Revista Peruana de Biología
Vol. 6 • Nº 1 • 1999 |
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PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN
DE LA L-AMINO ÁCIDO OXIDASA DEL VENENO DE LA SERPIENTE Bothrops brazili "JERGÓN
SHUSHUPE"
Christian Solís1, Enrique Escobar1,
Armando Yarlequé1 y Susana Gutiérrez2.
RESUMEN
Se ha purificado y caracterizado parcialmente la L-aminoácido oxidasa de la serpiente
Bothrops brazili. El aislamiento se realizó usando técnicas cromatográficas en Sephadex
G-100 y CM-Sephadex C-50, utilizando como eluyente buffer acetato de amonio 0,1M pH 6. La
enzima fue purificada 29,3 veces con un rendimiento de 30,9%. Usando electroforesis en gel
de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (PAGE-SDS) en condiciones reductoras y no
reductoras, así como las técnicas de inmunodifusión e inmunoelectroforesis, se
demostró la presencia de una sola banda proteica. La enzima fue caracterizada como una
glicoproteína ácida con un peso molecular de 125,7 kd formada por dos subunidades de
59,9 kd unidas por enlaces débiles, con un pH óptimo entre 7,5 y 9, dependiendo del
aminoácido usado como substrato; siendo termoestable hasta los 550 C y lábil a pH
alcalino. Asimismo, los ensayos por el método del cilindro en placa de Grove demostraron
el efecto antibacteriano de la proteína aislada en cepas estandarizadas de Staphylococcus
aureus, Vibrio cholerae y Streptococcus faecalis.
Palabras claves: L-aminoácido oxidasa, Bothrops brazili, veneno, antibacteriano,
proteína.
ABSTRACT
An L-aminoacid oxidase was purified from Bothrops brazili snake venom using Sephadex G-100
and CM-Sepahdex C?50 chromatographic method; in both cases 0,1M ammonium acetate pH 6 was
used as a eluted. The enzyme was purified 29,3 fold with 30,9% of yield. A homogeneus
protein band was achieved by PAGE-SDS, inmunodifusion as well as immunoelectrophoresis.
The enzyme was an acid glicoprotein with a molecular weight of 125,7 kd consisting of two
subunits of 59,91 kd each, linked by noncovalent bonds. The optimum pH was in the range of
7,5 to 9,0 depending on the L-aminoacid used as substrate. It was a thermoestable protein
untill 55 oC, but its activity decreased by alcaline treatment. On the other hand,
antibacterial assays using the Grove's method demonstrated that the whole venom as well as
its purified enzyme produced a severe action on standardized grown cultures of
Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae and Streptococcus faecalis.
Key words: L-amino acid oxidase, Bothrops brazili, venom, antibacterial, protein.
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INTRODUCCIÓN
Las L-aminoácido oxidasas (EC.1.4.3.2) catalizan la desaminación oxidativa de los
L-aminoácidos y producen un cetoácido, amoníaco y peróxido de hidrógeno. Estas
enzimas están ampliamente distribuidas en la naturaleza y han sido descritas en
bacterias, levaduras, hepatopáncreas de moluscos, huevos de gusano de seda, riñones de
mamíferos, hígado de aves y mamíferos, y venenos de algunos reptiles, incluyendo
ofidios de las familias Elapidae y Viperidae (Meister, 1965; Nakano et al., 1969; Stiblova
y Kornalick,1967; Tu, 1977).
A pesar de que su función biológica ha sido poco comprendida, esta enzima posee una
potencial utilidad en la investigación bioquímica, y ha sido utilizada en la
identificación de L-aminoácidos (Avrameas y Uriel, 1965), en la preparación de
a-cetoácidos (Buckey y Porges,1956), en la obtención de FAD (Singer y Kearney, 1950), en
la obtención de D-aminoácidos (Parikh et al.,1951) y en la determinación de la
actividad de otras enzimas, como las peptidasas (Donlon y Fottrell, 197 1).
En venenos de serpientes, su rol aunque aún poco estudiado, podría estar relacionado con
la degradación de aminoácidos durante la digestión, así como con la protección contra
microorganismos presentes en la presa ingerida (Yarlequé et al, 1997). El color amarillo
característico de algunos venenos se debe a la presencia de esta enzima, ya que ella
posee FAD como cofactor.
Nuestras investigaciones previas sobre la acción antibacteriana de la L-aminoácido
oxidasa encontrada en los venenos de Lachesis muta, B. atrox y B. pictus (Yarlequé et
al., 1997), motivaron el presente estudio, destinado a caracterizar la enzima en la
ponzoña de B. brazili, serpiente que habita en la selva norte del Perú y que, por el
gran volumen de veneno que puede producir (2-4 ml), constituye una fuente biológica de
especial interés en la búsqueda de principios bioactivos de utilidad médica.
MATERIAL Y MÉTODOS
En esta investigación se utilizó veneno crudo de ejemplares adultos de la serpiente B.
brazili, procedentes de la zona del Alto Marañón y mantenidos en cautiverio en el
serpentario Oswaldo Meneses del Museo de Historia Natural de la Universidad Nacional Mayor
de San Marcos. El veneno extraído por presión manual de las glándulas fue liofilizado y
conservado a -8°C.
Tabla 1.
Estabilidad diferentes pH de la L-aminoácido oxidasa del veneno crudo de B. brazil
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pH |
% de
actividad enzimática |
0 horas |
48 horas |
96 horas |
5 |
99,19 |
100,61 |
99,16 |
6 |
100,00 |
110,41 |
103,55 |
7 |
92,73 |
100,93 |
99,19 |
8 |
82,46 |
0,00 |
0,00 |
9 |
10,17 |
0,00 |
0,00 |
La actividad de
L-aminoácido oxidasa se determinó a 37 °C, por el método descrito en el Worthington
Enzyme Manual (1977). La mezcla de reacción contenía 50 µl de peroxidasa 0,007% y 1ml
de buffer Tris HCl 0,2 M pH 7,5 que contenía L-leucina 0,1% y O-dianisidina 0,0065%.
Luego de agregar 25 µl de la enzima, se midió el incremento de la absorbancia a 436 nm.
La actividad específica se expresó en U/mg de proteína. Una unidad, oxida 1µmol de
L-leucina por minuto en las condiciones especificadas.
La estabilidad al pH de la enzima en el veneno crudo se determinó usando buffer acetato
de amonio 0,1 M pH 5, 6 y 7, y buffer Tris HCI 0,1 M pH 8 y 9. En cada caso se mezcló 0,8
ml de buffer y 0,2 ml del veneno crudo 5 mg/ml a temperatura ambiente, y se midió la
actividad enzimática a las 0,48 y 96 horas.
La purificación de la enzima se hizo a partir de 75 mg de veneno liofilizado disueltos en
1,5 ml de buffer acetato de amonio 0,1 M pH 6 y centrifugados a 4000 rpm durante 15
minutos. 1 ml del sobrenadante fue aplicado a una columna de Sephadex G-100 (1,2 x 50 cm)
equilibrada con el mismo buffer y a un flujo de 7 ml/h. Se colectaron fracciones de 2ml,
determinándose en ellas la concentración de proteína y la actividad de L-aminoácido
oxidasa. Las fracciones con mayor actividad específica fueron reunidas y aplicadas a una
columna de CM-Sephadex C-50 (1,8 x 13,8 cm) equilibrada con el buffer anterior y a un
flujo de 17 ml/h. Las proteínas retenidas en la columna fueron eluídas con el mismo
buffer que contenía NaCl 1,0 M. Se colectaron fracciones de 1 ml y aquellas con actividad
de L-aminoácido oxidasa fueron utilizadas para su estudio.
Durante la purificación, la proteína se determinó a 280 nm por el método de Warburg y
Christian (1941). En la enzima purificada, el contenido de proteína fue estimado por el
método de Lowry, usándose albúmina bovina como referencia (Lowry et al., 1951).
Tabla 2.
Tabla de purificación de la L-aminoácido oxidasa de B. brazil
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Etapa |
Proteína
(mg) |
Act.Esp.
(U/mg) |
Unid Tot.
Actv |
Purificación |
Rendimiento
(%) |
Crudo |
54,45 |
0,19 |
10,81 |
1,0 |
100,00 |
Sephadex G-100 |
4,70 |
1,07 |
5,04 |
5,4 |
46,7 |
CM-Sephadex
C-50 |
0,59 |
5,58 |
3,33 |
29,3 |
30,9 |
Con la finalidad de
evaluar la pureza y el peso molecular de la enzima, se empleó electroforesis en gel de
poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (PAGE-SDS) en presencia y ausencia de
P-mercaptoetanol (Weber y Osborn, 1969). La pureza de la enzima también se determinó por
inmunoelectroforesis e inmunodifusión (Ouchterlony y Nilsson, 1986). El peso molecular de
la enzima fue calculado además por cromatografía de filtración (Andrews, 1964)
utilizando una columna de Sephadex G-200 (2,1 x 16,1 cm) equilibrada con acetato de amonio
0,1 M pH 6.
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Figura 1.
Fraccionamiento del veneno de B. brazil en Sephadex G-100 y separación de la
L-amioácido oxidasa |
En cuanto al contenido de
carbohidratos presentes en la enzima aislada, las hexosas fueron determinadas por el
método de Dubois et aL (1956), mientras que las hexosaminas se determinaron por el
método de Winsler (1955). La determinación de ácidos siálicos se hizo de acuerdo al
método de Warren (1959).
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Figura 2. Aislamiento
de la L-aminoácido oxidasa en CM-Sephadex C-50 |
Para estudiar la
termoestabilidad de la enzima, se preincubaron alícuotas de 30 µl entre 37 y 95 °C
durante 10 minutos, luego de lo cual se enfriaron bruscamente a 4 °C durante 3 minutos
para medir la actividad enzimática.
El efecto del ß-mercaptoetanol se evaluó preincubando a 37 °C durante 15 minutos, 20
µl de la enzima con 20 µl de ß-mercaptoetanol (10 y 20 mM), luego de lo cual se midió
la actividad enzimática con 30 µl de la mezcla.
El pH óptimo de la enzima se determinó usando los siguientes L-aminoácidos como
sustratos: leucina, metionina fenilalanina, triptofano, lisina e isoleucina. Para los
ensayos se utilizaron los buffers acetato de amonio, Tris-HCl y glicina a concentración
de 0,1 M y en un rango de pH de 5 a 11.
Para estudiar el efecto antibacteriano del veneno crudo y la enzima purificada, se usaron
cepas de Staphylococcus aureus ATCC 6538, Streptococcus faecalis INS CP696 y Vibrio
cholerae serotipo Inaba INS, de acuerdo al método del cilindro en placa (Grove y
Randall,1955).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los resultados de la estabilidad de la enzima a diferentes pH, en el veneno crudo, se
muestran en la Tabla 1. Se observa que la enzima es estable a pH 5, 6 y 7, mientras que a
pH 8 y 9 la actividad se pierde rápidamente. Esto nos permitió seleccionar el buffer
acetato de amonio 0,1 M a pH 6 para realizar el aislamiento de la enzima. El procedimiento
desarrollado para aislar la L-aminoácido oxidasa comprendió el uso de una columna de
Sephadex G-100 seguida de un intercambio catiónico en CM-Sephadex C-50, lográndose
finalmente una purificación de 29,3 veces y un rendimiento de 30,9%, tal como se muestra
en la Tabla 2. Al pasar el veneno crudo a través de la columna de Sephadex G-100 se
obtuvo un perfil cromatográfico con 3 picos de proteína (Figura 1), y se encontraron las
fracciones con actividad de L-aminoácido oxidasa en el primer pico. Cuando estas
fracciones se pasaron a través de la columna de CM-Sephadex C-50, se obtuvieron dos picos
de proteína eluídos directamente y un pico adicional al usar el buffer de elusión con
NaCl 1 M (Figura 2); se encontró la mayor actividad enzimática en el segundo pico. El
hecho de que la actividad de la enzima se detecte en el primer pico de proteína obtenido
en la cromatografía usando Sephadex G-100, y de que eluya directamente de la columna de
CM-Sephadex C-50 a pH 6, nos revela que se trata de una de las proteínas de mayor peso
molecular del veneno y que además posee un punto isoeléctrico (pI) menor a 6,
respectivamente. El método de purificación usado, además de su sencillez, nos ofrece la
ventaja de que el primer paso de purificación constituye también la etapa inicial para
el aislamiento de otras enzimas tales como fosfolipasa, similar a trombina y
fibrinogenolítica (Zeballos, 1996; Liman et al., 1996; Azañero, 1996).
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Figura 3.
PAGE-SDS de la L-aminoácido oxidasa aislada del veneno de B. brazili. En los carriles 1 y
4 se observan los estándares de peso molecular: albúmina (66 kd), ovoalbúmina (45 kd) y
lisozima (54,3 kd). En los carriles 2 y3 se muestra la enzima reducida (59, 9 kd) y no
reducida (54,3 kd), respectivamente. |
El análisis de pureza
efectuado por PAGE-SDS mostró una sola banda proteica (Figura 3), y los resultados de la
inmunodifusión e inmunoelectroforesis mostraron una sola línea de precipitación para la
enzima aislada (Figura 4).
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Figura 4. Inmunodifusión
e inmunoelectroferesis. Se observan las líneas de precipitación obtenidas luego de la
inmunodifusión (parte superior), e inmunoelectroferesis (parte inferior). A: L-
a,inoácido oxidasa, B: veneno crudo de B. brazili, C: peroxidasa de rabanito, y D: suero
antibotrópico polivalente |
El peso molecular de la enzima calculado
por cromatografía de filtración fue de 125,7 kd y por PAGE-SDS en condiciones reductoras
y no reductoras, 59,9 kd y 54,3 kd respectivamente. Esto nos sugiere que la L-aminoácido
oxidasa de B. brazili es un dímero no covalente con un peso molecular de 125,7 kd, y
cadenas polipeptídicas de 59,9 kd cada una, las cuales tienen al menos un enlace
disulfuro intracatenario. El peso molecular calculado está dentro del intervalo de pesos
moleculares descritos para L-aminoácido oxidasas, de otros venenos de serpientes (Iwanaga
y Suzuld,1979).
El contenido de hexosas, hexosaminas y ácido siálico fue de 1,86, 0,47 y 0,31%
respectivamente en el veneno crudo, y 15,7, 2,40 y 0,74% respectivamente, en la enzima
purificada. Esto nos revela que la enzima es una glicoproteína, hecho evidenciado
también en las enzimas de Crotalus adamanteus (Dekok y Rawitch, 1969), Lachesis muta
(Sinchez y Magalhaes, 1991) y Ophiophagus hannah (Li et al., 1994). Las cadenas de
oligosacáridos de la enzima no sólo modularían sus, propiedades fisicoquímicas, tales
como solubilidad, viscosidad, estabilidad y carga, sino que también la protegerían de la
proteólisis, teniendo en cuenta el entorno fuertemente proteolítico de la enzima en el
veneno (Dos Santos et al., 1993).
La enzima se mostró resistente al tratamiento térmico hasta los 55 oC, reduciendo su.
actividad al 43,02% a los 65 oC y perdiéndola totalmente a los 75 oC (Figura 5). Esto
contrasta con lo hallado para la L-aminoácido oxidasa de la serpiente Agkistrodon
piscivorus, en la que el grado de inactivación por la temperatura se incrementa
progresivamente de 25 a 45 oC (Minton y Minton, 1970).
El ß-mercaptoetanol, agente reductor capaz de escindir enlaces disulfuro, inhibió la
actividad de la enzima purificada en un 93 y 94% a 10 y 20 mM respectivamente, de lo que
se infiere que los enlaces disulfuro intracatenarios demostrados por PAGE-SDS son
esenciales para mantener su estructura y función.
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Figura 5. Termoestabilidad
de la L-aminoácido axidasa de B.Brazil. |
Al estudiar el pH óptimo
de la enzima se encontraron 6 diferentes curvas de pH, dependiendo del aminoácido usado
como substrato. El pH óptimo con leucina, metionina y fenilalanina fue de 8,5, con
isoleucina fue 8, con triptofano fue 7,5 y con lisina 9,0. Estas diferentes curvas de pH
son la resultante, del comportamiento ácido base de la enzima frente a los distintos
comportamientos ácido base de los substratos. En el pH óptimo, tanto, la enzima como el
substrato exhiben un equilibrio iónico en particular que permite que exista la mayor
probabilidad de que el substrato encaje, sea mantenido firmemente en el centro activo y
está orientado correctamente respecto a los grupos catalíticos de la enzima, para que
tenga lugar la reacción.
Como en la mayoría de las enzimas, las curvas de pH óptimo obtenidas son acampanadas.
Esto es el resultado de las titulaciones de por lo menos dos grupos funcionales presentes
en el sitio activo de la enzima. Se observa que en la mayoría de los casos se obtiene un
50% de actividad enzimática en las partes ascendentes de las curvas a pH 7 y 7,5 y en las
partes descendentes a pH 9,5 y 10, lo que nos sugiere que la actividad de la L-aminoácido
oxidasa depende de residuos de aminoácidos cuyos grupos funcionales en el sitio activo
tienen valores de pK alrededor de 7 y 10. El grupo imidazol de la histidina ha sido
sugerido en otras L-aminoácido oxidasas como parte del centro activo, en base a estudios
cinéticos comparativos usando H20 y D 20 (Page y Etten,1971), estudios de inactivación
reversible (Coles et aL,1980) y estudios de unión de inhibidores (Dekok y Veeger, 1968).
Además tanto el veneno crudo como la enzima aislada fueron capaces de inhibir el
crecimiento de S. aureus, V. cholerae y S. Faecalis (Figura 6). Este efecto, ha sido
también observado son L-aminoácido oxidasas de otras serpientes tales como Crotalus
adamanteus "cascabel norteamericana" (Skames, 1970) y Pseudechis australis
"rey pardo australiano" (Stiles et al, 1991). La acción antibacteriana de la
L-aminoácido oxidasa es atribuida al peróxido de hidrógeno generado corno producto
durante la desaminación aeróbica de los L-aminoácidos, ya que otras enzimas como la
glucosa oxidasa (Roberts et al., 1943) y la xantina oxidasa (Green y Pauli, 1943), que
también liberan peróxido de hidrógeno durante la oxidación de sus substratos, también
tienen efecto antibacteriano. No obstante la D-aminoácido oxidasa, que también libera
peróxido de hidrógeno, no ostenta dicho efecto, lo que ha sido atribuido a su tendencia
a polimerizar, lo cual interfiere con la obtención de una concentración letal de
peróxido de hidrógeno (Meister y Wellner, 1963).
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Figura 6.
Acción antibacteriana del veneno crudo y de L-aminoácido oxidasa de B. brazili. En la
acción sobre Staphylococcis aureus y Streptococcus faecalis, los pocillos 1, 2 y 3
contenían 6, 4 y 3 mg de L-aminoácido oxidasa, y los pocillos 4, 5 y 6 contenían 50, 25
y 10 g de veneno crudo, respectivamente. En la acción sobre Vibrio cholerae, los pocillos
1,2 y 3 contenían 50, 25 y 10 mg de veneno crudo, mientras que los pocillos 4, 5 y 6
contenían 6, 4 y 3 mg de L- aminoácido oxidasa, respectivamente. |
Ver referencias
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1. Laboratorio de Biología Molecular.
Facultad de Ciencias Biológicas. UNMSM.
2. Laboratorio de Fisiología y Ecología Microbiana. Facultad de Ciencias Biológicas.
UNMSM.
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