MULTICOLOR FISH:
UNA HERRAMIENTA DE GRAN UTILIDAD EN EL MONITOREO DE LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA Y OTRAS
MALIGNIDADES HEMATOLÓGICAS
Carlos A.
Tirado, M.S., Ph.D.*, Bárbara K. Goodman, Ph.D.*
. RESUMEN
. INTRODUCCIÓN
. MATERIAL Y
MÉTODOS
. RESULTADOS
. DISCUSIONES
RESUMEN
La leucemia mieloide aguda es una malignidad hematológica que se presenta generalmente en
adultos mayores de 55 años, con una mayor incidencia en varones, sin embargo, también se
presenta en niños y adultos mayores.
La característica patológica principal de esta enfermedad es la acumulación excesiva de
células precancerosasno linfocíticas en la médula ósea, en sangre periférica y en
otros tejidos. De acuerdo a la anterior clasificación de FAB, la leucemia mieloide aguda
se subdivide en ocho categorías y dos tercios de los pacientes con este tipo de leucemia
presentan cariotipos anormales en la médula sea lo cual ha llevado a entender la gran
utilidad y ayuda que presta la citogenética en el diagnóstico y manejo de esta clase de
neoplasias. Es bien conocida por ejemplo, la t(8;21) en la anterior M2; la t(15; 17) en
leucemia promielocítica aguda (PML/RAR-alpha); la inv(160(pl3q22) en Leucemia Mieloide
Aguda con eosinófilos anormales en la médula ósea y la t(9,-11) en Leucemia Mieloide
Aguda con anormalidades en el cromosonia 1 lq23. Se ha encontrado también que monosomía
del cromosoma 7 y trisomía del cromosoma 8 entre otras, son anomalías estructurales
secundarias relacionadas con este grupo particular de leucemias. Sin embargo, la
citogenética convencional ha enfrentado problemas en la identificación de rearreglos
cromosómicos complejos. MULTICLOLOR FISH es una técnica que ofrece la posibilidad de
identificar cromosomas marcadores.
En el presente trabajo, presentamos el caso de un paciente en donde los estudios de
citometría de.flujo nos indican que puede tratarse de una leucemia mieloide aguda. El
bandeo G nos arrojó un cariotipo 46,XY,add (7q). Este cariotipo presentaba material extra
de procedencia no conocida, aproximadamente en la banda 35 del brazo largo del cromosoma
7. La técnica de MULTICOLOR FISH resolvió nuestro problema. Pudimos observar que el
material NO CONOCIDO venía del cromosoma 1, y que se trataba de un cromosonta derivado,
der(7)t(1 ;7)(q3 I -q31). Este arreglo no balanceado resultó en una pérdida de las
secuencias en el brazo largo del cromosoma 7 (monosomia parcial) desde aproximadamente las
bandas q31 a qter y una ganancia de secuencias en el brazo largo del cromosoma 1 (trisomia
parcial) desde aproximadamente labanda q31 a qter: El involucramiento de los cromosomas 1
y 7, corresponde a un proceso neoplásico relacionado con la leucemia mieloide aguda, El
mencionado paciente está siendo tratado y su seguimiento está siendo programado.
SUMMARY
Acute myeloid leukemia is a hematological malignancy of adults older than 55 years old
with a major incidence in males, however it is also seen in children and older adults (6).
Its main pathological characteristic is the excessive accumulation of precancerous non
lympliocytic cells in the marrow, itself in peripheral blood and in other tissues (3).
According to FAB, AML is divided in eight subtypes and two thirds of the AML patients show
abnormal karyotypes in the bone marrow which let us to understand the great help of
cytogenetics in the diagnosis and management of these kinds of leukemias. It is well known
the non-random involvement of t(8;2l) ni the old group M2; t(15;17) in acute promyelocytic
leukemia (variants and PML/RARalpha); inv(16)(p13q22) in AML, with abnormal bone marrow
eosinphils and t(9;l1) in AML with 11q23 abnormalities. It has been found also monosomy 7
and trisomy 8 among other secondary structural abnormalities related to this particular
kind of leukemias,
However, conventional cytogenetics has faced problems in the identification of complex
chromosomal rearrangements. Multicolor FISH is a technique that offers the possibility to
identify marker chromosomes. In our case, we present a patient with flow cytrometric
studies showing the possibility of AML. G-banding showed a karyotype 46,XY, add(7q)
showing additional material of unknown origin at approximately band q35 of chromosome 7.
MULTICOLOR FISH solved our problem. We saw a der(7)t(1;7)(q3 I;q3 1). This unbalanced
rearrangement results in loss of long arm sequences on chromosome 7 (partial monosomy)
from q31 to qter and gain of long arm sequences of chromosome 1 (partial trisomy) from q31
to qter. Involvement of both chromosomes (1 and 7) correspond with a clonal neoplastic
process and correlates with AML. The patient is being treated and future follow ups
programmed.
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La leucemia
mieloide aguda es una de las malignidades hematológicas con una incidencia de
aproximadamente 4 casos por 100,000 individuos por año, siendo muy predominante en
adultos mayores de 55 a 60 años, presentando una mayor incidencia en varones.
La característica patológica de la leucemia mieloide aguda es la acumulación excesiva
de células precancerosas inmaduras no linfocíticas en médula, en sangre periférica y a
veces en otros tejidos. Esto tal vez tenga su origen en una actividad proliferativa
incrementada o en una reducida muerte celular. Estudios genéticos indican que este
último mecanismo, es en la mayoría de las veces más importante que la tasa de
proliferación excesiva, puesto que simultáneamente, se genera además, un bloqueo en la
maduración de las células mieloides, previniéndolas de entrar hacia una de las rutas de
diferenciación: Granulocitos maduros (neutrofilos, eosinofilos, basofilos), monocitos,
eritrocitos y megacariocitos.
Este proceso de maduración-diferenciación es visto como un desarrollo unidireccional de
células madres pluripotentes a unipotentes, las cuales luego maduran en células
especializadas efectoras. El efecto neoplásico probablemente se realiza a nivel de
células madre, aunque posiblemente en una cascada totalmente orquestada, originando una
expansión leucémica clonal (3).
Varios acuerdos han sido hechos para clasificar la leucemia mieloide aguda en base alas
similitudes entre las células leucémicas y las células precursoras que pueden ser
identificadas en los variados niveles de desarrollo en una hematopoiesis normal.
Originalmente se reconocían 8 subtipos de AML (FAB), todos dependiendo del camino de
diferenciación predominante y del grado de maduración mostrado en las células
leucémicas (3).
Actualmente, según la clasificación WHO (6), el espectro de las leucemias mieloides
agudas es más amplio; pero al menos dos tercios de todos los pacientes con AML presentan
anormalidades cariotípicas en la médula ósea, lo cual ha permitido comprender el gran
papel que juega la citogenética en el diagnóstico y monitoreo de este tipo de neoplasias
asi como en otras malignidades hematológicas. Podemos ver, que estas anomalías
CROMOSÓMICAS no son generadas al azar y están relacionadas con cada subgrupo de
leucemias mieloides agudas. La t(8;2l) se presenta típicamente en la anteriormente
llamada M2; la t(15; 17) en leucemia aguda promielocítica, anteriormente conocida como
M3; la inv(16)(pl3q22) en Leucemia Mieloide Aguda con eosinófilos anormales en la
médula; la t(9; 11) en Leucemia Mieloide Aguda con anormalidades en el cromosoma 11q23.
La mayoría de estas translocaciones han sido estudiadas en términos moleculares, puesto
que generalmente dan origen a genes híbridos con alto poder de disrupción del ciclo
celular normal. También tenemos que trisomía 8 y monosomía 7, son frecuentes hallazgos
secundarios en AML; ambos como cambios únicos o en adición a anomalías estructurales no
randomizadas. Los cambios secundarios característicos en AML son: -7, del(5q), der(3q),
der(11q), der(12p), del(7q) , der(l;7), además de anomalías estructurales en los
cromosomas 9, 22 e Y.
Podemos ver que la Citogenética ha jugado un papel muy importante en las clasificaciones
FAB y WHO de Leucemia Mieloide Aguda, sin embargo presenta limitaciones en el
reonocimiento de cromosomas marcadores, los cuales son muy comunes en neoplasia.
Cariotipos complejos con anormalidades primarias y secundarias que contengan cromosomas
derivados de origen sospechoso, son difíciles de identificar con el bandeo convencional
G. Es por ello, que la Hibridacion in situ Multicolor (MULTICOLOR FISH), la cual es una
técnica derivada de la Hibridacion In Situ con Fluorescencia, y en donde se usa un
cocktail de 24 sondas para detectar todo el cromosoma, se está convirtiendo en una
herramienta indispensable en el reconocimiento de cromosomas marcadores y de complejas
translocaciones y arreglos estructurales.
Multicolor FISH fue introducido en 1996, para analizar todos los 24 cromosomas en
diferentes colores fluorescentes mediante el uso de un set de filtros y un programa
software computarizado. Todas las sondas para identificar los 24 cromosomas están
marcadas con un set de cinco fluorocromos diferentes: 1x verde, 2x rojo, 2x infrarojo. A
cada cromosoma se le asigna una combinación de fluorocromos única, y por tanto un
espectro de emisión altamente característico, el mismo que es usado para definir el
reconocimiento de cada uno de los 23 pares de cromosomas. Sin embargo, la utilidad
clínica del M-FISH se ha visto limitada a la falta de disponibilidad de los reactivos y
al alto costo del programa de software, convirtiéndola en una técnica bastante costosa
(2,7).
En el presente caso, mostramos a un paciente con historia de leucemia mieloide aguda,
quien está siendo evaluado para aplicársele el respectivo tratamiento. Los estudios de
citometría de flujo en este paciente, revelaron que que las células presentaban algunos
rasgos de diferenciación monocítica, mostrando una positividad CD4 y una positividad
parcial CD 14. Se sugirió una AML M5a or MO, de acuerdo a la clasificacion FAB.
El análisis cromosómico reveló un cariotipo: 46, XY, add(7)(q35). Los estudios usando
MULTICOLOR FISH, arrojaron la identificación del material adicional en el crornosoma 7,
el mismo que fue identificado como der(7) t(l;7) (q3l;q3l). Este rearreglo cromosómico no
balanceado resultó en la pérdida parcial de secuencias del brazo largo del cromosoma 7
(monosomía parcial), desde las bandas q31 a qter y ganancia de las secuencias del brazo
largo del cromosoma 1 (trisomia parcial) desde las bandas q3l a qter.
El paciente fue sometido a tratamiento y su seguimiento está siendo evaluado.
A. Bandeo GTW
Se recibió el aspirado de médula proveniente del paciente, estableciéndose cultivos
usando RPMI 1640 (Gibco, 11875-093 Life Technologies, Long Island, New York, USA) en los
cultivos ONC (tratamiento con Colcemid (10µg/ml, Gibco 15212-012), toda la noche) y medio
Chang BMC(Irvine Scientific, Santa Ana, CA, USA, C106) para los cultivos de 24 y 48 horas.
Ambos medios estaban enriquecidos con glutamina 0.01% (L-glutamine, 100x, 29.2 mg/ml,
Gibco 25030-081), antibióticos 1%(Pen-Strep, 10,000 U/ml, Gibco 15140-122), suero fetal
bovino, 15% (Gibco, 10099-133).
Se procedió a la cosecha de los cultivos siguiendo los métodos estándares en
citogenética. Bromuro de Etidio (100µ1)(Ethidium Bromide, Sigma E8751), 5mg/ml, fue
agregado a los cultivos de 24 horas por 45 minutos. Todos los cultivos recibieron Colcemid
(50µl)(Gibco, Life Technologies, Long Island) en una proporción de 16µl por 2ml de
medio, por 45 minutos, seguido de un shock hipotónico (KCI 0.075M) por 20 minutos y
fijación en solución carnoy (3 metanol: 1 ácido acético glacial).
Las láminas fueron preparadas siguiendo el método de goteo y teñidas con colorante
Wright 4%, previa tripsinisación (tripsina, 2.5%, l0x solution, Irwine Scientific 9336)
por 25 segundos (5).
Se analizaron 20 metafases. Las células fueron capturadas y los cariotipos preparados
usando el sistema computarizado de Cytovision Computer-Assisted Karyotyping System
(Applied Imaging, Santa Clara, CA).
Los cariotipos fueron impresos en una impresora laser (Lexmark) y las anomalías
cromosómicas fueron reportadas de acuerdo a la nomenclatura ISCN 1995 (4).
B. Multicolor fish
Hibridación in situ multicolor (Multicolor FISH), la cual usa 24 sondas para identificar
todos los cromosomas y complejos rearreglos a la vez, fue aplicada usando reactivos
Spectra Vysion de Vysis, Inc (Downers Grove, IL) y el programa software Quips Spectra
Vysion TM 24 color FISH IMAGING de applied Imaging Corporation.
Las láminas fueron incubadas en 2xSSC a 37°C por 30 minutos, luego hidratadas a través
de una batería de alcoholes (70%, 85% y 100%). No se les practicó ningún
pretratamiento. Estas láminas fueron denaturadas en una solución conteniendo formamida
70% en 2XSSC a 72°C por cinco minutos y nuevamente hidratadas en una bateria similar de
alcoholes. La sonda usada fue preparada de acuerdo a las instrucciones en el Catálogo de
manufactura. La incubación fue realizada por 48 horas a 37°C usando
una cámara húmeda. (Figura
1)
La detección se realizó usando DAPI I11 como medio contrastante.
A. Bandeo GTW
Los hallazgos citogenéticos revelaron un cariotipo anormal 46, XY, add(7)(q35) en las 20
células examinadas. Estos resultados están resumidos en la Figura 1 y 2. Se encontró
material adicional de origen desconocido en el cromosorna 7,
aproximadamente en la banda 7q35.
(Fig 2)
B. Multicolor FISH
La figura 3, nos permitió discernir que el material extra en el cromosoma 7 es en
realidad un cromosoma derivado: der(7)t(1;7)(q3 1;q3 1).
Este arreglo cromosómico no balanceado resultó en la pérdida de un segmento en el brazo
largo del cromosoma 7 (lo cual produce una monosomía parcial) desde aproximadamente la
banda q3l hasta qter y una ganancia de las secuencias del brazo largo del cromosoma 1, lo
cual produce una trisomía parcial, desde aproximadamente las bandas q31 hasta las bandas
qter.
La hibridación in situ
multicolor parece ser una gran herramienta para complementar los estudios citogenéticos
usando bandeo convencional G.
La hibridación in situ ofrece de por si, una gran ayuda en el reconocimiento de
anomalías numéricas usando sondas centroméricas o usando sondas que pintan todo el
cromosoma (whole chromosome painting probes) especialmente en el reconocimiento de
cromosomas marcadores que contienen material no identificable con el bandeo G.
El uso de MULTICOLOR FISH ha permitido en nuestro caso, discernir un rearreglo diferente
al típico der(7)t(1;7)(q1O;qlO) que está mayormente identificado con M4 (FAB) y con
síndromes mielodisplásicos (3).
Nuestro hallazgo corroboró el involucramiento de los eromosomas 1 y 7, caracterítico de
leucemia mieloide aguda, arreglo estructural que no fue identificado con el bandeo
convencional G.
Encontramos además que M-FISH es una herramienta de gran valor para el reconocimiento de
cromosomas marcadores y cariotipos complejos, debido al alto grado de precisión en la
identificación de los mismos. Las limitaciones de esta técnica son similares a las de
Spectral karyotype Imaging (SKY) e incluyen la habilidad de detectar anomalías
intracromosómicas, anormalidades involucrando los brazos cortos de los cromosomas
acrocéntricos en áreas ricas en ADN altamente repetitivo. A esto se suma, el hecho de
correr el riesgo de misinterpretación, en el caso de que los cromosomas se encuentren
sobrepuestos en la metafase o en el caso de translocaciones sutiles, se corre el riesgo de
no reconocerlas especialmente cuando se genera una sobreposición de las combinaciones de fluorocromos (1). (Figura 3)
Bibliografía
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* Laboratory of
Cytogenetics, Department of Patho1ogy-Duke University Medical Center Durham, North
Carolina - USA.
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