La vía más importante para la entrada de Ca2+ en las células excitables (Células musculares, neuronas y células de glándulas neuroendocrinas) son los canales de Ca2+ voltajes dependientes. Al abrirse, permiten el flujo selectivo de iones Ca2+ a través del poro del canal, iniciándose una variedad de procesos intracelulares entre los que se incluyen la contracción muscular, la secreción de neurotransmisores, la expresión génica, la modulación de la excitabilidad de la membrana, el crecimiento de neuritas, etc. De esta forma, los canales de Ca2+ constituyen el enlace fundamental entre las señales eléctricas de la superficie de la membrana y las respuestas bioquímicas intracelulares. Debido al papel que juegan en muchos procesos fisiológicos y fisiopatológicos, en este trabajo se revisan aspectos relacionados con la estructura, clasificación, biología molecular y las propiedades biofísicas y farmacológicas de los canales de calcio voltajes dependientes. ESTRUCTURA Los canales de calcio son proteínas oligoméricas, constituidos por una subunidad principal, a 1, que sirve como poro y sensor del cambio de potencial (Catterrall, 1991) y diversas subunidades reguladoras o auxiliares tales como la subunidad b , las subunidades a 2s (unidas por puentes disulfuro) y dependiendo del tejido, una quinta subunidad, la subunidad y del músculo esquelético o la subunidad neuronal p95 pueden también formar parte del canal (Birnbaumer y col., 1994). con un tamaño aproximado de 2000 aminoácidos, la subunidad al tiene la misma estructura general que los canales de Na+ dependientes de voltaje (Tsien y col., 1991); está constituida por 4 dominios, los que a su vez están formados por 6 segmentos transmembrana. El cuarto de estos segmentos, S4, está altamente cargado y se considera que es la zona que actúa como sensor de los cambios de potencial de la membrana. El asa ("loop") que une el quinto y sexto segmento. formaría también parte del poro del canal (McCleskey, 1994) (Fig. 1). CLASIFICACIÓN Se han descrito seis tipos funcionales de canales de Ca2+ (Zhang y col., 1993), denominados T, L, N, P, Q y R. Estos canales se pueden clasificar atendiendo a sus propiedades biofísicas y farmacológicas; sin embargo, la clasificación más utilizada se basa en el rango de voltaje necesario para su activación, clasificándolos en dos categorías: canales de Ca2+ de bajo y de alto umbral. El canal de tipo T es el único canal de Ca2+ de bajo umbral descrito hasta la actualidad, mientras que los canales de tipo L, N, P, Q y R han sido caracterizados como canales de Ca2+ de alto umbral debido a que se requieren grandes despolarizaciones para su activación PROPIEDADES BIOFÍSICAS Y FARMACOLÓGICAS Canales de calcio Tipo T Descritos originalmente en neuronas sensoriales de vertebrados (Carbone y Lux, 1984), los canales de Ca2+ tipo T han sido encontrados en una gran variedad de células excitables y no excitables (neuronas, músculo cardíaco, músculo liso, músculo esquelético durante el desarrollo, fibrobastos, osteoblastos, astrocitos, pituitaria, etc.) y se encuentran ausentes en células cromafines y en neuronas simpáticas. Su función está relacionada principalmente con la actividad rítmica (marcapasos) y la entrada de Ca2+ a potenciales negativos (Bean, 1985). Se activan de forma voltaje dependiente a potenciales negativos (-70 mV), observándose la amplitud máxima de la corriente alrededor de -20 mV (Feduloava y col., 1985; Bossu y col., 1985); el curso temporal de la activación se representa por una sigmoide, lo cual sugiere la existencia de varios estados cerrados con un estado final abierto (Carbone y Swandulla, 1989). Por otra parte, inactivan (se cierran durante la despolarización) de forma voltaje dependiente, desactivan (se cierran durante la repolarización) más lentamente que los canales L y N. Las corrientes de cola se ajustan a una función monoexponencial con una constante de tiempo en el rango de milisegundo (Fedulova y col., 1985; Bossu y col., 1985). Los canales de tipo T son bloqueados, aunque de forma no selectiva, por amilorida (Tang y col., 1988), tetrametrina (Hagiwara y col., 1988), difenilhidantoina (Yaari y col., 1987) y octanol (Llinás & Yarom, 1986) y son resistentes a las dihidropiridinas. Son insensibles a los iones Ca2+, inclusive a concentraciones elevadas (20 m M); y, son bloqueados de forma selectiva por los iones Ni2+ (40 m M), sin afectar las corrientes de alto umbral (Fox y col., 1987a y b). Canales de calcio tipo L Los canales de Ca2+ de tipo L son los mejores estudiados y se encuentran ampliamente distribuidos en todas las células excitables y en la mayorías de las células no excitables. Constituyen la principal vía de entrada de iones Ca2+ en las células de los músculos cardíaco, esquelético y liso, y, contribuyen de forma significativa a controlar la secreción de neurotransmisores y los mecanismos de acoplamiento excitación, contracción en las células neuroendocrinas, en algunas preparaciones neuronales y en las células de los músculos cardíaco y esquelético. Su activación es voltaje dependiente y el potencial de activación depende del tipo celular; por ejemplo, en las células neuroendocrinas y en el músculo cardíaco se activan a partir de potenciales próximos a -30 mV y la amplitud máxima de la corriente se alcanza en torno a los + 5 mV (Bean, 1985) mientras que, en neuronas sensoriales se activan alrededor de -10 mV (fox y col., 1987a y b). La inactivación es más lenta que los canales de tipo T y en el curso temporal de dicho proceso tiene una constante de tiempo del orden de segundos y depende de diversos factores: 1) del ion que pasa a través del canal (los iones Ca2+ la aceleran y los iones Ba2+ la enlentecen), 2) de la [Ca2+]i (los quelantes de Ca2+ la enlentecen) y 3) de la amplitud de la corriente (cuanto mayor es la amplitud de la corriente, más rápida es la inactivación). Estos datos sugieren que la [Ca2+]i desempeña un papel fundamental en el proceso de inactivación de los canales de Cal' de tipo L y en general de todos los canales de alto umbral; sin embargo, en células cardíacas se ha observado que la inactivación también depende del potencial de membrana (Lee y col, 1985). Por tanto, la inactivación de los canales de Ca2+ de alto umbral es un fenómeno complejo que depende al menos de dos factores: de la [Ca2+]i, que a su vez depende de la actividad de los canales; y, del potencial que alcanza la membrana durante su activación. La farmacología de este tipo de canales es de gran importancia debido al éxito alcanzado en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares (ángor pectoris, hipertensión arterial, enfermedades vasculares periféricas, etc.), neurológicas (vasoespamo, isquemia cerebral, infarto cerebral agudo, migraña, etc.), gastrointestinales, etc. (Fisher y Grotta, 1993) con fármacos bloqueantes de los canales de Ca2+ de tipo L, denominados usualmente "antagonistas del calcio" (Fleckenstein-Grün y col., 1984). Estos fármacos constituyen un grupo heterogéneo de compuestos y han sido clasificados atendiendo a su estructura química en 4 grupos: 1,4-dihidropiridinas (DHP) (nifedipina, nitrendipina, nimodipina, etc.), benzotiazepinas (diltiazem), fenilalquilaminas (verapamil) y piperacinas (flunaricina, cinaricina, etc.). Se unen específicamente a receptores acoplados alostéricamente a la subunidad a , del canal, pero esta unión esta modulada por los estados (activo, inactivo) del mismo; teniendo mayor afinidad por el estado inactivado, que es el que predomina durante la despolarización, produciendo la estabilización de este estado y por lo tanto un bloqueo voltaje dependiente de la corriente de Ca2+ (Bean, 1984, Porzig, 1990). Las DHP por su especificidad y potencia han sido utilizadas como ligandos para la localización, aislamiento y purificación de los anales de tipo L en músculo esquelético (Curtis y Catterall, 1984; Tanabe y col., 1987) y para los estudios de inhibición y activación de estos canales en células cromafines (Ceña y col., 1989) y otras preparaciones (Scott y Dolphin, 1990). Por parte, los canales de Ca2+ de tipo L son insensibles a las toxinas w-agatoxina IVA (w-Aga-IVA) w-conotoxina GVIA (w-CTx-GVIA) a concentraciones inferiores a 1 m M (Birnbaumer y col., 1994). Canales de calcio tipo N Se describieron por primera vez en neuronas del ganglio dorsal del pollo (Nowycky y col., 1985). Son un grupo heterogéneo de canales que precisan grandes despolarizaciones para su activación e inactivan, aunque de forma incompleta, a potenciales de "holding" despolarizantes (positivos) (Fox y col., 1987a y b; Plummer y col., 1989). Los canales de tipo N, se denominan así porque parecen ser específicos del sistema nervioso y de tejidos relacionados con éste, puesto que sólo se han descrito en células de origen neural (Wgner y col., 1988; Boland y col., 1994), en células cromafines (Bossu y col., 1991) y se ha observado que se incrementa su expresión en células PC12 tratadas con NGF (Grantham y col., 1994). Debido a la variabilidad de la conductancia de canal único (11-20 pS), de su cinética de apertura y del curso temporal de su inactivación (50-80 ms en neuronas del ganglio dorsal del pollo o 500 ms en neuronas simpáticas) no es posible diferenciar por métodos electrofisiológicos los canales de tipo N de otros canales de Ca2+ de alto umbral (Plummer y col., 1989). Actualmente, la mejor forma de caracterizarlos es utilizando criterios farmacológicos debido a su insensibilidad a las DHP y a su bloqueo por w-CTx-GVIA (100-500 ptM) (Aosaki y Kasai, 1989; Regan y col., 1991) y por w-conotoxina MV11C w-CTx-MVIIC) (Martin-Moutot y col, 1995) a concentraciones mayores de 100 nM (Birnbaumer y col., 1994). Estas y otras conotoxinas se obtienen del veneno de caracoles marinos pertenecientes a diversas especies del género Conus: C. geographus (w-M-GVIA), C. magus (w-CTx-MVIIC), etc. (Gray y col., 1988). Las w-conotoxinas son cadenas peptídicas de 24 a 29 aminoácidos, contienen 6 residuos de cisteína que forman tres puentes disulfuro y en la actualidad se han obtenido análogos sintéticos que se encuentran en fase de caracterización de sus propiedades farmacológicas y por lo tanto de la determinación de su posible uso en el tratamiento de patologías en las que estén involucrados los canales de Ca2+ de tipo N (Miljanich y Ramachandran, 1995). Canales de calcio tipo P Se denominan canales de tipo P porque se describieron por primera vez en las células de Purkinje del cerebelo (Llinás y col., 1991; Mintz y col., 1992a); sin embargo, su caracterización se realizó tanto en células de Purkinje como en la sinapsis gigante del calamar. Llinás y col. (1989) observaron que una corriente de Ca2+ resistente a DHP y a w-CTx-GVIA era bloqueada por F'FX (funnel-web toxin), un compuesto debajo peso molecular (200-40ODa) obtenido por purificación parcial del veneno de la araña Agelenopsis aperta. Con esta toxina se purificaron los canales de Ca2+ (del cerebelo de cobayo y del lóbulo óptico del calamar) y, una vez reconstituidos en bicapas lipídicas, se estudiaron sus propiedades electrofisiológicas y farmacológicas. Observaron que los canales tenían una conductancia de 10-15 pS, que su activación era voltaje dependiente, que la corriente de Ca'~ era bloqueada por FTX, Cd2+ y Co2+ y que no se afectaba por otros bloqueantes de canales de Ca2+. w-Aga-lVA es un péptido de 28 aminoácidos purificado a partir del veneno de A. aperta y debido a su potencia y selectividad es el bloqueante más utilizado para el estudio y caracterización farmacológica de los canales de tipo P (Mintz y col., 1992a y b). Los canales de tipo P parecen ser los canales mas ampliamente distribuidos en el sistema nervioso central de mamíferos, y también se ha descrito su existencia en: retina, hipófisis, células cromafines, etc. (Llinás y col, 1991). Respecto a su función, se le ha relacionado con la generación de actividad intrínseca, la modulación de la actividad neuronal y liberación de neurotransmisores (Bertolino y Llinás, 1992). Canales de calcio tipo Q w-CTx-MVIIC, un péptido de 26 aminoácidos, presenta sitios de unión de alta afinidad (en el rango de 40 pM hasta 1 nM) en membranas de cerebro de rata; esta afinidad es significativamente mayor que la que presenta por los canales de tipo N (en estudios de desplazamientos de 125[-w-CTx-MVIIC, se ha observado que la IC50 es de 0,3 nM, en tanto que para w-CTx-GVIA es de 3 m M) (Hillyard y col., 1992). Utilizando esta toxina se ha establecido la existencia de otro tipo de canal de Ca2+ en neuronas granulares de cerebelo (Sather y col, 1993), en hipocampo (Whecler y col., 1994) y recientemente en células cromafines bovinas (López y col., 1994), denominado tipo Q. Al igual que los canales de tipo P, los de tipo Q son resistentes a las DHP pero se diferencian porque presentan una menor sensibilidad a w-Aga-IVA (son bloqueados a concentraciones > 10 nM) (Zhang y col., 1993; Birtibaumer y col., 1994), tienen una cinética de inactivación más rápida y presentan una elevada sensibilidad a w-CTx-MVIIIC (rango nM) (Sather y col., 1993). Respecto a su función, se ha sugerido que este tipo de canal jugaría un papel predominante en la neurotransmisión glutamatérgica debido a que tanto la transmisión sináptica como la liberación de glutamato inducida por despolarización son inhibidas por w-Aga-IVA pero sólo a elevadas concentraciones (Zhang y col., 1993; Teramoto y col., 1995). A pesar de todas estas observaciones, la existencia de este canal es controvertida porque el efecto bloqueante de w-CTx-MVIIC es muy inespecífico (Olivera, 1994), pudiendo bloquear los canales de tipo P con una potencia similar al tipo Q y unirse a los canales de tipo N aunque con menor afinidad que w-CTx-GVIA. Canales de calcio tipo R Los canales de calcio se pueden clasificar de una forma general en dos familias: canales sensibles a DHP y canales insensibles a DHP. Los miembros de la última familia tienen mucho interés porque se encuentran casi exclusivamente en tejido neuronal y entre sus distintos miembros presentan una homología > 60% (en sus secuencias de aminoácidos). A la segunda familia pertenece el cDNA que codifica para una subunidad a, conocida como doe-I, aislado de una genoteca de cerebro anterior de Discopyge ominata (Home y col., 1993). La micro inyección de los RNAs complementarios de doe-1, y las subunidades a y b en ovocitos de Xenopus produjeron una corriente de Ba2+ que presentaba una cinética de activación e inactivación muy rápida y los estudios de canal único demuestran que en respuesta a la despolarización, los canales doe-1 se abren repetidamente durante cortos periodos de tiempo y su conductancia a Ca2+ y Ba2+ es de 14 pS (Ellinor y col., 1993), similar a la de los canales de tipo N, mayor que la de los canales de tipo T y menor que la de los canales de tipo L en neuronas sensoriales (Fox y col., 1987b), La corriente de Ca2+ observada tras la expresión de la subunidad doc- 1 presenta propiedades larmacolOgicas distintas a las mediadas por los canales de Ca2+ descritos previamente. A diferencia de los canales N, es bloqueada de forma reversible por w-CTx-GVIA pero sólo a concentraciones muy elevadas (rango m M); a diferencia de los canales de tipo P, doe-1 es insensible a w-Aga-IVA y ligeramente sensible a w-CTx-MVIIC; y, a diferencia de los canales de tipo L, es insensible a las DHP pero, se ha observado que el agonista BA Y K 8644 produce un débil bloqueo de la corriente en lugar de un incremento (Ellinor y col., 1993). Sin embargo, se bloquea de forma dosis dependiente y reversible por iones Ni2+ (IC50 = 33 m M) y Cd2+ (IC50 < 1 m M) (Zhang y col., 1993). En las células granulares del cerebelo se ha descrito la existencia de un canal de Ca2+ de alto umbral con propiedades biofísicas y farmacológicas muy similares a las descritas para doe-I y al que se ha denominado canal de tipo R. La gran similitud de propiedades sugiere que el canal de tipo R sería la contraparte de doe-I en tejido neuronal de mamífero (Zhang y col., 1993).
Biología molecular La biología molecular de los canales de Ca2+ tiene su origen en la caracterización bioquímica del receptor de DHP en el músculo esquelético. Estos estudios establecieron que el complejo receptor- canal de DHP era un complejo multisubunidad compuesto por la subunidad a (formadora del canal) y pequeñas subunidades accesorias (a 2 b , y g ) (Campbell y col., 1988). El clonaje y secuenciación de los cDNAs permitió disponer de las sondas para el descubrimiento de la diversidad de canales de Ca2+ que hoy conocemos. Se han identificado 5 subunidades que se han designado a 1, a 2, b , g y s ; y, se han elonado los genes para 6 subunidades (a , 4 subunidades b , una subunidad a 2 y una g (Perez-Reyes y Schneider, 1995). Los genes de las subunidades a 1, codifican canales de Ca2+ con distintas propiedades electrofisiológicas y farmacológicas por lo que los estudios de biología molecular se han centrado en el estudio de esta subunidad. Por otra parte, estas propiedades se ven afectadas tanto por el sistema de expresión como por la composición de subunidades del canal, por lo que no ha sido posible establecer una clasificación de subunidades a 1 en función de estas propiedades. Por ello, se ha establecido una clasificación de subunidades en función de los productos de los genes clonados hasta la actualidad (tablas 1 y 2). Subunidad a 1 Se han aislado, clonado y secuenciado los productos de 6 genes que codifican para igual número de subunidades a 1 (Tabla 1). La subunidad a es el receptor de DHP del músculo esquelético y fue la primera subunidad a 1 que se clonó (Tanabe y col. 1987). La subunidad a 1A se expresa en el cerebro pero de forma particular en el cerebelo (Starr y col., 1991), es insensible a DHP y a w-CTx-GVIA y por ello se ha sugerido que formaría parte del canal de tipo P y más recientemente del canal de tipo Q. La subunidad a 18 se clonó a partir de la línea celular IMR32 de neuroblastoma humano (Williams y col., 1992) y presenta sitios de alta afinidad para w-CTx-GVIA, lo cual sugiere que se trata del canal de tipo N ampliamente distribuido en el sistema nervioso central. La subunidad a 1C es un canal de tipo L, se encuentra ampliamente distribuida y se han descrito diversas isoformas, producto del procesamiento alternativo del gen que la codifica (Mikarni y col., 1989; Perez-Reyes y col., 1990; Snutch y col., 1991). La subunidad a 1D también es un canal de tipo L (Perez-Reyes y col., 1990) y se encuentra ampliamente distribuido en el cerebro y en diversas células endocrinas. La subunidad a 1E parece expresarse exclusivamente en el sistema nervioso central (cerebro de humanos, rata y ratón) ya que no se ha detectado su expresión en músculo esquelético, corazón, estómago o riñón (Perez-Reyes y Schneider, 1995). Es resistente a todos los bloqueantes de canales de Ca2+ conocidos, por lo que se ha sugerido que podría ser el canal de tipo R (Ellinor y col., 1993; Schneider y col., 1995). Subunidad P Se ha descrito la existencia de 4 tipos de subunidades b (Tabla 2). El cDNA de la subunidad b 1 codifica una proteína de 58 kD a cuya estructura secundaria tiene varias a hélices que a su vez contienen residuos cargados por lo que probablemente no se encuentren embebidas en los lípidos de la membrana. La secuencia de aminoácidos deducida contiene secuencias hidrofóbicas, al menos dos secuencias ricas en prolina, glutamina, serina y treonina y secuencias de consenso para muchas kinasas (Ruth y col., 1989). Se ha observado que el gen que codifica para la subunidad b 1 en músculo esquelético, cerebro y corazón, es procesado alternativamente en la región central y en el extremo carboxi terminal para producir al menos 3 proteínas completas (b 1a,b 1b,b 10). La subunidad b 2 se expresa en cerebro, corazón y pulmón; donde se han identificado transcritos diferentes de 3.5, 4 y 6 kb (Pérez- Ryes y col., 1992). Esta heterogeneidad de tamaños podría deberse al procesamiento alternativo del gen en la región central y a diferencia de la subunidad b 1, no se ha detectado procesamiento alternativo en el extremo carboxilo (Peres-Reyes y Schneider, 1995). La subunidad b 3 se expresa principalmente en el cerebro, pero se han detectado bajos niveles de expresión en corazón, aorta, tráquea, pulmón, y las líneas celulares HIT y RIN de células b (Hullin y col., 1992; Castellano y col., 1993). No contiene sitios de fosforilación por PKA y a diferencia de las subunidades b 1 y b 2, no se han descrito productos debidos a procesamiento alternativo del gen (Perez-Reyes y Schneider, 1995). La subunidad b 4 es una proteína de 58 kDa cuya secuencia contiene regiones con alta similitud de secuencia con los otros tipos de subunidades b , siendo el extremo carboxilo el que presenta mayor divergencia, y, al igual que la subunidad b 3 no presenta sitios de fosforilación por PKA y tampoco se ha descrito la existencia de procesamiento alternativo (Pérez- Reyes y Schneider, 1995). Respecto a su función, se ha observado que todas las subunidades b incrementan la actividad de la subunidad a 1, alteran su sensibilidad al voltaje y su cinética (usualmente aceleran tanto la activación como la inactivación). No se conocen los mecanismos mediante los cuales las subunidades b modulan la actividad de las diferentes subunidades a 1, pero, la región a través de la cual interactúan parece estar muy conservada (Pragnell y col., 1994). Subunidad a 2 Es una glicoproteína fácil de identificar debido a que incrementa su movilidad en geles de SDS-PAGE después del tratamiento con agentes reductores de grupos sulfhidrilos. Esta disminución aparente en su masa, de 165-225 kDa a 130-150 kDa, después de la reducción de los grupos sulthidrilo, se debe a la disociación de una proteína de 23-33 kDa denominada subunidad d (Takahashi y col., 1987). Ambas subunidades han sido elonadas y secuenciadas, y la comparación de sus secuencias ha demostrado que son codificadas por el mismo gen (De Jongh y col., 1990). Mediante análisis de Northem blot se han detectado transcritos de 7 y 8 kb para el RNAm de a 2d y también se ha observado la expresión de estos RNAm en músculo esquelético, corazón, aorta, pulmón, íleo y cerebro (Biel y col., 1991). Además, se han identificado subtipos del complejo a 2d , los cuales serían productos de procesamiento alternativo. La coexpresión de a 2s con a 1d parece aumentar la expresión de a 1 especialmente, en presencia de subunidades b . Esto sugiere que a 2d puede ser importante en la determinación de la distribución de los canales de Ca2+ (Perez-Reyes y Schneider, 1995). Por otra parte, parece ser que todos los canales de Ca2+ contienen las subunidades a 2d sin embargo, esto sólo se ha comprobado bioquímicamente para los canales de tipo N (Witcher y col., 1993) y L de músculo esquelético (Tanabe y col., 1987) y cardiaco (Chang y Hosey, 1988). Subunidad g . Es una glicoproteína y ha sido purificada formando un complejo con el receptor de DHP (Curtis & Catterall, 1984). Con la información de su secuencia se han diseñado oligonucleótidos con los que se ha clonado su cDNA a partir de genotecas de cDNA de músculo esquelético (Bosse y col., 1990). La secuencia de aminoácidos deducida codifica una proteína de 25 kDa que contiene 4 segmentos transmembrana. El análisis de Northern blot muestra que su expresión es casi exclusiva en el músculo esquelético (Bosse y col., 1990), sin embargo, transcritos de tamaño similar han sido detectados en pulmón y aorta (Biel y col, 1991). Mediante estudios de PCR se ha confirmado esta distribución restringida. Aún no se ha determinado su función, pero su expresión restringida en el músculo esquelético sugiere que podría jugar un papel importante en el acoplamiento excitación- contracción.
* Departamento de Farmacología, Bromatología y Toxicología. UNMSM
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