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Helicobacter pylori es uno de los agentes infecciosos con mayor prevalencia en el mundo, en donde la mitad de la población se encuentra infectada y actualmente es una de las bacterias más estudiadas por ser el principal agente en el desarrollo de la enfermedad úlcero péptica, gastritis crónica activa y el adenocarcinoma gástrico1.
En el Perú, el cáncer gástrico es la primera causa de mortalidad por neoplasias malignas en el sexo masculino y la tercera causa en mujeres2.
En la actualidad, se ha reportado diversos estudios sobre la tipificación de Helicobacter pylori para demostrar los factores de virulencia. Uno de los métodos más satisfactorios ha sido el análisis molecular de algunos factores: el gen codificante de la toxina de vacuolización VacA y la isla de patogenicidad CagA . Con respecto al gen VacA, se reporta la presencia de polimorfismo en este gen, dividiéndolo en dos secciones: la región señal (s) y la región intermedia (m); ambas regiones poseen variación gen ética, reportándose dos variantes para la región s: 1 y 2 y dos para la m: 1 y 2. Por otro lado, el gen CagA no está presente en todos los H. pylori, generando así variabilidad respecto a su presencia3.
El propósito de este estudio fue validar un sistema de PCR en aislamientos clínicos de H. pylori en el Perú que contribuirá a la tipificación y detección de variantes genéticas de esta bacteria asociadas a la enfermedad gastroduodenal.
Estudio descriptivo, analítico, que incluyó 17 aislamientos de Helicobacter pylori obtenidos a partir de biopsias gástricas tomadas con endoscopía digestiva en pacientes con gastritis y úlcera péptica en los servicios de gastroenterología de dos hospitales de Lima. Las cepas patrones empleadas como controles fueron: control positivo Helicobacter pylori ATCC 43629 que contiene los genes VacA s1/m2 y CagA negativo 5 y control negativo: Campylobacter jejuni Ga22987.
PREPARACIÓN DEL ADN GENÓMICO DE LOS AISLAMIENTOS DE Helicobacter pylori
Después de realizar los aislamientos primarios de Helicobacter pylori, éste se subcultivó en placas de agar tripticasa soya con 5% de sangre de carnero desfibrinado e incubado por tres a cinco días a 37°C en condiciones de microaerofilia.
Para la extracción del ácido desoxiribonucleíco a partir de los cultivos, se ejecutó el protocolo elaborado según Van Doorn4. Se llevó a cabo la lisis bacteriana mediante la suspensión de los cultivos en buffer tris EDTA y posteriormente incubándose con lisozima 200 mg/mL durante 2 horas a 37°C para romper la pared celular. Seguidamente, se adicionó dodecil sulfato de sodio (SDS) a una concentración final de 0,5% y proteinasa K 200 mg/mL, incubándose a 65°C por dos horas. Con este procedimiento se logra la lisis total de la bacteria. Posteriormente, la solución obtenida fue mezclada con un igual volumen de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico para separar las proteínas de los ácidos nucleicos mediante centrifugación a 4500 rpm durante 15 minutos a 4°C. Se recuperó el sobrenadante y finalmente el ADN bacteriano fue precipitado usando alcohol absoluto y resuspendido en agua tridestilada.
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA PARA LA TIPIFICACIÓN DE LOS GENES VacA y CagA
Los procedimientos para la amplificación de los genes VacA y CagA fueron seguidos según lo indicado en reportes anteriores en los cuales estandarizan y uniformizan los criterios de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)4.
En ese sentido, se realizaron los siguientes pasos: el control de inhibición de muestras de ADN y la amplificación de los genes VacA y CagA.
CONTROL DE INHIBICIÓN DE MUESTRAS DE ADN
AMPLIFICACIÓN DEL GEN RIBOSOMAL 16S
Con la finalidad de conocer la condición de la muestra
de ADN y no tener falsos negativos al realizar la tipificación
de los genes VacA y CagA, se realizó previamente una reacción en cadena de la polimerasa para amplificar in vitro al gen codificante 16S rRNA, cuya secuencia entera de los nucleótidos ya ha sido determinada y es característico de las bacterias.
Los iniciadores utilizados fueron RIBF:
5' TACCTTGTTACG CT T 3' y RIBR 5'GGACTAHAGGGTA TCTAA T 3' (H=A, C o T)4,6. El protocolo para la reacción en cadena de la polimerasa fue el siguiente: denaturación inicial a 95°C por 5 minutos, luego 30 ciclos a 95°C por 30 segundos, 33°C por 1,5 minutos y 72°C por 2 minutos. Finalmente, se realizó una extensión final a 72°C por 10 minutos. Toda la reacción se llevó a cabo en un termociclador Genamp 2400.
AMPLIFICACIÓN DE LOS GENES Vac A y Cag A
Para la tipificación de los genes VacA y CagA se utilizaron iniciadores reportados anteriormente4. Para la región señal (s) del gen VacA se utilizaron los iniciadores VA1F: 5'ATGGAAATACAACAAACACAC3' y VA1xR: 5'CCTGARACCGTTCCTACAGC3'. Para la región intermedia (m) del gen VacA se utilizaron los iniciadores HPMGF:
5'CACAGCCACTTTCAATAACGA3' y HPMGR : 5'CGTCAAAATAATTCCAAGGG3'. Para detectar la presencia del gen CagA, se emplearon CagAR: 5'CTTCCCTTAATTGCGAGATTCC3' y CagAF: 5'TTGACCAACAACCACAAACCG AAG3'.
El protocolo de amplificación empleado para la tipificación de los tres marcadores genéticos fue: en un volumen final de 25 µL del tubo de reacción se mezclaron 25 pmol de cada primer específico para cada gen, desoxinucleótidos en concentración final de 200 µM, buffer de reacción (50 Mm KCl, 1,5 mM MgCl 2 , 10 mM Tris-HCl (ph 8,3), 2,5 Mm de MgCl 2 , 1,0 U de AmpliTaq Gold DNA polimerasa (Perkin - Elmer). Para cada muestra se empleó 10 ng de ADN de los cultivos lisados. El progama de temperatura para el PCR comprendió 5 minutos de predenaturación a 94°C, 45 segundos a 50°C y 45 segundos a 72°C y una incubación final a 72°C por 5 minutos. Finalmente, todos los productos de PCR fueron almacenados a 4°C hasta su análisis.
Para la identificación de los productos amplificados, primero
5 µL de la reacción del PCR mezclado con el buffer para muestra con azul de bromo fenol y xilecianol fue analizado por electroforesis de tipo submarino en 1,5% de gel de agarosa y luego se visualizaron mediante la coloración con bromuro de etidio en un transiluminador de luz ultravioleta y fotografiado. El tamaño de los fragmentos de ADN digeridos fue estimado por las distancias de migración del estándar 1 Kb Ladder‚ de peso molecular conocido.
El resultado del control de inhibición evidenció la calidad y pureza del ADN de todas las muestras evaluadas que amplificaron el gen universal de las bacterias ARN ribosomal. Todos los aislamientos fueron VacA(+)
(Figura N° 1)
La reacción realizada para la fracción del péptido señal (s) dio como resultado un fragmento de 176 pares de bases indicando la variante de tipo s1, que estuvo presente en todos los aislamientos (17/17)
Para la región intermedia m de la toxina Vac se obtuvo fragmentos de 401 y 476 pares de bases para los tipos m1 y m2 encontrándose en igual proporción (50,0%) los genotipos m1 y m2
(Figura N° 2)
Para el caso de la detección del gen de la "isla de patogenicidad cag" en cepas de Helicobacter pylori se obtuvo un fragmento de amplificación de aproximadamente 180 bp. En 14/17 de los aislamientos, se detectó el gen CagA y en 3/17 fueron negativos
(Figura N° 3) No se evidenció ningún tipo de amplificación para la cepa de Campylobacter jejuni ni en los controles de sistema con agua como se puede observar en todas las figuras.
En la actualidad, el diagnóstico de Helicobacter pylori puede hacerse mediante una gran variedad de técnicas invasivas y no invasivas, que en general ofrecen un alto grado de sensibilidad y especificidad. El cultivo sigue siendo la "prueba de oro", aunque los autores informan que existen algunas factores que limitan el crecimiento de la bacteria 6, 7.
Las técnicas moleculares han causado un gran impacto para el diagnóstico de microorganismos de difícil crecimiento y detección. La reacción en cadena de la polimerasa ha servido para el desarrollo de pruebas específicas. Como era de esperarse, al utilizar esta prueba todos los aislamientos de nuestro estudio fueron VacA(+), confirmándose lo hallado en otros reportes8-11. Asimismo, en todos los aislamientos presentaron la variante s1 al igual que lo publicado en estudios internacionales3, 8,10,12-15. Por otro lado, la obtención del 50% de genotipos m1 y m2 confirma lo encontrado por De Guzmao12, Van Doorn14 y Morales-Espinoza15.
En nuestro país, se han realizado estudios de investigación para detección de este microorganismo con el método Nested -PCR a partir de muestras de placa dental, heces y biopsia gástrica, concluyendo que no se puede emplear como prueba diagnóstica de la infección por Helicobacter pylori 11,17. Ante esta dificultad, se continúan investigando diferentes métodos de identificación y tipificación de Helicobacter pylori usando la tecnología del ADN recombinante. Los resultados encontrados en este estudio de validación concuerdan con los reportes publicados por otros autores referente a las cepas CagA+, que están presentes en poblaciones humanas y circulando en diferentes regiones del mundo9,10,17. El gen cagA es un marcador de la región cag, una isla de patogenicidad que actualmente está en discusión para la producción de enfermedad específica, pero se le reconoce el incremento de virulencia de la bacteria. Con respecto a los genotipos vacA se había planteado hipótesis que tenían implicancias patogénicas. Reportes actuales lo consideran para predecir el status del gen cagA3,9.
La metodología del PCR a partir de cultivos puros de Helicobacter pylori que empleamos nos permite diferenciar y tipificar los diversos genotipos, contribuyendo a la epidemiología molecular de esta bacteria que será de utilidad para el conocimiento de su heterogeneidad.
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1 Instituto Nacional de Salud, Lima, Perú.
2 Hospital Arzobispo Loayza - MINSA, Lima, Perú.
3 Hospital Nacional E. Rebagliati - EsSalud, Lima, Perú.
4 Hospital Cayetano Heredia - MINSA, Lima, Perú.
Correspondencia: María Zamudio R. División de Bacteriología, Instituto Nacional de Salud.
Dirección: Cápac Yupanqui 1400, Jesús María, Lima 11, Perú.
Telf.: (51-1) 471-9920 Anexo 117. Fax: (51-1) 471-0179.
E-mail: enterop@ins.gob.pe
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