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Las vías de señalización trasladan las señales extracelulares de la superficie celular al núcleo. Una molécula señalizadora que se encuentra en el exterior de la célula interactúa con un receptor ubicado en la superficie extracelular de la membrana celular, seguida por la interacción del receptor con componentes de la vía intracelular, iniciando una cascada de interacciones entre proteínas que expanden la señal en el interior de la célula hacia el núcleo, donde un grupo de proteínas, llamado factores de transcripción, juega un rol crucial en la activación de la expresión genética (6,7).
Después que una señal ha sido trasmitida de la superficie celular al núcleo, los factores de transcripción responden uniéndose a específicas regiones del ADN presentes en los promotores de los genes, para incrementar su expresión, la cual se manifiesta a nivel de la síntesis del ARN (transcripción). Diversas familias de factores de transcripción, entre los cuales estan AP-1 (activator protein l), NF-kB (nuclear factor-kB), STAT (signal transclucer and activator of transcription), p53 tumor suppressor, Sps, Smads y otros han sido implicadas como reguladoras críticas de la expresión genética en el contexto de la inflamación (8,9,10). La presente revisión se enfoca en uno de los factores de transcripción mas implicado en estos procesos, el NF-kB, en su papel en ¡a inflamación y en su modificación a través del empleo de agentes terapéuticos actualmente en uso y futuras estrategias terapéuticas.
Las proteínas NF-kB son una familia de factores de trascripción expresados universalmente que juegan un rol esencial en muchas respuestas inflamatorias y en la protección de las células contra la apoptosis. También, tienen un rol importante en la señalización intercelular durante el desarrollo normal de los vertebrados, aunque las señales extracelulares que activan NF-kB en estas circunstancias no son completamente conocidas.
En mamíferos, la familia del NF-kB consiste de 5 miembros: RelA (p65), ReIB, c-Rel, NF-kBl (p50 y su precursor p105) y NF-kB2 (p52 y su precursor p100). Estas proteínas se asocian formando una diversidad de homodímeros y heterodímeros, cada uno de los cuales activa su propio grupo característico de genes. Asimismo, los 5 miembros de la familia NFkB comparten un dominio de 300 aminoácidos que es conocido como el dominio homólogo Re¡ que media sus uniones con el ADN, así como, sus dimerizaciones y translocaciones dentro del núcleo (11,12,13,14). El heterodímero formado entre RelA (p65) y p50 es la forma activa mas prevalente, sin embargo, la diversa regulación de los promotores dependientes de NF-kB se debe a la habilidad de diferentes dímeros de unirse a los mismos o distintos sitios de NF-kB en una manera que es célula específica y estímulo-dependiente. (15,16).
El NF-kB existe en el citoplasma de casi todas las células de los mamíferos en una forma inactiva debido a la asociación con las proteínas inhibitorias IkB (inhibitory kB) las cuales incluyen IkBa, IkBb, IkBeard IkBg (11,12,13). Las proteínas IkB son caracterizadas por secuencias repetidas de ankiryna en el extremo carboxy-terminal, que son esenciales para su interacción con las proteínas NF-kB. El extremo aminoterminal contiene una sequencia conocida como "sequencia de exportación nuclear rica en leucina", la que es fundamental para el tráfico de IkB entre el citoplasma y el núcleo, interactuando con el receptor de exportación nuclear, Crm1 p. El tráfico de IkBa es probablemente un mecanismo crucial para mantener la localización citoplasmática del complejo IkBa-p50-p65. Así, si bien es cierto que la función principal de IkBa es retener el NFkB en el citoplasma de células no estimuladas, también esta envuelto en la remoción de NF-kB del núcleo. De esta manera, IkB cumple tanto funciones citoplasmáticas como nucleares en la regulación de la vía del NFkB (11,12,13,17).
Un vasto rango de estímulos, tales como las citoquinas TNF o IL-1, quemokinas, productos virales y bacterianos, radiación ultravioletas, y radicales libres, activan los dímeros de NF-kB al estimular una vía de señalización que lleva a la fosforilación de IkB, su ubiquitinación por el complejo E3 IkB ubiquitin ligase y su posterior degradación por el 26S proteasome (14,18). La fosforilación de IkB es causada por una serina/treonina kinasa especifica llamada IkB kinase (IKK). El complejo IKK consiste de por lo menos 3 subunidades, incluyendo las kinasas IKKa y IKKb (también llamadas IKK-1 and IKK-2, respectivamente) y la subunidad reguladora asociada IKK-g/NEMO. A pesar de la similitudad estructural entre IKKa y IKKb, IKKb es la kinasa dominante en la activación de NF-kB, mientras IKKa tiene un rol parcialmente redundante en la activación de NF-kB inducida por diversos estímulos.
El mecanismo por el cual las citoquinas producen activación del complejo IKK no esta todavía definido. Por lo menos dos hipótesis han sido propuestas al respecto: la primera propone que la activación de la familia de la kinasa, MAP kinase kinase kinase (MAPKKK) estimula la actividad de la IKK y la segunda, que la unión de la IKI< a los receptores ubicados en la membrana celular resulta en su autofosforilación y posterior activación. Aunque la activación de la IKK es un evento clave en la vía del NFkB, la ubiquitinación y la posterior degradación de los múltiples factores que regulan el complejo IKk son también mecanismos cruciales para la regulación de la vía del NF-kB (17,19,20,21,22).
Mientras que la IKKb activa la vía clásica del NF-kB, fosforilando IkB, la IKKa activa la forma no clásica del NFkB, fosforilando p100 para originar la posterior activación del p52. Sin embargo, una nueva función de la IKKa ha sido recientemente descubierta, la regulación de la función de las histonas que a su vez origina la activación de la vía clásica del NF-kB. Las histonas forman la cromatina que limitan el acceso de las proteinas que se unen a los promotores de los genes de respuesta temprana, como es el caso de los genes que responden a NF-kB. En respuesta a diversos estímulos ocurre la modificación de las histonas, que ocasiona la remodelación de la estructura de la cromatina permitiendo la interacción de los promotores de los genes con los factores de transcripción, tales como NF-kB, las proteínas coactivadoras y los otros componentes de la maquinaria de transcripción (23,24,25).
La degradación de IkB expone una señal de localización nuclear en el NF-kB, el cual puede entonces ser transportado dentro del núcleo donde estimula la transcripción de genes específicos. Mas de 150 genes regulados por NF-kB han sido descritos, incluyendo aquellos envueltos en inmunidad e inflamación, antiapoptosis, proliferación celular y el feedback negativo de la señal del NF-kB (14). NF-kB estimula la expresión de genes que codifican citoquinas (p.e. TNF-a, IL-1, IL-6, IL-2, IL-12, INF-g, CM-CSF), moléculas de adhesión celular (p.e. E-selectin, VCAM-I, ICAM-1), quemokinas (p.e. IL-8, macrophage inflammatory protein MIP-1 a, methyl-accepting chemotaxis protein 1 MCP1, RANTES, eolaxina), receptores (p.e. MHC) y enzimas inducibles (p.e. COX-2 iNOS). NF-kB también incrementa la expresión de moléculas importantes en la regulación de la proliferación celular, apoptosis y de la progresión del ciclo celular, tales como: el cellular inhibitor of apoptosis protein (c-IAP) 1, c-IAP2, TNF-receptor-associated factor (TRAF) 1, TRAF2, B-cell lymphocyte/leukemia-2 (Bcl-2) homólogos (AF1/BFI-1, IEX-IL), Fas, c-myc and cyclin D1 (17). Los genes cuya
expresión es inducida por NF-kB se muestran en la tabla 1.
Estudios con animales en los que se han inactivado genéticamente ciertos genes específicos demuestran funciones diferentes de los miembros de la familia del NFkB. Ratones con ausencia de p65 (Rel A) mueren durante la embriogénesis debido a apoptosis hepática. Los niveles de mRNA de IKKa y MCSF de los fibroblastos embrionarios de estos animales no se incrementan después de ser estimulados con TNF-a, aunque los niveles basales de los mismos son iguales a los de los controles (26). Inactivación del gen del p50 resulta en ratones con fenotipo casi normal, pero con una variedad de defectos inmunes específicos en la función de los linfocitos B y en la respuesta no específica a infecciones (27).
Aunque el NF-kB juega un rol benéfico esencial en la fisiología normal, regulación inapropiada de su actividad ha sido implicada en la patogénesis de varias enfermedades inflamatorias como artritis reumatoide, ateroescierosis, asma, esclerosis múltiple, polirradiculoneuritis desmielinizante inflamatoria crónica, enfermedad inflamatoria intestinal, gastritis asociada a helicobacter pylori y síndrome de respuesta inflamatoria sistémica. Asimismo ha sido asociado a otras enfermedades tales como diabetes mellitus tipo 2, cáncer, SIDA,
enfermedades degenerativas del SNC, síndrome del eutiroideo enfermo y caquexia.
Tabla 2 (28,29,30,31). Los roles benéficos y dañinos del NF-kB son mostrados en la
figura 1.
Investigaciones recientes han llegado a la conclusión de que el NF-kB es un factor fundamental en la relación entre inflamación crónica y desarrollo de cáncer, proceso que ocurre en por lo menos 15% de todos los tipos de cáncer. Debido a que el NF-kB es muy activo tanto en inflamación como en algunos cánceres se sospechaba de su posible rol como mediador en la conexión entre inflamación crónica y desarrollo de cáncer. En estudios realizados en un modelo experimental de ratón que desarrolla colitis ulcerativa asociada a cáncer colonrectal se encontró que el silenciamiento de IKKR en células mieloideas, precursoras de macrófagos, disminuyó tanto la incidencia de tumores en cerca del 50% como el tamaño de ellos; por otro lado, el silenciamiento de lKKBen células epiteliales intestinales redujo la incidencia de tumores en un 80% sin afectar el tamaño de los mismos ni la inflamación intestinal, que incluso fue más acentuada en los animales experimentales que en los controles. Así, el hecho de que la inhibición específica de IKKR, enzima importante en la activación de NF-kB, en mielocitos precursores de células inflamatorias disminuye la formación de tumores, demuestra el rol clave de NF-kB como mediador de los cambios celulares que se dan en la inflamación creando el escenario adecuado para un crecimiento incontrolado de las células cancerosas y el desarrollo de metástasis. Asimismo, se demuestra que NFkB contribuye a la formación de tumores al proveer señales de vigilancia anti-apoptótica en células epiteliales (32,33,34).
Las proteínas p50 y p65 de la familia de NF-kB son abundantes en la sinovia de pacientes con artritis reumatoide (AR) y osteoarthritis (OA) respectivamente, sin embargo la activación de NF-kB es mucho mayor en AR que en OA (35). En los tejidos sinoviales de AR y de las espondiloartropatías seronegativas (EASN) el número de células que expresan NF-kBl en las zonas de unión del cartílago con el pannus es mucho mayor que en las otras zonas; hallazgo similar fue observado en el número de células que expresan RelA en la sinovia de AR y no en la sinovia de EASN. En tejido sinovial de OA, el número de células NF-kBl + y RelA+ es similar a lo observado en las zonas diferentes a las de la unión del cartílago y el pannus en tejidos de AR y EASN (36). En pacientes con AR y OA la presencia de IKK detectada por métodos inmunoquímicos, es abundante en los sinoviocitos tipo fibroblastos, estando tanto el mRNA de IKK1 como el de IKK2 expresados constitutivamente. Después de la estimulación de estas células con TNF-a e IL-1, la activación de IKK2 es un evento clave en la vía del NF-kB para la expresión de las citoquinas IL-6, IL-8, de la molécula de adhesión ICAM-1 y de la colagenasa (37).
Modelos animales de artritis inflamatoria también respaldan el concepto que NF-kB juega un rol muy activo en vivo. La activación de NF-kB previa al inicio de las manifestaciones clínicas y de la expresión de metaloproteinasas, ha sido encontrada tanto en los modelos del ratón con artritis inducida por colágeno tipo II y de la rata con artritis inducida por adyuvante. En el primer modelo la expresión de N F-KB correlacionó mejor con los niveles de expresión de las colagenasa-3 (MMP13) y la estromelisina (MMP3), que los niveles de AP-1 (38,39). Asimismo, inyección intraarticular del gen de la IKK2 desecandenó artritis en ratas, confirmando de esta manera que la activación de la IKK es un evento crucial para el inicio de la sinovitis (29,40).
NF-kB modula la diferenciación de líneas celulares mesenquimales, vía la inhibición post transcripcional de reguladores claves del desarrollo. Así, NF-kB controla la supresión de miogénesis mediada por TNFa, a través de un mecanismo que causa la inhibición del mRNA de MyoD. También, NF-kB suprime la condrogénesis al desestabilizar los niveles de mRNA de Sox9, un gen responsable de la expresión del fenotipo característico de los condorcitos. Mas aún, NF-kB media la supresión de osteoblastogénesis y adipocitogénesis inducida por TNF, al inhibir los mRNAs de Runx2/Cbfal y PRR-g, respectivamente (41).
La vía del NF-kB, así como la de la MAP kinasa MEK1/2, media la inhibición de la expresión genética de colágeno tipo II y de la proteína de unión en precondrocitos y condrocitos articulares de rata producida por la estimulación de TNF-a(42,43,44). Estudios en condrocitos humanos de pacientes con OA y de condrosarcoma estimulados con TNF-aoIL-1 han demostrado que NF-kB, así como las MAP kinasas, median la expresión de la metaloprotei nasa MMP13. Estos estudios fueron realizados usando diferentes inhibidores de las vías de NF-kB y MAPK sugiriendo que la inhibición de las señales de transclucción de TNF-a y 11-1 por estos agentes puede ser útil para reducir la degradación del cartílago causada por metaloproteinasas en artritis (43,44). Por otro lado, varias investigaciones han encontrado que las señales mecánicas también usan la vía del NF-kB como una vía central para la regulación transcripcional de los genes proinflamatorios que controlan los procesos catabólicos desencadenados por estas señales en los condrocitos. Así, fuerzas mecánicas de menor magnitud previenen la transiocación nuclear del NF-kB, resultando en la inhibición de la expresión de estos genes, mientras que fuerzas mecánicas de mayor magnitud inducen esta traslocación y de esta manera la expresión de genes proinflamatorios (45).
Un número cada vez mas creciente de bloqueadores no específicos de la vía del NF-kB, incluyendo varias drogas antiinflamatorias, han sido reportados. Los glucocorticoides inhiben esta vía por diferentes mecanismos propuestos: induciendo la expresión de lkB lo que incrementa la retención citopiasmática de NF-kB, inhibiendo la unión del NF-kB al DNA en los diferentes promotores de los genes blanco y por interacciones proteína-proteína directas en ciertos tipos de células entre el receptor de glucorticoides activado y el NF-kB. Algunos agentes anti-inflamatorios no esteroideos (AINES), tales como los salicilatos y el sulindac, inhiben la actividad de la IKK, previniendo la fosforilación de la lkB y por lo tanto, la activación de la vía del N F-kB. La sulfazalazina también suprime la fosforilación de la IkB, probablemente debido a la acción de uno de sus metabolitos, el ácido S-amino salícilico. Los agentes inmunosupresivos ciciosporina A y tacrolimus (FK506) inhiben la vía del NF-&B por diferentes mecanismos: ciclosporina A disminuye la actividad proteolítica del proteosoma, preveniendo la degradación de la IkBa y el tacrolimus bloquea la traslocación del c-Rel del citoplasma al núcleo (46,47). Otros agentes han sido también descritos como inhibidores de la vía del NF-kB, tales como la vitamina E, la curcumina, la talidomida, la leflunomida, el dicarbonato de pirrolidina, la glucosamina, etc (46,47,48).
Nuevas estrategias terapéuticas dirigidas a la inhibición específica de elementos claves en la activación de la vía del NF-kB se vienen desarrollando en los últimos años, despertando grandes expectativas por conocer los resultados en el, tratamiento de las artritis (49,50,51,52,53). Así, la IKK2 resulta ser un blanco muy atractivo para intervenciones terapéuticas en AR y OA por el rol preponderante que tiene en la activación de la vía del NF-kB, regulando la producción de citoquinas proinflamatorias en muchos tipos celulares, incluyendo sinoviocitos y condrocitos. Terapia genética intraarticular liberando una forma negativa dominante del gen de la IKK2 por medio de un vector adenoviral en rodillas de ratas con artritis inducida por adyuvante causó la inhibición de la translocación de NF-kB, aboliendo la expresión de IL6, IL-8 and ICAM-1 y colagenasa inducida por citoquinas inflamatorias (37,49). Recientemente, nuevos estudios usando moléculas inhibidoras pequeñas han reforzado aún mucho más el rol de IKK2. Una de estas moléculas, el sc514 inhibe la degradación de la IkB y la consecuente activación de NF-kB inducida por IL-1, en cultivo de sinoviocitos. Otro inhibidor de la IKK, BMS-345541, ha demostrado eficacia en términos de parámetros clínicos e histológicos, en ratones con artritis inducida por colágeno tipo II (49,54,55).
Así, el NF-kB aparece como un blanco muy atractivo en el tratamiento de las artritis, incluyendo OA, sin embargo, algunas inquietudes persisten acerca de los probables efectos deletéreos debido a su inhibición sistémica y de la factibilidad de su inhibición local a través de procedimientos de terapia genética. Futuros estudios en vivo indudablemente podrán mayor conocimiento acerca de la importancia de la inhibición del NF-kB en el tratamiento de las artritis como una terapia efectiva en la práctica médica.
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