : 2.2’-azino-di [ 3 – etil - benzotiazolin sulfonato (6)].


IV 2.3. PROCEDIMIENTO

IV 2.3.1. SENSIBILIZACIÓN DE LAS PLACAS:

1. Se preparó por separado diluciones del antígeno viral y del control de antígeno, a las concentraciones óptimas halladas en la titulación (dilución 1:1 500); utilizando como diluyente PBS 1X.

2. Se colocó 100ul de las diluciones respectivas en filas alternadas empezando con el antígeno en la primera fila.

3. Se cubrió las placas con papel aluminio e incubar a 4°C durante toda la noche.

IV 2.3.2. DILUCIÓN DE LAS MUESTRAS

1. A todos los sueros, incluyendo los sueros controles positivo y negativo; se les hizo una dilución 1:10, colocando en los microtubos 0.9ml de H-MEM 1% antibiótico con 0.1ml de suero y se almacenaron a -20°C.

IV 2.3.3. EL ENSAYO

1. Se realizó una segunda dilución 1:10 de los sueros, utilizando como diluyente el buffer de leche al 5% y pH 7.4. Se empleó 450ul de buffer diluyente con 50ul de suero pre-diluido. Siendo 1:100 la dilución final del suero.

2. Se lavó las placas por un ciclo ( 5 veces ) y remover el remanente de buffer de lavado golpeando la placa sobre papel absorbente.

3. Se agregó 100ul de la dilución final de los sueros a los pozos apropiados. En la primera columna, los dos primeros pozos (uno con antígeno viral y otro con control de antígeno) fueron para el suero control positivo y los siguientes seis pozos (tres con antígeno viral y tres con control de antígeno) para el suero control negativo, que se coloca por triplicado.

4. Se incubó por una hora y continuó con los procedimientos descritos en la titulación del antígeno (IV 1.2.2 8-14).

5. Luego se procedió a leer a 405 nm. e interpretó los resultados dando como positivos a aquellos que posean valores de O.D. mayor o igual a 0.200 y como negativos a los que presenten un valor de O.D. menor a 0.200.


IV 3. CONFIRMACIÓN DE LOS RESULTADOS MEDIANTE LA PRUEBA DE NEUTRALIZACIÓN POR REDUCCIÓN DE PLACA

La neutralización de la infectividad viral es el método más específico y sensible para determinar la identidad de un aislamiento y la determinación de anticuerpos específicos presentes en el suero de un paciente (24, 30, 35).

Si hay anticuerpos neutralizantes los virus no pueden unirse a las células y la infectividad resulta bloqueada. Una fracción de virus infectante puede permanecer aún en presencia de anticuerpo específico, de modo que la infección puede estar demorada, más que totalmente bloqueada. Para identificar los aislamientos virales se utilizan anticuerpos de reactividad conocida. Para pruebas serológicas, se utilizan suspensiones de virus de referencia contra los sueros de pacientes (1, 24, 30, 35).

Las células infectadas aparecen como “placas” sin color contra el fondo coloreado de las células viables. La reducción en el número de placas indica neutralización (1, 24).

IV 3.1. MATERIALES Y EQUIPOS

1. Monocapa completa de células BHK-21 clón 15 (células de riñon de hamster dorado bebe) en frascos de cultivo celular de 225 cm2.

2. Sueros que dieron positivo para la prueba de ELISA IgG.

3. Suministro de semillas del virus Phlebotomus fever producidas en cerebro de ratones lactantes y en cultivo celular Vero E-6.

4. Suero bovino fetal (SBF) diluido al 2% en E-MEM.

5. Medios: MEM con 10% de SBF y medio para cubierta líquida (liquid Over Layer).

6. Solución de tripsina al 0,75% y colorante para células BHK-21 clón 15 (azul negro de naftol)

7. Microplacas de 96 pozos.

8. Placas para cultivo celular de 12 y de 24 pozos.

9. Tubos de 5ml de capacidad.

10. Micropipetas de 10 a 100 ul y de 2 a 20 ul de capacidad con puntas estériles.

11. Pipetas estériles de 10, 5 y 1ml.

12. Incubadora a 37°C con 5% CO2.

13. Hemocitómetro.

14. 0,4% de azul de tripán.


IV 3.2. PROCEDIMIENTO

IV 3.2.1 Preparación del cultivo de células BHK-21 clon 15 para PRNT

1. Tripsinizar la monocapa celular BHK21 clón 15 con solución de tripsina, luego se eliminó el medio de crecimiento viejo, lavar la capa de células con solución de tripsina (0.75%) y agregar 3ml de la misma solución dejándolo durante 2 a 5 minutos, eliminar la solución de tripsina y mantenerlas en incubadora a 37°C hasta que la capa de células se desprenda de la superficie del frasco.

2. Agregar 10 ml del medio de crecimiento al frasco, agitar manualmente para que las células se desprendan y mezclar la suspensión de células con una pipeta dos o tres veces para romper los acúmulos de células.

3. Contar las células viables en un hemocitómetro utilizando 0,4% de azul de tripán (por lo general hacer una dilución 1:10 de la suspensión de células en azul de tripan).

4. Calcular el total de células que se obtiene: promedio del conteo celular en 4 cuadrantes x 104 x 10 x 10 = X células/10 ml.

5. Calcular el volumen total de medio que se agregará en la suspensión celular obtenida en al paso 2. para obtener una concentración de 3 x 105 células/ml mediante:

volumen total = X células (4.)/3 x 105 = Y cm3

6. Agregar la suspensión final en placas de 12 y de 24 pozos, 1ml/pozo y 0.5ml/pozo respectivamente.

IV 3.2.2 Titulación del virus Phlebotomus fever (virus replicado en células Vero)

1. Realizar diluciones del stock de virus comenzando desde la inoculación pura del virus, seguida de una dilución diez veces mayor que la anterior; hasta llegar a cien mil.

2. Inocular 100ul/pozo de cada dilución preparada, en dos pozos para las placas de 12 y 50ul/pozo en cuatro pozos para las placas de 24.( Ver esquema 4.)

3. Incubar la placa a 37°C con 5% de CO2 durante 2 a 3 horas.

4. Adicionar la cubierta semilíquida “liquid Over Layer” a las placas. En 0.5 ml/pozo a las placas de 24 pozos y 1ml/pozo a las placas de 12 pozos

5. Mantener las placas a 37°C con 5% de CO2, realizando ensayos para 2, 3, 5 o mas días (se puede observar el efecto citopático bajo el microscopio).

6. Eliminar el medio líquido, lavar la capa de células con agua y colorear agregando 1ml/pozo (placas de 12) y 0.5ml/pozo (placas de 24 pozos) de azul negro de naftol para cubrir la capa de células, dejar a temperatura ambiente por 60 minutos y lavar con agua.

7. Contar las placas y escoger las diluciones que contengan alrededor de 20 ufp para las placas de 12 y 10 ufp para las de 24 pozos. Si es necesario se realizarán diluciones más finas hasta obtener la cantidad de placas deseadas.

8. Realizar la prueba de neutralización con fluido ascítico hiperinmune y con los sueros controles positivo y negativo para ELISA. El HMAF es para asegurarse de que se trata del virus Phlebotomus fever y los controles de ELISA es para verificar de que sean controles verdaderos.

IV 3.2.3. Procedimiento de PRNT

1. Preparar la dilución de trabajo (DT); esta es la mitad de la dilución de virus que forma 10 placas en un volumen de 0,05 ml. Hacer una dilución 1:10 (DT-1) y otra de 1:100 (DT-2).

2. Diluir las muestras de suero humano inactivadas (56°C por 30min.) a una concentración de 1:15 y 1:30 en diluyente (H-MEM con 2% de SBF) y agregar 0,06 ml/pozo en placas de 96 pozos.

3. Agregar 0,06 ml de la dilución de trabajo en 0,06 ml de la dilución del suero (dilución final del suero 1:30 y 1:60), incubar la placa a 4°C toda la noche, incluir la parte del control DT, DT-1, DT-2 (0,06ml con igual volumen de diluyente).

4. Añadir la mezcla obtenida en el paso anterior en una placa de 24 pozos (0,05 ml/pozo), las cuales contengan células BHK21 clón 15 (preparar las placas justo antes de inocular las muestras).

5. Incubar la placa a 37°C con 5% de CO2 durante 2 a 3 horas.

6. Adicionar la cubierta semilíquida “liquid Over Layer”. 0.5 ml/pozo a las placas de 24 pozos.

7. Mantener las placas a 37°C con 5% de CO2 por 3 días (se puede observar el efecto citopático bajo el microscopio).

8. Eliminar el medio líquido, lavar la capa de células con agua y colorear agregando 0.5ml. de colorante azul negro de naftol para cubrir la capa de células, dejar a temperatura ambiente por 60 minutos y lavar con agua.

9. Contar las placas y calcular el porcentaje de reducción de placas con la fórmula:

% = N°ufp de la dilución de trabajo – N°ufp de la muestra x 100%.
                          N°de ufp de la dilución de trabajo

10. Las muestras que presentaron un porcentaje de reducción del 70% en ambas diluciones (1:30 y 1:60) se consideran positivas.

ESQUEMA 4. TITULACION DELVIRUS PLHEBOTOMUS FEVER

 

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