Revista Peruana de Biología     Vol. 6    • Nº 1    • 1999

 

PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LA L-AMINO ÁCIDO OXIDASA DEL VENENO DE LA SERPIENTE Bothrops brazili "JERGÓN SHUSHUPE"

Christian Solís1, Enrique Escobar1, Armando Yarlequé1 y Susana Gutiérrez2.

 


RESUMEN

Se ha purificado y caracterizado parcialmente la L-aminoácido oxidasa de la serpiente Bothrops brazili. El aislamiento se realizó usando técnicas cromatográficas en Sephadex G-100 y CM-Sephadex C-50, utilizando como eluyente buffer acetato de amonio 0,1M pH 6. La enzima fue purificada 29,3 veces con un rendimiento de 30,9%. Usando electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (PAGE-SDS) en condiciones reductoras y no reductoras, así como las técnicas de inmunodifusión e inmunoelectroforesis, se demostró la presencia de una sola banda proteica. La enzima fue caracterizada como una glicoproteína ácida con un peso molecular de 125,7 kd formada por dos subunidades de 59,9 kd unidas por enlaces débiles, con un pH óptimo entre 7,5 y 9, dependiendo del aminoácido usado como substrato; siendo termoestable hasta los 550 C y lábil a pH alcalino. Asimismo, los ensayos por el método del cilindro en placa de Grove demostraron el efecto antibacteriano de la proteína aislada en cepas estandarizadas de Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae y Streptococcus faecalis.

Palabras claves: L-aminoácido oxidasa, Bothrops brazili, veneno, antibacteriano, proteína.

ABSTRACT

An L-aminoacid oxidase was purified from Bothrops brazili snake venom using Sephadex G-100 and CM-Sepahdex C?50 chromatographic method; in both cases 0,1M ammonium acetate pH 6 was used as a eluted. The enzyme was purified 29,3 fold with 30,9% of yield. A homogeneus protein band was achieved by PAGE-SDS, inmunodifusion as well as immunoelectrophoresis. The enzyme was an acid glicoprotein with a molecular weight of 125,7 kd consisting of two subunits of 59,91 kd each, linked by noncovalent bonds. The optimum pH was in the range of 7,5 to 9,0 depending on the L-aminoacid used as substrate. It was a thermoestable protein untill 55 oC, but its activity decreased by alcaline treatment. On the other hand, antibacterial assays using the Grove's method demonstrated that the whole venom as well as its purified enzyme produced a severe action on standardized grown cultures of Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae and Streptococcus faecalis.

Key words: L-amino acid oxidase, Bothrops brazili, venom, antibacterial, protein.


INTRODUCCIÓN

Las L-aminoácido oxidasas (EC.1.4.3.2) catalizan la desaminación oxidativa de los L-aminoácidos y producen un cetoácido, amoníaco y peróxido de hidrógeno. Estas enzimas están ampliamente distribuidas en la naturaleza y han sido descritas en bacterias, levaduras, hepatopáncreas de moluscos, huevos de gusano de seda, riñones de mamíferos, hígado de aves y mamíferos, y venenos de algunos reptiles, incluyendo ofidios de las familias Elapidae y Viperidae (Meister, 1965; Nakano et al., 1969; Stiblova y Kornalick,1967; Tu, 1977).

A pesar de que su función biológica ha sido poco comprendida, esta enzima posee una potencial utilidad en la investigación bioquímica, y ha sido utilizada en la identificación de L-aminoácidos (Avrameas y Uriel, 1965), en la preparación de a-cetoácidos (Buckey y Porges,1956), en la obtención de FAD (Singer y Kearney, 1950), en la obtención de D-aminoácidos (Parikh et al.,1951) y en la determinación de la actividad de otras enzimas, como las peptidasas (Donlon y Fottrell, 197 1).

En venenos de serpientes, su rol aunque aún poco estudiado, podría estar relacionado con la degradación de aminoácidos durante la digestión, así como con la protección contra microorganismos presentes en la presa ingerida (Yarlequé et al, 1997). El color amarillo característico de algunos venenos se debe a la presencia de esta enzima, ya que ella posee FAD como cofactor.

Nuestras investigaciones previas sobre la acción antibacteriana de la L-aminoácido oxidasa encontrada en los venenos de Lachesis muta, B. atrox y B. pictus (Yarlequé et al., 1997), motivaron el presente estudio, destinado a caracterizar la enzima en la ponzoña de B. brazili, serpiente que habita en la selva norte del Perú y que, por el gran volumen de veneno que puede producir (2-4 ml), constituye una fuente biológica de especial interés en la búsqueda de principios bioactivos de utilidad médica.

MATERIAL Y MÉTODOS

En esta investigación se utilizó veneno crudo de ejemplares adultos de la serpiente B. brazili, procedentes de la zona del Alto Marañón y mantenidos en cautiverio en el serpentario Oswaldo Meneses del Museo de Historia Natural de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos. El veneno extraído por presión manual de las glándulas fue liofilizado y conservado a -8°C.

Tabla 1. Estabilidad diferentes pH de la L-aminoácido oxidasa del veneno crudo de B. brazil

pH % de actividad enzimática
0 horas 48 horas 96 horas
5 99,19 100,61 99,16
6 100,00 110,41 103,55
7 92,73 100,93 99,19
8 82,46 0,00 0,00
9 10,17 0,00 0,00

La actividad de L-aminoácido oxidasa se determinó a 37 °C, por el método descrito en el Worthington Enzyme Manual (1977). La mezcla de reacción contenía 50 µl de peroxidasa 0,007% y 1ml de buffer Tris HCl 0,2 M pH 7,5 que contenía L-leucina 0,1% y O-dianisidina 0,0065%. Luego de agregar 25 µl de la enzima, se midió el incremento de la absorbancia a 436 nm. La actividad específica se expresó en U/mg de proteína. Una unidad, oxida 1µmol de L-leucina por minuto en las condiciones especificadas.

La estabilidad al pH de la enzima en el veneno crudo se determinó usando buffer acetato de amonio 0,1 M pH 5, 6 y 7, y buffer Tris HCI 0,1 M pH 8 y 9. En cada caso se mezcló 0,8 ml de buffer y 0,2 ml del veneno crudo 5 mg/ml a temperatura ambiente, y se midió la actividad enzimática a las 0,48 y 96 horas.

La purificación de la enzima se hizo a partir de 75 mg de veneno liofilizado disueltos en 1,5 ml de buffer acetato de amonio 0,1 M pH 6 y centrifugados a 4000 rpm durante 15 minutos. 1 ml del sobrenadante fue aplicado a una columna de Sephadex G-100 (1,2 x 50 cm) equilibrada con el mismo buffer y a un flujo de 7 ml/h. Se colectaron fracciones de 2ml, determinándose en ellas la concentración de proteína y la actividad de L-aminoácido oxidasa. Las fracciones con mayor actividad específica fueron reunidas y aplicadas a una columna de CM-Sephadex C-50 (1,8 x 13,8 cm) equilibrada con el buffer anterior y a un flujo de 17 ml/h. Las proteínas retenidas en la columna fueron eluídas con el mismo buffer que contenía NaCl 1,0 M. Se colectaron fracciones de 1 ml y aquellas con actividad de L-aminoácido oxidasa fueron utilizadas para su estudio.

Durante la purificación, la proteína se determinó a 280 nm por el método de Warburg y Christian (1941). En la enzima purificada, el contenido de proteína fue estimado por el método de Lowry, usándose albúmina bovina como referencia (Lowry et al., 1951).

Tabla 2. Tabla de purificación de la L-aminoácido oxidasa de B. brazil

Etapa Proteína
(mg)
Act.Esp.
(U/mg)
Unid Tot.
Actv
Purificación Rendimiento
(%)
Crudo 54,45 0,19 10,81 1,0 100,00
Sephadex G-100 4,70 1,07 5,04 5,4 46,7
CM-Sephadex
C-50
0,59 5,58 3,33 29,3 30,9

Con la finalidad de evaluar la pureza y el peso molecular de la enzima, se empleó electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (PAGE-SDS) en presencia y ausencia de P-mercaptoetanol (Weber y Osborn, 1969). La pureza de la enzima también se determinó por inmunoelectroforesis e inmunodifusión (Ouchterlony y Nilsson, 1986). El peso molecular de la enzima fue calculado además por cromatografía de filtración (Andrews, 1964) utilizando una columna de Sephadex G-200 (2,1 x 16,1 cm) equilibrada con acetato de amonio 0,1 M pH 6.

Figura 1. Fraccionamiento del veneno de B. brazil en Sephadex G-100 y separación de la L-amioácido oxidasa

En cuanto al contenido de carbohidratos presentes en la enzima aislada, las hexosas fueron determinadas por el método de Dubois et aL (1956), mientras que las hexosaminas se determinaron por el método de Winsler (1955). La determinación de ácidos siálicos se hizo de acuerdo al método de Warren (1959).

Figura 2. Aislamiento de la L-aminoácido oxidasa en CM-Sephadex C-50

Para estudiar la termoestabilidad de la enzima, se preincubaron alícuotas de 30 µl entre 37 y 95 °C durante 10 minutos, luego de lo cual se enfriaron bruscamente a 4 °C durante 3 minutos para medir la actividad enzimática.

El efecto del ß-mercaptoetanol se evaluó preincubando a 37 °C durante 15 minutos, 20 µl de la enzima con 20 µl de ß-mercaptoetanol (10 y 20 mM), luego de lo cual se midió la actividad enzimática con 30 µl de la mezcla.

El pH óptimo de la enzima se determinó usando los siguientes L-aminoácidos como sustratos: leucina, metionina fenilalanina, triptofano, lisina e isoleucina. Para los ensayos se utilizaron los buffers acetato de amonio, Tris-HCl y glicina a concentración de 0,1 M y en un rango de pH de 5 a 11.

Para estudiar el efecto antibacteriano del veneno crudo y la enzima purificada, se usaron cepas de Staphylococcus aureus ATCC 6538, Streptococcus faecalis INS CP696 y Vibrio cholerae serotipo Inaba INS, de acuerdo al método del cilindro en placa (Grove y Randall,1955).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los resultados de la estabilidad de la enzima a diferentes pH, en el veneno crudo, se muestran en la Tabla 1. Se observa que la enzima es estable a pH 5, 6 y 7, mientras que a pH 8 y 9 la actividad se pierde rápidamente. Esto nos permitió seleccionar el buffer acetato de amonio 0,1 M a pH 6 para realizar el aislamiento de la enzima. El procedimiento desarrollado para aislar la L-aminoácido oxidasa comprendió el uso de una columna de Sephadex G-100 seguida de un intercambio catiónico en CM-Sephadex C-50, lográndose finalmente una purificación de 29,3 veces y un rendimiento de 30,9%, tal como se muestra en la Tabla 2. Al pasar el veneno crudo a través de la columna de Sephadex G-100 se obtuvo un perfil cromatográfico con 3 picos de proteína (Figura 1), y se encontraron las fracciones con actividad de L-aminoácido oxidasa en el primer pico. Cuando estas fracciones se pasaron a través de la columna de CM-Sephadex C-50, se obtuvieron dos picos de proteína eluídos directamente y un pico adicional al usar el buffer de elusión con NaCl 1 M (Figura 2); se encontró la mayor actividad enzimática en el segundo pico. El hecho de que la actividad de la enzima se detecte en el primer pico de proteína obtenido en la cromatografía usando Sephadex G-100, y de que eluya directamente de la columna de CM-Sephadex C-50 a pH 6, nos revela que se trata de una de las proteínas de mayor peso molecular del veneno y que además posee un punto isoeléctrico (pI) menor a 6, respectivamente. El método de purificación usado, además de su sencillez, nos ofrece la ventaja de que el primer paso de purificación constituye también la etapa inicial para el aislamiento de otras enzimas tales como fosfolipasa, similar a trombina y fibrinogenolítica (Zeballos, 1996; Liman et al., 1996; Azañero, 1996).

Figura 3. PAGE-SDS de la L-aminoácido oxidasa aislada del veneno de B. brazili. En los carriles 1 y 4 se observan los estándares de peso molecular: albúmina (66 kd), ovoalbúmina (45 kd) y lisozima (54,3 kd). En los carriles 2 y3 se muestra la enzima reducida (59, 9 kd) y no reducida (54,3 kd), respectivamente.

El análisis de pureza efectuado por PAGE-SDS mostró una sola banda proteica (Figura 3), y los resultados de la inmunodifusión e inmunoelectroforesis mostraron una sola línea de precipitación para la enzima aislada (Figura 4).

Figura 4. Inmunodifusión e inmunoelectroferesis. Se observan las líneas de precipitación obtenidas luego de la inmunodifusión (parte superior), e inmunoelectroferesis (parte inferior). A: L- a,inoácido oxidasa, B: veneno crudo de B. brazili, C: peroxidasa de rabanito, y D: suero antibotrópico polivalente

 

El peso molecular de la enzima calculado por cromatografía de filtración fue de 125,7 kd y por PAGE-SDS en condiciones reductoras y no reductoras, 59,9 kd y 54,3 kd respectivamente. Esto nos sugiere que la L-aminoácido oxidasa de B. brazili es un dímero no covalente con un peso molecular de 125,7 kd, y cadenas polipeptídicas de 59,9 kd cada una, las cuales tienen al menos un enlace disulfuro intracatenario. El peso molecular calculado está dentro del intervalo de pesos moleculares descritos para L-aminoácido oxidasas, de otros venenos de serpientes (Iwanaga y Suzuld,1979).

El contenido de hexosas, hexosaminas y ácido siálico fue de 1,86, 0,47 y 0,31% respectivamente en el veneno crudo, y 15,7, 2,40 y 0,74% respectivamente, en la enzima purificada. Esto nos revela que la enzima es una glicoproteína, hecho evidenciado también en las enzimas de Crotalus adamanteus (Dekok y Rawitch, 1969), Lachesis muta (Sinchez y Magalhaes, 1991) y Ophiophagus hannah (Li et al., 1994). Las cadenas de oligosacáridos de la enzima no sólo modularían sus, propiedades fisicoquímicas, tales como solubilidad, viscosidad, estabilidad y carga, sino que también la protegerían de la proteólisis, teniendo en cuenta el entorno fuertemente proteolítico de la enzima en el veneno (Dos Santos et al., 1993).

La enzima se mostró resistente al tratamiento térmico hasta los 55 oC, reduciendo su. actividad al 43,02% a los 65 oC y perdiéndola totalmente a los 75 oC (Figura 5). Esto contrasta con lo hallado para la L-aminoácido oxidasa de la serpiente Agkistrodon piscivorus, en la que el grado de inactivación por la temperatura se incrementa progresivamente de 25 a 45 oC (Minton y Minton, 1970).

El ß-mercaptoetanol, agente reductor capaz de escindir enlaces disulfuro, inhibió la actividad de la enzima purificada en un 93 y 94% a 10 y 20 mM respectivamente, de lo que se infiere que los enlaces disulfuro intracatenarios demostrados por PAGE-SDS son esenciales para mantener su estructura y función.

Figura 5. Termoestabilidad de la L-aminoácido axidasa de B.Brazil.

Al estudiar el pH óptimo de la enzima se encontraron 6 diferentes curvas de pH, dependiendo del aminoácido usado como substrato. El pH óptimo con leucina, metionina y fenilalanina fue de 8,5, con isoleucina fue 8, con triptofano fue 7,5 y con lisina 9,0. Estas diferentes curvas de pH son la resultante, del comportamiento ácido base de la enzima frente a los distintos comportamientos ácido base de los substratos. En el pH óptimo, tanto, la enzima como el substrato exhiben un equilibrio iónico en particular que permite que exista la mayor probabilidad de que el substrato encaje, sea mantenido firmemente en el centro activo y está orientado correctamente respecto a los grupos catalíticos de la enzima, para que tenga lugar la reacción.

Como en la mayoría de las enzimas, las curvas de pH óptimo obtenidas son acampanadas. Esto es el resultado de las titulaciones de por lo menos dos grupos funcionales presentes en el sitio activo de la enzima. Se observa que en la mayoría de los casos se obtiene un 50% de actividad enzimática en las partes ascendentes de las curvas a pH 7 y 7,5 y en las partes descendentes a pH 9,5 y 10, lo que nos sugiere que la actividad de la L-aminoácido oxidasa depende de residuos de aminoácidos cuyos grupos funcionales en el sitio activo tienen valores de pK alrededor de 7 y 10. El grupo imidazol de la histidina ha sido sugerido en otras L-aminoácido oxidasas como parte del centro activo, en base a estudios cinéticos comparativos usando H20 y D 20 (Page y Etten,1971), estudios de inactivación reversible (Coles et aL,1980) y estudios de unión de inhibidores (Dekok y Veeger, 1968).

Además tanto el veneno crudo como la enzima aislada fueron capaces de inhibir el crecimiento de S. aureus, V. cholerae y S. Faecalis (Figura 6). Este efecto, ha sido también observado son L-aminoácido oxidasas de otras serpientes tales como Crotalus adamanteus "cascabel norteamericana" (Skames, 1970) y Pseudechis australis "rey pardo australiano" (Stiles et al, 1991). La acción antibacteriana de la L-aminoácido oxidasa es atribuida al peróxido de hidrógeno generado corno producto durante la desaminación aeróbica de los L-aminoácidos, ya que otras enzimas como la glucosa oxidasa (Roberts et al., 1943) y la xantina oxidasa (Green y Pauli, 1943), que también liberan peróxido de hidrógeno durante la oxidación de sus substratos, también tienen efecto antibacteriano. No obstante la D-aminoácido oxidasa, que también libera peróxido de hidrógeno, no ostenta dicho efecto, lo que ha sido atribuido a su tendencia a polimerizar, lo cual interfiere con la obtención de una concentración letal de peróxido de hidrógeno (Meister y Wellner, 1963).

Figura 6. Acción antibacteriana del veneno crudo y de L-aminoácido oxidasa de B. brazili. En la acción sobre Staphylococcis aureus y Streptococcus faecalis, los pocillos 1, 2 y 3 contenían 6, 4 y 3 mg de L-aminoácido oxidasa, y los pocillos 4, 5 y 6 contenían 50, 25 y 10 g de veneno crudo, respectivamente. En la acción sobre Vibrio cholerae, los pocillos 1,2 y 3 contenían 50, 25 y 10 mg de veneno crudo, mientras que los pocillos 4, 5 y 6 contenían 6, 4 y 3 mg de L- aminoácido oxidasa, respectivamente.



Ver referencias

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1. Laboratorio de Biología Molecular. Facultad de Ciencias Biológicas. UNMSM.
2. Laboratorio de Fisiología y Ecología Microbiana. Facultad de Ciencias Biológicas. UNMSM.

 


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