Revista de la Sociedad Peruana de Medicina Interna.       Vol. 15 • Nº 2 • 2002

 

PRESENCIA DEL GENOTIPO D/D DE LA ENZIMA CONVERTIDORA DE ANGIOTENSINA 235T DEL GEN DE ANGIOTENSINÓGENO COMO FACTORES DE RIESGO PARA SUFRIR UN EVENTO CORONARIO AGUDO

Frank Lizaraso S1, Gustavo Rivara R, Euler Torres, Ricardo Fujita

 

Resumen 

Ante la evidencia de que la expresión genética de los componentes del Sistema Renina Angiotensina Aldosterona (SRAA) están implicados en la presencia de enfermedad coronaria y la aparición de un evento coronario agudo (ECoA), se ha venido estudiando la expresión del gen de la enzima convertidora de angiotensina I (ECA) y su polimorfismo, de cuyo alelo D promovería un patrón de enfermedad agresivo y prematuro. Por otro lado el alelo T del gen del angiotensinógeno AGT también ha sido considerado en la patogenia de la enfermedad coronaria. Se correlacionó la presencia del genotipo DD y TT como factor de riesgo para la aparición de ECoA, en nuestra Población muestral. Como objetivo secundario interesó saber si existía asociación de uno de estos genotipos con los pacientes de bajo riesgo coronario que presentaron el EcoA. Este estudio tipo caso-control, Multicéntrico que incluyó 90 pacientes de ambos sexos, siendo 45 hipertensos que se compararon con 45 normotensos. Se extrajeron muestras para ADN, se realizó el análisis del polimorfismo por PCR en los genes ECA y AGT, dosaje de ECA sérico y la determinación bioquímica del Perfil lipídico. Resuhdos: El riesgo de tener ECoA en portadores de DD para el polimorfismo ECA y de tener TT para el polimorfismo AGT mostraron lo siguiente: DD/ID: OR=6,6, IC 95% [1,26-34,54] P<0,05; DD/II: OR = 8,8, IC 95% [1,71-45,32] p<0,05. Existe Un nivel de C-HDL más bajo en portadores de TT del Polimorfismo del gen AGT: T235 (TT) 45 ± 20, M235T (MT) 57 ± 24; 235M (MM) 67 ± 20, P<0,05. CONCLUSIONES: El genotipo DD del polimorfismo I/D del gen, ECA es factor de riesgo para ECoA. La Presencia de un nivel bajo de C-HDL se relaciona a la presencia del genotipo 235T (TT) del polimorfismo del gen AGT y finalmente el mayor IMC es un factor condicionante de enfermedad coronaria, en nuestro grupo muestral. 

Palabras clave: Genética; Genes; Enfermedad coronaria. 

 

Introducción

La enfermedad coronaria, como sabemos es una enfermedad cardiovascular muy frecuente en la población mundial. Su predisposición familiar fue reconocida desde 1850, y que además en esta condición de ser familiar se presentaba a edad más temprana de lo usual. Se reconoció también que este efecto de historia familiar positiva, podría afectar a personas consideradas de bajo riesgo, vale decir aquellas sin factores de riesgo coronario mayores. Gracias a los avances en genética molecular, estos componentes en la historia familiar, están siendo dilucidados.

Más de una alteración genética está comprometida, por esto es una enfermedad poligénica, además es producto de una interacción entre factores hereditarios y ambientales. Debido a su gran frecuencia pareciera que cierto gen polimórfico ocurriría con una frecuencia inusual1.

Como sabemos el sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA) es uno de los elementos claves en la regulación del proceso fisiológico cardiovascular, que incluye el remodelamiento cardiovascular, la hemostasia del sodio y mantenimiento del tono vascular2. Hay evidencias de que este sistema tiene rol importante en la patogenia de la aterosclerosis.

La angiotensina II estimula factores de crecimiento que pueden ser importantes en el desarrollo de aterosclerosis, además es quimiotáctico para células inflamatorias que participan en la formación de placa aterosclerótica. Además, juega un rol importante en la disfunción del endotelio, deteriora el sistema bradiquinina/calicreina, que además afecta al óxido nítrico; promueve la hiperplasia e hipertrofia de la célula muscular lisa vascular. Los niveles elevados de aldosterona están inversamente relacionados con los niveles de HDL y como sabemos los niveles bajos de HDL, predisponen a alto riesgo de aterosclerosis y eventos coronarios agudos (ECoA), definida como la presencia de infarto agudo de miocardio o de angina Inestable.

Entonces la expresión genética de los componentes de este SRAA están implicados en esta patología y mucho se ha venido estudiando acerca de la expresión del gen de la enzima convertidora de angiotensina I (ECA) y su polimorfismo. El alelo D promueve probablemente respuestas mucho más marcadas al interactuar con otros factores de riesgo aterosclerótico, originando un patrón de enfermedad agresivo y prematuro.

El polimorfismo I/D del gen ECA ha sido extensamente investigado, como vamos a revisar, y es un locus genético candidato para enfermedades cardiovasculares3,4 asociándosele a enfermedad coronaria, cardiopatía isquémica, reestenosis postangioplastía, e infarto de miocardio4,12.

Los reportes publicados que han causado el interés de esta posible asociación entre el gen ECA polimórfico y el riesgo de infarto miocárdico4,12 y enfermedad coronaria5,6,12 los vamos a revisar a continuación.

Cambien y col13 encontró en 1300 sujetos, que el genotipo DD era significativamente más frecuente en sujetos con infarto miocárdico agudo (IMA) que en los controles, sobre todo fue significativo en el grupo de bajo riesgo coronario, o sea en aquellos con menos factores de riesgo coronario. El porcentaje atribuido al gen polimórfico para riesgo relativo de IMA, fue del 35%, comparado con el 8% de los controles, según este estudio.

En la segunda parte del trabajo, confirmó mayores niveles de ECA en sujetos con genotipo DD, estableciendo que la actividad aumentada del ECA podría ser un factor de riesgo para IMA, independientemente del polimorfismo I/D.

Un estudio japonés dirigido por Takahashi14, demostró que había relación entre el genotipo DD del ECA y enfermedad coronaria extensa, aunque se debe decir que no estudió un grupo numeroso. Otro estudio realizado por Garderman A col15, encontró que el alelo D predominaba en presencia de enfermedad coronaria extensa, estando restringida a pacientes mAs jóvenes (menores de 61,7 años), mientras que su asociación al IMA, se dio en sujetos ancianos (mayores o iguales a 61,7 años), en base a un estudio en 2,267 varones caucásicos.

El estudio de Cambien3 realizado en gente europea del estudio ECTIM, fue corroborado por otros investigadores, en descendientes de poblaciones norteamericanas16 Japonesas5 italianas12 y australianas17.

Schechter, et al18 tomaron 338 pacientes centenarios en un estudio caso-control y los comparó con adultos entre 20 y 70 años, encontrando que el genotipo DD predisponía a enfermedades coronarias y estaba aumentada en los centenarios.

Ruiz y col10 compararon la frecuencia del polimorfismo D en 132 sujetos diabéticos, no insulinodependientes (NIDM), quienes sufrieron IMA o estenosis coronaria significativa y 184 diabéticos (NIDM) sin evidencia de enfermedad coronaria y encontró que el alelo D era predictor potente para riesgo de enfermedad coronaria. El riesgo relativo fue progresivamente mayor en homocigotes y heterocigotes con alelo D, sugiriendo un efecto codominante. Fue responsable este alelo de un 24% de la enfermedad coronaria, en este estudio.

Evans y col19 determinaron la frecuencia del polimorfismo I/D en 313 autopsias de casos fatales con diagnóstico de IMA posible y definitivo, comparado con controles de la misma población del área de Belfast Northern Ireland. Los casos de autopsia estaban con una frecuencia aumentada, del alelo D (D major o igual que 0,02). El odds ratio fue 2,2 para D/D vs. I/I y 1,8 para I/D vs. I/I.

Arbustini et al12 estudiaron 388 italianos de raza blanca, de los cuales 255 probaron tener enfermedad coronaria y en 133 se descartó enfermedad coronaria por cateterismo coronario para ser considerados como grupo control. Detectaron que el alelo D estuvo significativamente asociado al riesgo de IMA.

Oike y col20 sugirieron que el genotipo DD predisponía a un alto riesgo para sufrir infarto cardiaco, en pacientes con espasmo coronario, que como sabemos es un factor condicionante. El estudio se realizó en 150 japoneses varones mayor de 60 años, con control angiográfico y uso de inyección intracoronaria de maleato de ergonovina.

Estudios experimentales demostraron que la expresión del gen ECA está incrementada en el tejido miocárdico después de una oclusión coronaria3. Bohn21 y col también estudió la posibilidad de una asociación entre el IMA prematuro en los padres (madres menores de 61 años y padres menores de 56 años) y el polimorfismo I/D del gen ECA, en 181 hombres y 48 mujeres sobrevivientes de IMA. La frecuencia del IMA en padres fue 14% para individuos con D/D, 10,6% para individuos con I/D y 6,1% en individuos con I/I. Esto muestra la importancia de este polimorfismo como marcador genético y el riesgo de IMA en los grupos familiares con esta predisposición.

Ohishi y col11 indicaron que el genotipo D/D está asociado a un alto riesgo de reestenosis postangioplastia percutánea, para lesiones estenóticas ateroescleróticas. Amant et al22 corroboraron estos resultados, encontrado que la reestenosis postangioplastia más stent, era dos veces más en aquellos con alelo D, en relación a sujetos con alelo II. Esto refuerza las evidencias del rol del SRAA, en la patogenia de reestenosis poststent, en coronarias. Un reciente metaanálisis con 8873 sujetos tornados de 15 estudios, encontró asociación del alelo D y el IMA21.

Por otro lado, tenemos otros estudios cuyos resultados no muestran asociación alguna de estos factores genéticos que estamos revisando, quizás en parte por las diferencias en los diseños de estudio y potencia estadística, o por estar restringido a ciertos subgrupos de determinada raza, género o edad y el número de sujetos estudiados. Algunos estudios usaron cineangiocoronografía para confirmar o descartar enfermedad coronaria, lo cual disminuye el riesgo, de incluir resultados falsos-negativos.

Así tenemos los estudios de Bohn y Col24 y Freidl y Col25 quienes no pudieron corroborar los resultados de Lindpaintner, Arbustini, Nakai y Mattu, respecto a la asociación del gen polimórfico I/D y el riesgo de IMA y enfermedad coronaria.

Bohn et al23 no corroboraron los mismos resultados que Cambien et al3 en el estudio ECTIM. Bohn, estudió otra población y no observó significancia estadística entre genotipo DD e IMA en grupos de bajo riesgo, quizás sea por las diferencias reconocidas de estas características genéticas en poblaciones diferentes.

En un estudio prospectivo grande de médicos americanos Lindpaintner y Col4 no confirmaron una asociaci6n significativa de este alelo D y enfermedad coronaria o IMA. Este resultado es significativo por ser una población de médicos varones estadounidenses que tienen perfil de bajo riesgo coronario y la incidencia de enfermedad coronaria esclerótica entre médicos es más baja aún, que el grupo de bajo riesgo del estudio ECTIM.

En un estudio retrospectivo de cohortes26 basado en el Estudio del Corazón en la Ciudad de Copenhagen, no había evidencia de que el polimorfismo I/D, tenga un rol importante en el desarrollo de IMA y enfermedad coronaria.

Otro estudio con pacientes bajo cineangiocoronografía no encontró relación entre el polimorfismo I/D y las lesiones coronarias per sé, pero si con la ocurrencia de IMA en pacientes con enfermedad coronaria16. En una población australiana si bien se encontró asociación entre el genotipo DD de enfermedad coronaria o historia de IMA, no se relacionó con la severidad de la enfermedad, comparada con una cohorte de escolares saludables17.

En un estudio reciente (1999), M. Pfhol y Col.27 no encontraron la asociación del I/D polimorfismo del gen ECA y la presencia de enfermedad coronaria e IMA, en una población caucásica señalando además que no fue útil el uso de genotipos de este polimorfismo.

No se han encontrado estudios relevantes respecto a la relación entre el polimorfismo del gen de angiotensinógeno y enfermedad coronaria o ECoA. Teóricamente debería haber alguna relación desde que los niveles elevados de angiotensinógeno II, se relacionan a disfunción endotelial, que como sabemos es el primer paso para el inicio de enfermedad coronaria. Además este polimorfismo si es importante en otras enfermedades cardiovasculares como lo es la hipertensión arterial, según se ha demostrado2,7,8. Por otro lado sabemos que la HTA es un factor de riesgo, coronario importante y por lo tanto condicionante de ECoA.

El gen del angiotensinógeno (AGT) que es otro componente molecular clave de SRAA, ha sido considerado en la patogenia de la enfermedad coronaria y los estudios respecto a la asociación de su polimorfismo genético y el IMA o la enfermedad coronaria, han sido como dijimos escasos y conflictivos8,29,30. Tenemos datos de que la mutación M235T de este gen, se correlaciona con niveles altos de angiotensinógeno, específicamente con los homocigotes TT31, esto afecta el incremento en los niveles de angiotensina I y consecuentemente de angiotensina II.

En un estudio reciente realizado por Oliviero y Col en el que trató de demostrar la existencia de una asociación entre los polimorfismos del gen AGT y del gen del receptor tipo 1 del angiotensinógeno II y la presencia de IMA y enfermedad coronaria multivaso, encontrando que los pacientes Coronarios que poseían el genotipo 235T u homocigote TT tenían un riesgo incrementado de IMA32.

Existe una hipótesis interesante planteada por Kakutain y Col33. que relaciona el SRAA con los factores protrombóticos. Así la AngII tendría un papel “regulador hacia arriba” de los receptores de lectin endotelial, semejante a la lipoproteina oxidada de baja densidad (LOX-1)34 y tendría relación con los homocigotes TT facilitándose la agregación plaquetaria a nivel endotelial, y por ende produciendo oclusión arterial.

Debemos mencionar que últimamente se le está dando importancia al gen quimasa polimórfico, en su papel de acelerar la ateroesclerosis de los puentes venosos en by-pass aortocoronarios.35. Como se sabe la quimasa (sistema quimasa) tiene la propiedad de generar AngII a partir de AngI, independientemente del ECA. Esta quimasa podría activarse por el LDL colesterol36.

Debemos decir que, a pesar de los resultados discrepantes, acerca de la intervención o rol del polimorfismo I/D del gen ECA en enfermedad coronaria y eventos agudos coronarios, es muy probable que esta patología se interrelacione con los otros polimorfismos genéticos pertenecientes al SRAA, sistema que cuando está incrementada su actividad ha demostrado aumentar el riesgo de enfermedad arterial coronaria e IMA37. Además este polimorfismo genético y su interacción con factores ambientales, factores de riesgo coronario y otros rasgos de tipo étnico y etáreo, evidentemente potenciarían estos efectos posiblemente condicionando una mayor respuesta perjudicial manifestándose como un patrón de enfermedad más agresivo, e inclusive por lo que hemos podido revisar, en ciertos grupos de bajo riesgo coronario.

La finalidad del presente estudio es correlacionar la presencia del genotipo DD, con la aparición de ECoA, así como identificar si es o no marcador de riesgo para sufrir un evento coronario agudo, en nuestra, población muestral. Asimismo establecer si existe asociación del polimorfismo del gen AGT con el riesgo de sufrir un ECoA. Como objetivo secundario nos interesa saber si existe asociación de uno de estos genotipos con los pacientes de bajo riesgo coronario (sin factor de riesgo coronario previo o sólo con el antecedente de ingesta excesiva de alcohol), que presentaron el ECoA.

Material y métodos

Es un estudio de tipo caso-control, en el que se estudiaron 90 pacientes hombres y mujeres mayores de 18 años. La mitad de ellos con diagnóstico de enfermedad coronaria y que habían sufrido un evento coronario agudo (infarto de miocardio agudo o angina inestable). Se internaron consecutivamente en el servicio de cardiología, UCI Coronaria y de la Unidad de Dolor Torácico del servicio de Emergencia del Hospital Edgardo Rebagliati Martins. Los controles fueron pacientes sin enfermedad coronaria evidente, del mismo hospital o de los atendidos en el consultorio médico de la Facultad de Medicina de la Universidad San Martín de Porres (USMP). Los exámenes de laboratorio y estudios genéricos se realizaron en el Instituto de Investigación y Genética de la misma Universidad. Las personas con diagnóstico de enfermedad coronaria aguda se les denominó casos y fueron en número de 45. Se excluyeron aquellos pacientes con dolor torácico de causa no coronaria o no determostrable en forma objetiva, pacientes en ICC GF II-IV, con insuficiencia renal aguda o crónica, los menores de 18 años y aquellos que se negasen a firmar un consentimiento escrito para el estudio. A las personas sin enfermedad coronaria clínica y electrocardiográficamente evidente se le denominó grupo control y fueron 45.

Además se consideraron en el grupo de casos dos subgrupos. El subgrupo de alto riesgo coronario al que se le asignaron pacientes con los siguientes factores de riesgo coronario: tabaco, DM, dislipidemia (modificables), sexo masculino (no modificables). Al subgrupo de bajo riesgo coronario se le asignaron aquellos sujetos con hábito de ingesta de alcohol más que moderada o aquellos que carecían de los otros factores de riesgo coronario modificables.

El estudio comprendió entre marzo del 2000 y enero del 2002.

RECOLECCIÓN DE DATOS

Se prepararon cuestionarios estructurados, que tenían anexados consentimientos informados, los cuales fueron aprobados por el Comité de Ética del hospital. Se realizó de manera directa a través de un cuestionario estructurado y en forma indirecta a través de la historia clínica, al momento del ingreso a los servicios consignados.

Se determinaron datos de filiación antecedentes contributorios, examen físico y la determinación de un electrocardiograma en todos los pacientes. Se consignaron también los resultados de los cateterismos realizados en algunos de los pacientes. Los exámenes de laboratorio y estudios genéticos se realizaron en el Instituto de Investigación de la Facultad de Medicina de la Universidad San Martín de Porres. El único hospital participante fue el Hospital Edgardo Rebagliati Martins.

Se extrajeron dos muestras sanguíneas por persona y en ayunas, tanto al grupo de casos como a los del grupo control para el dosaje de enzima convertidora de angiotensina sérica (ECA), perfil lipídico y determinación del genotipo. Se extrajeron las muestras dentro de las primeras 48 horas de ingreso al hospital y solo a aquellos pacientes que aún no habían recibido inhibidores de enzima convertidora (IECA).

Determinación genética

Con el consentimiento del individuo se procedió a la toma de la muestra de sangre periférica colectada en tubos vacutainer conteniendo un anticoagulante (EDTA).

EXTRACCIÓN DEL ADN

La extracción del ADN estuvo basada principalmente en la metodología simplificada utilizada por Fujita en 199138. A 5ml. de sangre periférica se le adicionó 2 volúmenes de la solución tampón TE 2:5 (20 mM Tris-HC1, 5mM EDTA), se mezcló produciéndose la lisis parcial por hipotonía y se centrifugó a 3 000rpm por 10min. Este paso fue repetido por 5 veces o hasta que se haya eliminado la mayor cantidad de eritrocitos anucleados y la hemoglobina. El pellet fue resuspendido en 0,2 volúmenes de TE 20:5 y se adicionó Sarkosyl (Lauroylsarcosine) a una concentración final del 1% para lisar los núcleos restantes liberando el ADN. El lisado fue incubado toda la noche con 100ug/ml de proteinasa K a 50°C y luego se le adicionó acetato de amonio a una concentración final de 3M y 2,5 vol de etanol absoluto para precipitar el ADN. Se eliminó el etanol y la medusa de ADN fue resuspendida en 500uL de TE 20:5, luego se le adicionó NaCl a una concentración final de 0,2 NI y 2,5 vol de etanol absoluto. Se eliminó el etanol y el ADN fue resuspendido en TE 20:1 a una concentración estimada de 200ug/mL. La cantidad de ADN fue estimada empíricamente por inspección visual del tamaño de la medusa precipitada.

Análisis del polimorfismo por PCR en los genes de ECA y de AGT

ACE

El polimorfismo inserción/deleción del ADN localizado en el intrón 16 del gen de la enzima convertidora de la angiotensina I fueron detectados utilizando oligonucleótidos (primers) complementarios a las regiones que flanquean la inserción y mediante la amplificación en cadena de la polimerasa (PCR).

Las reacciones se llevaron a cabo según la metodología de Rigat y col. (1992)(39) utilizando 10 pmoles de cada primer: forward 5'-CTG GAG ACC ACT CCC ATC CTT TCT-3'y reverse 5'-GAT GTG GCC ATC ACA TTC GTC AGA T-3’, en un volumen final de 25ul conteniendo 1X PCT buffer (Perkin Elmer), 3 mM MgC12, 0,5mM dNTPs y 1U de Taq polimerasa (Perkin Elmer). El ADN fue amplificado por 30 ciclos con una denaturación de 94°C por 1min, una hibridación de 58°C por 1min y una extensión de 72°C por 1min usando un termociclador Amplitron II (Thermolyne). El producto de PCR fue visualizado mediante la electroforesis en geles de agarosa al, 5% y la tinción con bromuro de etidio. El producto de PCR es un fragmento de 190pb en ausencia de la inserción y un fragmento de 490pb en presencia de la inserción.

 

Figura 1. Análisis de polimorfismo del gen de la enzima convertidora de angiotensina (ECA) en individuos con enfermedades cardiovasculares de diferentes centros de salud de Lima.

AGT

Algunos reportes muestran una fuerte evidencia que la variante molecular del gen del angiotensinógeno constituida por la mutación de T por C en el nucleótido 704 del exon 2 que conlleva a la sustitución de la treonina por la metionina en el aminoácido 235, se encuentra muy ligado al fenotipo de hipertensión y niveles elevados de angiotensinógeno en el plasma. Este polimorfismo puede ser detectado a través de la amplificación en cadena de la polimerasa (PCR) y el análisis con enzimas de restricción. El cambio de T por C no altera un sitio de restricción, sin embargo produce una mitad del sitio para Tth 111I (GACNNNGTC), la otra mitad es sintetizada por el PCR utilizando primers con 2 CAMBIOS en la posición 4 y 5 del extremo 3' el primer reverse.

Las reacciones se llevaron a cabo utilizando 5 pmoles de cada primer: forward 5'-CCG TTT GTG CAG GGC CTG GCT CTCT-3' y reverse 5'CAG GGT GCT GTC CAC ACT GGA CTC CC-3'.

El PCR se llevó a cabo con las modificaciones realizadas en el Instituto de Genética y Biología Molecular de la USMP. En un volumen final de 25ul conteniendo 1X PCR buffer (Perkin Elmer), 0,5mM dNTPs, 4mMMgCl2 y lU de Taq polimerasa (Perkin Elmer) se amplificó el ADN por 30 ciclos con una denaturación de 94ºC por 45 s, una hibridación de 66ºC por 45 s y una extensión de 72ºC por 45 s usando un termociclador Amplitron II (Thermolyne). El producto amplificado de 165 pb fue visualizado mediante la electroforesis en geles de agarosa al 1,5% y la tinción con bromuro de etidio.

 

Figura 2. Análisis de polimorfismo M235T del gen de la angiotensina (AGT) en individuos con enfermedades cardiovasculares de diferentes centros de salud de Lima

 

Se diluyeron 10µL del producto amplificado en 20µL conteniendo 1X del buffer correspondiente a la enzima, 1X de BSA (albúmina de suero de bovino) y 3 U de Tth111I (Promega) y se incubaron a 65oC por toda la noche. El fragmento de 141pb producido por la digestión deTth111I en los fragmentos amplificados que llevan C en la posición 704 puede ser visualizado, a través de la electroforesis en geles de agarosa al 2,5% y la tinción en bromuro de etidio.

Determinación bioquímica

DOSAJE DE ECA SÉRICO

De una muestra de sangre heparinizada se extrajo el plasma o suero por centrifugación. Se guardó estable a lo más por una semana en refrigeración y luego de este período por congelación en los casos que fue requerido. Se tuvo en consideración que el ECA sérico podía regresar a niveles normales a partir de las 12 horas de administrado un IECA como el Captopril por ejemplo, por lo que no se aceptaron muestras de pacientes que habían tomado este tipo de medicación desde dos semanas antes, inclusive.

Se utilizó el ECA Reagent, un producto de Sigma Diagnostics para la determinación del ECA sérico a 340nm de absorvancia. Se utilizaron un ECA calibrador, un espectrofotómetro capaz de medir una absorbancia de 340nm., pipetas y cubetas con propiedades ópticas, un timer y una cámara de cubetas a temperatura constante.

El método es espectrofotométrico, modo cinético que consiste en comparar la tasa de reacción de la muestra de un substrato sintético catalizada por ECA, con la obtenida con el calibrador ECA a temperatura de 30oC ó 37oC. El substrato sintético es el tripéptido N-[3-(2-furil) acriloll]-L-fenilalanilgliglicina (FAPGG) y es hidrolizado a furilacriloilfenilalanina (FAP), que resulta en un decremento de la absorvancia a 340 nm.

En este procedimiento se siguieron las recomendaciones estrictamente dadas por la casa Sigma Diagnostics.

Se preparó el ECA Reagent, luego se reconstituyó el ECA calibrador de acuerdo al inserto de la caja. Se pipeteó 1,0mL de la solución del ECA Reagent en cada una de dos cubetas rotuladas con Test y Calibrator. Se agregó 0,1mL. del espécimen a la cubeta marcada con Test y 0,1mL del calibrador FCA a la cubeta marcada con Calibratora 340nm. Se mezclaron por inversión, luego se colocaron las cubetas a temperatura constante en el compartimento de cubetas y se esperó 5 minutos aproximadamente. Se hizo la lectura y se grabó las absorvancias de Test y Calibrator a 340nm vs agua como referencia. Estas tuvieron las “A” iniciales. Exactamente 5 minutos después, nuevamente se leyó y grabó las absorvancias como “A” finales. El procedimiento de calibración es linear hasta una actividad del ECA de 120µ/L. Los valores normales del ECA sérico van de 8 a 52µ/L a 37oC ó 5 a 33 a 30oC. Se tomó en cuenta las condiciones de bioseguridad durante el procesamiento.

DETERMINACIÓN BIOQUÍMICA DEL PERFIL LIPÍDICO

Los equipos utilizados fueron un autoanalizador bioquímico Vitalab modelo Selectra 2 y una centrifugadora automática. Se utilizaron Kits de reactivos para la determinación del colesterol total, determinación de colesterol HDL sérico, y triglicéridos. Se utilizaron un suero control normal y patológico (Merck-Qualitrol), calibrador multiparamétrico (Merck-SMT). Tubo de 75 x 12mm., guantes descartables, pipeta automática y tips (25 a 250µL) y una copa pediátrica. Muestra de sangre venosa, que luego de centrifugada a 3500 rpm. por 5 minutos se separo el suero en el tubo de 75 x 12mm. Luego de calibrar el equipo y hacer el control de calidad (reglas de Westgard), se realiza el procesamiento de la muestra, mezclando el reactivo precipitante con la muestra y colocando, finalmente el sobrenadante en el equipo Vitalab Selectra 2, para su lectura.

Se tomaron en cuenta en todos los procedimientos las condiciones de bioseguridad.

CONCENTRACIÓN DEL COLESTEROL TOTAL SÉRICO

Método enzimático colorimétrico. Se utilizaron Kits de reactivos para la determinación de colesterol total.

CONCENTRACIÓN DEL COLESTEROL HDL SÉRICO

Método enzimático colorimétrico, del sobrenadante producto de la precipitación del fosfotungstato.

CONCENTRACIÓN TRIGLICÉRIDOS  SÉRICOS

Método enzimático colorimétrico.

CONCENTRACIÓN LDL SÉRICO

Se utilizó la fórmula de Friedwald, válida para triglicéridos menores a 300mg/dL (C-LDL=C. total-C-HDL+Trig/5).

Análisis estadístico

Finalizado el trabajo de campo, los datos fueron procesados en el paquete estadístico SPSS versión 10, realizando los siguientes análisis: 

   - Identificación de datos perdidos (missing) debido a que algunas fichas presentaban
     información incompleta (<10%).
 

   - Se utilizaron los métodos del chi cuadrado y la t-student, con una significativa de p<0,05
     (5%). El nivel de confianza: 1-alfa: 95% y la potencia estadística del 80%.

   - Para establecer la significancia estadística, en la comparación de promedios se utilizó el
     análisis de varianza de una vía, y en la comparación de porcentajes la prueba de chi
     cuadrado.
 

   - Análisis de riesgo con su respectiva significancia estadística empleando el análisis OR
     (odds ratio), con un IC (intervalo de confianza) del 95%, y la prueba de chi cuadrado.

    - Previamente a este estudio se realizó un estudio piloto, tipo comparativo con selección
     de variables no pareada y con 221 pacientes (94 casos y 127 controles), en el cual la
     variable
     edad tenía una diferencia estadística significativa entre casos y controles (ver anexo I).

   - Para controlar la variable edad se realizó la selección de pacientes por apareamiento
     según la edad, método que no exige un tamaño muestral mayor de 90 pacientes40.
 

Elaboración de cuadros y gráficas con la ayuda de la hoja de cálculo Excel.

 

Tabla 1. Características demográficas que afectan a la población de estudio
  Grupo


P
Caso (n=45) (Control (n=45)
M DT M DT
-Edad (años) 64,0 11,0 674,0 11,0 NS
- MC (kg/m2) 29,0 3,0 26,0 4,0 0,001
- PAS (mmHg) 117,0 14,0 115,0 14,0 NS
- PAD (mmHG) 69,0 13,0 72,0 9,0 NS
- Colesterol T (mg/dL) 192,0 57,0 182,0 45,0 NS
- LDL (mg/dL) 105,0 36,0 105,0 47,0 NS
- HDL (mg/dL) 55,0 28,0 44,0 13,0 NS
- Triglicéridos (mg/dL) 169,0 93,0 167,0 69,0 NS
- ECA sérico (U/L) 24,0 17,0 21,0 14,0 NS
M: media  DT: desviación típica         NS: No signficativa p>0,05

 

Tabla 2. Características demográficas que afectan a la población de estudio
  Grupo


p<
Caso Control
n=45 % N=45 %

Sexo

- Masculino 31 68,90 19 42,20  
- Femenino 14 31,10 26 57,80 0,01
Diabetes mellitus 5 11,10 1 2,20 NS
Tabaco 16 35,60 1 2,20 0,001
OH 1 2,20 14 31,10 0,001
NS: No significativo p<0,05

 

 Resultados

En la Tabla 1, se presentan las características clínicas y de laboratorio de la población de estudio, mostrando homogeneidad en sus variables.

La Tabla 2 muestra las variables como sexo, diabetes mellitus, tabaco, alcohol, encontrándose que el sexo masculino es del 68,9% (n=31) en el grupo de casos vs. 42,2% (n=19) en el grupo control, mientras que en el sexo femenino es de 31,1% (n=14) en el grupo de casos vs. 57,8% (n=26) en el grupo control, en ambos casos con p<0,01. El antecedente de tabaquismo fue de 35,6% (n=16) para el grupo de casos vs. 2,2% para el grupo control, con p<0,001; mientras que el antecedente de alta ingesta de alcohol fue de 2,2% (n=1) para el grupo de casos vs. 31,1% (n=14) para el grupo control, con p<0,001. 

 

Tabla 3. Relación entre el genotipo ECA Y AGT  y presencia de un evento coronario agudo
  Riesgo p<
Sin riesgo Riesgo X2
N % N %
ECA - DD 11 18,6 8 23,5%  
- ID 26 44,1 17 50,0  
- II 22 37,3 9 26,5 1,17 NSS
AGT - T235 32 53,3 16 47,1  
- M235T 23 38,3 13 38,2  
- 235MM 5 8,3 5 14,7 0,99NS
NS: No significativa p>0,05

 

Tabla 4. Características clínicas y de laboratorio en coronarios según genotipo ECA
  ECA
  DD ID II F P<
  M DT M DT M DT  
- Edad (ños) 65 13,0 67 10,0 64 11,0 0,43 NS
- IMC (kg/m2) 32 12,0 29 2,0 29 3,0 1,83 NS
- PAS (mmHg) 119 27,0 122 16,0 114 20,0 1,50 NS
- PAD (mmHg) 69 14,0 73 14,0 68 9,0 1,70 NS
- Colesterol total (mg/dL) 198 65,0 185 53,0 172 54,0 1,17 NS
- LDL (mg/dL) 123 36,0 102 46,0 84 38,0 2,62 NS
- HDL (mg/dL) 53 22,0 50 16,0 54 30,0 0,23 NS
- Triglicéridos (mg/dL) 162 73,0 176 113,0 180 97,0 0,18 NS
- ECA sérico (U/l) 29 19,0 27 18,0 22 15,0 0,84 NS
NS: No significativo p>0,05   M: media  DT: desviación típica

 

Las Tablas 4 y 5 muestran las características clínicas y de laboratorio en el grupo de casos según los polimorfismos ECA y AGT respectivamente, distanciándose que existe un nivel de C-HDL más bajo en portadores de TT del polimorfismo del gen AGT:T235 (TT) 45 ± 20; M235T (MT) 57 ± 24; 235M (MNI) 67 ± 20, p<0,05. 

 

Tabla 5. Características clínicas y de laboratorio en coronarios según genotipo AGT.
  AGT
T235 M235T 235M  
M DT M DT M DT
- Edad (años) 66 10,0 65 12,0 62 11,0 0,52 NS
- IMC (kg/m2) 119 23,0 118 17,0 121 15,0 0,14 NS
- PAS  (mmHg) 71 15,0 70 9,0 73 7,0 0,29 NS
- PAD (mmHg) 30 8,0 28 3,0 30 3,0 0,90 NS
- Colesterol total (mg/dL) 179 53,0 185 65,0 189 42,0 0,16 NS
- LDL (mg/dL) 99 41,0 100 50,0 86 23,0 0,22 NS
- HDL (mg/dL) 45 20,0 57 24,0 67 20,0 3,58 0,05
- Triglicéridos (mg/dL) 183 112,0 158 91,0 177 63,0 0,59 NS
- ECA séricos (U/L) 27 17,0 28 20,0 20 8,0 0,55 NS
NS: No significativo p> 0,05

 

Tabla 6. Resultados finales de análisis de riesgo para un evento coronario agudo
Análisis OR IC95% P<
- DD Y ID 6,60 1,26-34,54 0,01
- DD y II 8,80 1,71-45,32 0,01
- T235 y M235T     NS
- T235 y 235M     NS
NS: No significativo p> 0,05

 

La Tabla 6 muestra el análisis del riesgo, de tener ECoA en portadores de DID de tener TT respecto a los otros genotipos que comparten el gen es el siguiente: DD/ID: OR= 6,6, IC 95% [1,26-34,54] p<0,05; DD/II: OR=8,8, IC 95% [1,71-45,32] p<0,05. 

Discusión

Por la evidencia de un rol patogenético primario de la angiotensina II (Ang II) en las enfermedades cardiovasculares, se le viene dando, gran importancia al SRAA. Es así que los genes más estudiados en lo que se refiere a polimorfismos genéticos son el ECA y AGT Su posible asociación con las enfermedades cardiovasculares y la posibilidad de ser posibles marcadores de riesgo, son sugerentes aunque aun no se ha podido demostrar fehacientemente 31 . Tenemos en la literatura estudios que hablan específicamente de su relación con IMA y enfermedad coronaria, unos a favor y otros en contra30,41-43.

Un análisis de 11000 casos y controles no demostró relación entre el IMA y el polimorfismo I/D del gen ECA44, incluyendo poblaciones como la Francesa e Italiana45,46 O'Malley y Col.17 resumió los estudios de asociación entre el polimorfismo I/D y el riesgo de tener IMA, a pesar que estratificó por regiones geográficas, no pareció ser un indicador útil. Por otro lado hay otros estudios recientes que si demuestran asociación, como aquel realizado por Oliveri y col.32 en el que se observa un riesgo incrementado para la presencia de IMA en aquellos portadores del 235T (TT). Petrovick et al demostraron que el DD es un factor de riesgo independiente para producir IMA en personas menores de 55 años48. 

 

Tabla 7. Características demográficas que afectan a la población del estudio piloto
  Grupo


P<
  Coronarios (n=94) Referencial (n=127)
M DT M DT
- Edad (años) 65,0 10,0 52,0 15,0 0,001
- IMC (kg/m2) 30,0 6,0 26,0 4,0 0,001
- PAS (mmHg) 118,0 20,0 109,0 14,0 0,001
- PAD 70,0 13,0 70,0 9,0 NS
Colesterol (g/dL) 182,0 57,0 182,0 40,0 NS
- LDL (g/dL) 100,0 43,0 102,0 36,0 NS
- HDL (g/dL) 51,0 23,0 48,0 16,0 NS
- Triglicéridos (g/dL) 169,0 101,0 161,0 110,0 NS
- ECA sérico (U/L) 26,0 17,0 22,0 13,0 NS
NS= no significativo,    p>0,05

 

Tabla 8. Resultados finales de la regresión logística
Variable Variables en la ecuación    
B S.E Wald df Sig R Exp (B)
- IMC -,3484 ,1019 1 1,69071 ,0006 -2957 ,7058
- OH(I) -1,5567 ,5603 7,7193 1 ,0055 ,2271 ,2108
  Constant 10,6866 2,88856 13,7155 1 ,0002  
Variables no en la ecuación
  Residual chi2 19,349 with 4df Sig=,0007
Variable Score df Sig R
- Sexo 3,2746 1 ,0704 ,1072
- Tabaco 10,8623 1 ,0010 ,2827
- ECA 4,2241 2 ,1210 ,0450
- ECA (1) 2,9882 1 ,0839 ,0944
- ECA (2) ,1304 1 ,7180 ,000

 

Entre las explicaciones posibles a esta falta de consenso están la heterogeneidad fenotípica propia de las enfermedades multifactoriales, en las que los factores fisiológicos, patológicos, genéticos y ambientales están comprometidos de hecho las características raciales juegan un rol importante, por la diferente distribución de los genes ECA y AGT49,50 . Realmente es un reto detectar alelos de genes que confieren susceptibilidad para esta enfermedad. Es recomendable realizar estudios a gran escala, prospectivos y comparativos con controles sanos, libres de enfermedad coronaria (EKG, ergometría, prueba de perfusión miocárdica y/ cateterismo coronario), lo cual es difícil lograr por su alto costo. Además que provengan de diferentes razas y diferentes costumbres por lo que debe ser multicéntrico internacional. 

La población estudiada por nosotros es básicamente gente de raza mestiza, y cuyos controles podrían tener sesgo, ya que solamente se descartó enfermedad coronaria por historia clínica y EKG de reposo. 

Las características clínicas y de laboratorio de los pacientes estudiados (Tablas 1 y 2) mostraron un mayor IMC en el grupo de casos y que lógico es factor de riesgo coronario que condiciona al grupo. Este resultado se corrobora con la regresión logística (ver anexo 1). En cuanto al resto de factores de riesgo coronario el sexo masculino y el ser fumador si bien estarían condicionando teóricamente el evento coronario, pero sin embargo la regresión logística no los presenta como condicionantes desde el punto de vista estadístico. 

En cuanto a los resultados de los subgrupos de alto riesgo coronario (tabaco, DM, dislipidemia, sexo masculino) y bajo riesgo coronario (alcohol o nada), no hubo diferencia estadística en la influencia de los genotipos DD o TT, para la presencia de un evento coronario agudo en el grupo de bajo riesgo. 

Cuando analizarnos la distribución de las variables según la presencia del polimorfismo I/D del gen ECA (Tabla 4), observamos que el ECA sérico tuvo la distribución típica descrita en la literatura, pero sin diferencia significativa desde el punto de vista estadístico. En el caso de las mismas variables según el polimorfismo AGT (Tabla 5), cabe resaltar el mayor nivel con significancia estadística del colesterol HDL, en los pacientes que carecían del “alelo de riesgo T”, vale decir los que tenían la variante normal MM, lo cual nos haría suponer la protección de tener un mayor nivel de GHDL sérico en portadores del genotipo 235M (MM). Este hallazgo seria importante corroborarlo en otros estudios. 

Según los antecedentes revisados en la literatura, esperábamos encontrar una asociación como factor de riesgo entre enfermedad coronaria aguda y los genotipos DD y TT. Pudimos encontrar que el ser portador de DD es factor de riesgo para enfermedad coronaria, con una significancia estadística importante, respecto a los otros genotipos que comparten el gen (Tabla 6). Sin embargo no hubo asociación con el genotipo AGT. Teóricamente podríamos sugerir que el mecanismo para producir enfermedad coronaria aguda en portadores de DD seria por la mayor cantidad de Ang II, la cual induce proliferación e hipertrofia celular vascular y miocárdica51,52 con remodelación y aumento de la vasoconstricción arterial, además de la mayor producción de la matriz extracelular. Por otro lado uno de los factores condicionantes de riesgo seria el tener GHDL bajo niveles de protección y condicionados por un genotipo 235T (TT).

Finalmente comentar que debe rescatarse la importancia de haber corroborado lo que otros investigadores han publicado que el genotipo de riesgo DD, es un factor de riesgo para enfermedad coronaria y para la presencia de un evento coronario agudo, y se le está dando más importancia en relación a las otras enfermedades cardiovasculares, que aún tienen muchas discrepancias en sus resultados.

Conclusiones

Merced a los resultados obtenidos de nuestra población muestral tenemos las siguientes conclusiones:

- El genotipo DD del polimorfismo I/D del gen ECA es un factor de riesgo para sufrir un evento coronario agudo, comparado con los portadores de los otros genotipos que comparten el gen.

- La presencia de un nivel bajo de GHDL se relaciona a la presencia del genotipo 235T (TT) del polimorfismo del gen AGT.

- El mayor IMC es un factor condicionante de enfermedad coronaria.

Reconocimientos

- Se recomienda realizar un estudio multicéntrico nacional a gran escala, en pacientes que han sufrido un evento coronario agudo, confirmando su asociación del genotipo DD, además investigar la asociación de otros marcadores identificados dentro del gen ECA, como son el ECA 4 y ECA 8.

- Se recomienda buscar la asociación de DD como factor de riesgo para la presencia de enfermedad multivaso, mayor tasa de reestenosis post-Stent y cardiopatía isquémica dilatada como complicación.

RECONOCIMIENTOS

Un especial reconocimiento al Señor Rector de la Universidad de San Martín de Porres, Ing. José Antonio Chang Escobedo, y el Señor Decano de la Facultad de Medicina, Dr. Frank Lizaraso Caparó, por haber brindado todas las facilidades para llevar a cabo este trabajo de investigación, el cual sin su ayuda no hubiese sido posible, por su alto costo y la necesidad de una tecnología de avanzada.

Por su valiosa colaboración a la Dra. Maria Isabel Quiroga de Michelena, al Dr. Carlos Alvarado Ortiz-Ureta, Patólogo-Laboratorista; Dra. Velando, Internista; Dra. Lorena cardiólogo, Dra. Ana Hurtado, bióloga, Sr. Ivan Miroquesada, Mg. Jorge Medina y al Msp. Wilfredo Mormontoy. A las enfermeras del Hospital Rebagliati, Sra. Maria Lizano y Rosa Cuba. Además a los alumnos Laura Acevedo y Paul Cárdenas, quienes participaron en el procesamiento de muestras.

 

Ver bibliografía

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1 Médico cardiólogo


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