PURIFICACIÓN DE UNA ENZIMA PROTEOLÍTICA DEL VENENO DE Bothrops brazili
Y ESTUDIO DE SU ACTIVIDAD SOBRE FIBRINÓGENO

María Azañero, Enrique Escobar y Armando Yarlequé*

INTRODUCCIÓN

La disolución de coágulos de fibrina por la enzima plasmina es un proceso esencial para impedir la formación de trombos y mantener la fluidez de la sangre. Por los años 30 se descubrió que la estreptoquinasa, una enzima liberada por la bacteria Streptococcus, genera plasmina a partir de plasminógeno y por lo tanto disuelve los coágulos de sangre (Tillet & Garner, 1933). Actualmente, esta proteína se usa ampliamente en el tratamiento de ciertas enfermedades trombóticas tales como el infarto agudo del miocardio, embolia pulmonar y trombosis de venas profundas (Goa et al., 1990). Sin embargo, el uso de estreptoquinasa y otros agentes trombolíticos puede ocasionar diversos efectos colaterales, perjudiciales al paciente, por lo que se hace necesario obtener nuevos productos trombolíticos que sean tan efectivos como inocuos para el paciente. Esto implica la posibilidad de usar enzimas capaces de convertir el plasminógeno en plasmina o que hidrolicen directamente la fibrina y/o el fibrinógeno, previniendo así la formación de coágulos de fibrina.

En este sentido, los venenos de serpientes, particularmente de la familia Viperidae, son ricos en enzimas proteolíticas capaces de hidrolizar algunas proteínas plasmáticas como fibrinógeno y fibrina. Desde la perspectiva clínica, estas enzimas tienen una potencial utilidad para disolver coágulos de sangre formados durante una patología trombótica (Markland, 1988).

B. brazili es una serpiente de nuestro país que habita en la región del Alto Marañón y que produce abundante veneno, hasta 4 ml en cada mordedura (Meneses, 1974). En este veneno recientemente se han aislado y caracterizado las enzimas fosfolipasa (Zeballos et al., 1999) y L-aminoácido oxidasa (Solís et al., 1999), pero ya en 1996 se reportó la existencia de una enzima proteolítica con acción sobre caseína y fibrinógeno (Escobar et al., 1996); sin embargo, este último aspecto sólo fue abordado muy tangencialmente, por lo que en este trabajo decidimos estudiar detalladamente la acción sobre fibrinógeno, a fin de esclarecer el rol de la enzima durante el envenenamiento y evaluar sus posibilidades como agente trombolítico.

MATERIAL Y MÉTODOS

Veneno de serpiente. El veneno de B. brazili fue proporcionado por el serpentario Oswaldo Meneses del Museo de Historia Natural de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, donde especímenes procedentes del Alto Marañón son mantenidos en cautiverio a 28 °C. El veneno extraído por presión manual de las glándulas fue liofilizado y conservado a -8 °C.

Cuantificación de proteína. Durante la purificación de la enzima, la proteína se determinó por la absorción de luz ultravioleta a 280 nm (Warburg & Christian, 1941), mientras que en la enzima purificada, la cantidad de proteína se determinó por el método de Lowry et al. (1951).

Evaluación de la pureza y determinación del peso molecular. La pureza y el peso molecular de la enzima fueron determinados por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (PAGE-SDS), utilizando como colorante azul de coornassie 0,1% (Weber & Osbom, 1969). Adicionalmente el peso molecular también fue calculado por cromatografía de filtración en una columna de Sephadex G-100 (Andrews, 1964).

Purificación de la enzima. 50 mg de veneno fueron disueltos en 1ml de buffer acetato de amonio 0,05M a pH 7,0 y luego de eliminar los restos insolubles por centrifugación a 1500 xg por 15 minutos, 0,95 ml del sobrenadante se aplicaron a una columna de Sephadex G-100 (1,2 x 44,3 cm), equilibrada con buffer acetato de amonio 0,05M a pH 7,0. En las fracciones colectadas se midió la cantidad de proteína y la actividad caseinolítica. Las fracciones con mayor actividad fueron reunidas y aplicadas a una columna de CM-Sephadex C-50 (1,2 x 17,5 cm), equilibrada con el mismo buffer. Las proteínas retenidas en la columna fueron eluidas con el buffer de corrida conteniendo sucesivamente NaCl 0,05 M, 0,3 M y 0,6 M. En cada fracción igualmente se determinó la cantidad de proteína y la actividad caseinolítica. En ambos sistemas el flujo fue de 5 ml/h y se trabajó a temperatura ambiente.

Actividad caseinolítica. Durante la purificación de la enzima, su actividad proteolítica se midió sobre caseína, para lo cual se incubó 1,5 ml de caseína 2% disuelta en buffer Tris HCl 0,2M pH 7,5, con 0,4 ml de agua destilada y 0,1 ml de la enzima, durante 15 minutos a 37 °C. La reacción se detuvo con 1,5 ml de ácido tricloro acético 0,44 M en frío y los productos ácidos solubles obtenidos por centrifugación a 1500 xg durante 15 minutos, fueron leídos a 280 nm. Para calcular la actividad específica los valores de D. O. a 280 nm fueron convertidos a mg de L-tirosina, y expresados como unidades por mg de proteína (una unidad equivale a la liberación de 1 mg de L-tirosina por minuto) (Takahashi & Ohsaka, 1970).

Para los ensayos que a continuación se describen se empleó la enzima purificada a una concentración de 0,4mg/ml (determinada por el método de Lowry).

Acción proteolítica sobre fibrinógeno. La actividad sobre fibrinógeno se midió incubando a 37 °C, 0,8 ml de fibrinógeno bovino 5 mg/ml, disuelto en buffer Tris-HCl 0,05 pH 7,5, y 40 gl de la enzima purificada. A los 1, 3, 5, 10, 20, 30, 60 y 120 minutos se tomaron 80 gl del incubado para su análisis por PAGE-SDS.

Efecto de algunos inhibidores de proteasas. Se evaluó el efecto del fenil metil sulfonil fluoruro (PMSF) 4 mM, tosyl lisil clorometil cetona (TLCK) 3 mM, pepstatin 3,6 mM, iodoacetato 6 mM, etilen diamino tetra acético (EDTA) 1,5 mM y mercaptoetanol 20 mM. En cada caso se preincubó 15 ml de la enzima con 15 ml del reactivo a 37 °C durante 15 minutos y luego se midió la actividad sobre fibrinógeno con 20 ml del incubado. La reacción se evaluó por PAGE-SDS.

Acción de iones metálicos. También se probó el efecto del calcio, magnesio y zinc bajo la forma de cloruros, sobre la enzima tratada con EDTA. Para esto, 15 ml de la enzima se mezclaron con 15 ml de EDTA 1,5 mM durante 15 minutos a 37 °C y luego se agregó por separado, 10 ml del ión respectivo a concentraciones de 3 y 6 mM, incubándose a 37 °C por 15 minutos más. Finalmente se probó y analizó la actividad fibrinogenolítica por PAGE-SDS.

Termoestabilidad. La termoestabilidad de la enzima se determinó incubando a diferentes temperaturas (37, 45, 55, 65, 75, 85 y 95 °C), alícuotas de 20 ml de la enzima. Luego de 15 minutos se enfrió rápidamente a 4 °C por 3 minutos y se midió la actividad sobre fibrinógeno con 10 ml de cada muestra. El análisis se hizo por PAGE-SDS.

Acción sobre otras proteínas. La actividad fibrinolítica fue determinada sobre coágulos de fibrina, formados a partir de 0,2 ml de fibrinógeno 5 mg/ml y 10 ml de trombina humana 50 U/ml incubados a 37°C por 30 minutos. A estos coágulos se añadió 10 ml de la enzima y se incubó a 37 °C. A los 5, 10, 20, 30, 60 y 120 minutos se midió la actividad fibrinolítica por PAGE-SDS. Esta actividad también se evaluó por el método de Astrup y Mulertz (1952), observando directamente la disolución de los coágulos, con 10 ml de la enzima, a intervalos de 30 minutos durante 3 horas.

También se evaluó por PAGE-SDS la probable acción proteolítica de la enzima sobre albúmina 4 mg/ml, hemoglobina 2 mg/ml, mioglobina 12 mg/ml y caseína 8 mg/ml, disueltas en buffer Tris-HCl 0,05M a pH 7,5. La actividad se probó con 10 ml de la enzima a 37 °C durante 15 minutos.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Purificación de la enzima. En el primer paso de purificación sobre Sephadex G-100 el veneno crudo fue fraccionado en 3 picos de proteína, y se encontró la mayor actividad caseinolítica en la porción ascendente del segundo pico (Fig. 1). En esta etapa la enzima fue purificada 1,3 veces y con un rendimiento de 65,1 %. Durante el segundo paso de purificación en CM-Sephadex C-50 a pH 7, un pequeño pico de proteína, sin actividad proteolítica, fue eluído directamente, mientras que el resto de proteína interactuó con el gel, inclusive después de añadir NaCl 0,05 M al buffer de elución. Al aumentarse la concentración de NaCl a 0,3 M se obtuvo un pico de proteína que mostró actividad proteolítica. Finalmente al aumentar la molaridad del NaCl hasta 0,6 M se obtuvo un nuevo pico de proteína pero sin actividad proteolftica (Fig. 2). Al final de esta etapa la enzima fue purificada 3,2 veces y con un rendimiento de 52,5% (Tabla 1). El hecho de que la enzima haya interactuado a pH 7 con el gel de intercambio catiónico y de que haya sido eluída con NaCl 0,3 M indica que a este pH la enzima tiene carga positiva y por lo tanto su pI es mayor que 7; se trata, entonces de una proteína básica.

Fig. 1: Fraccionamiento del veneno de B. brazili en Sephadex G-100 y separación de la enzima proteolítica. La proteasa (línea punteada) salión en el segundo pico de proteína.

Fig. 2: Purificación de la enzima proteolítica en CM-Sephadex C-50 a pH 7. En este intercambiador catiónico, la proteasa quedó ligada al gel y fue eluida luego de incorporar al bueffer de corrida NaCl 0,3 M.

La pureza de la enzima proteolítica obtenida luego de los 2 pasos cromatográficos fue determinada por PAGE-SDS en condiciones reductoras y no reductoras, encontrándose en ambos casos una sola banda homogénea de proteína de 22 000 y 20 300 de peso molecular respectivamente (Fig. 3). Por filtración en gel se estableció un peso molecular de 18 000 (Fig. 4). Estos resultados nos indican que la enzima es una proteína unicatenaria, y que la ligera diferencia encontrada en el peso molecular en condiciones reductoras y no reductoras se debería a que la enzima tiene por lo menos un enlace disulfuro intracadena de modo que cuando este enlace no es reducido la proteína no es desplegada totalmente y por lo tanto su movilidad aumenta; por el contrario, cuando este enlace es reducido la proteína queda totalmente desplegada y su movilidad disminuye.

Fig. 3: PAGE-SDS de la proteasa aislada del veneno de B. brazili. En los carriles 1 y 4 se observan los estándares de peso molecular: albúmina (66KDa), ovoalbúmina (45KDa) y lisozima (14.3KDa). En los carriles 2 y 3 se muestran la enzima reducida (22KDa) y no reducida (20.3KDa) respectuvamente

Fig. 4: Determinación del peso molecular por cormatografía de filtración en Sephadex G-100. Usando albúmina (66KDa), anhidrasa carbónica (29KDa) y citocromo c (12.4KDa), como estándares, se calculó un peso molecular de 18KDa para la enzima proteolítica.

Actividad sobre fibrinógeno. La molécula del fibrinógeno contiene 6 cadenas polipeptídicas: 2Aa, 2Bb y 2g, las cuales están unidas entre sí por diferentes enlaces disulfuro. Aa, Bb y g pesan respectivamente 67 000, 56 000 y 45 000 (Doolittle, R. 1981), y de este modo la PAGE-SDS en condiciones reductoras de esta molécula, se caracteriza por la presencia de 3 bandas de proteína. Cuando el fibrinógeno fue incubado con la enzima, el patrón típico de 3 bandas fue modificado, pues desde el primer minuto de incubación la cadena Aa fue hidrolizada, y a partir de los 10 minutos esta acción se evidenció también sobre la cadena Bb; sin embargo, la cadena g fue resistente a la proteólisis (Fig. 5). Esto nos permite concluir que la enzima es una Aa-fibrinogenasa.

Fig. 5: Evaluación por PAGE-SDS de la hidrólisis de fibrinógeno. El patrón de fibirnógeno (C) fue modificado por la enzima desde el primer minuto de incubación.

Otras Aa-fibrinogenasas han sido descritas en los venenos de las serpientes Trimeresurus gramineus (Ouyang & Huang, 1979), T. mucrosquamatus (Ouyang et al., 1977) Agkistrodon contortrix mokasen (Moran & Geren, 1981) y Lachesis muta (Escobar et al., 1992).

La función de estas fibrinogenasas, durante el envenenamiento, es retardar o anular la capacidad de coagulación del fibrinógeno atacando de manera preferencial la cadena Aa y luego la cadena Bb. De esta manera estos venenos producen una drástica alteración de la coagulación sanguínea debido a la desfibrinogenación que producen (Gutiérrez et al., 1982; Gutiérrez & Bolaños , 1980).

Termoestabilidad. Según el patrón de digestión del fibrinógeno mostrado en la Fig. 6, se encontró que la enzima es termoestable hasta los 45 °C, y es inactivada a partir de los 55 °C. Es sabido que mientras menor es el peso molecular de una proteína y mayor la cantidad de enlaces disulfuro, la proteína posee gran termoestabilidad. En el caso de la proteína en estudio, ésta tiene bajo peso molecular, por lo que su gran sensibilidad al calor podría deberse a que tiene pocos enlaces disulfuro.

Fig. 6: Termoestabilidad de la enzima. La actividad sobre fibrinógeno fue medida luego de preincubar la enzima a las temperaturas indicadas durante 15 minutos.

Una fibrinogenasa del veneno de Cerastes cerastes es estable hasta los 55 °C (Daoud et al., 1987), mientras que la fibrinogenasa de L. muta tolera temperaturas de hasta 60 °C (Escobar et al., 1992).

Efecto de algunos inhibidores de proteasas. De todos los inhibidores ensayados, sólo el EDTA produjo una completa inhibición de la actividad enzimática, lo cual significa que la proteasa en estudio es una metalo proteinasa. Esto coincide ampliamente con lo reportado para otras Aa-fibrinogenasas (Escobar et al., 1992; Markland et al., 1988; Evans, 1984; Tanizaki et al., 1989)

Por otro lado, ya que la actividad no fue afectada por PMSF, ácido iodoacético y TLCK, se puede deducir que la enzima no tiene serina, cisteina e histidina en su centro activo. En relación al pepstatin, éste se comportó como un inhibidor de la actividad; sin embargo, esta inhibición no se consideró concluyente, ya que el disolvente del pepstatin, el metanol, también produjo inhibición (Fig. 7).

Fig. 7: Efecto de algunos inhibidores de proteasas. La actividad sobre el fibrinógeno fue evaluada luego de preincubar la enzima con PMSF (2), iodoacetato (3), EDTA (4), pepstatin (5), TLCK (6), mercaptoetanol (7), etanol (8) y metanol (9). (C) corresponde al control de fibrinógeno y (1) a la actividad de la enzima sin tratamiento.

También resulta interesante interpretar el hecho de que el mercaptoetanol no haya ejercido ningún efecto en la actividad enzima pues de los resultados sobre el peso molecular y la termoestabilidad, se dedujo que la enzima no debía tener muchos enlaces disulfuros pero si por lo menos uno, por lo que se deduce que éstos no deben ser esenciales para mantener su función.

Efecto de algunos iones metálicos. De los resultados obtenidos en esta prueba, se ha determinado que la actividad de la enzima tratada con EDTA, no es restituida por calcio, magnesio o zinc, a concentraciones finales de 0,75 y 1,5 mM (Fig. 8).

Fig. 8: Efecto del calcio, magnesio y zinc sobre la enzima tratada con EDTA. (C) control de fibrinógeno, (1) actividad de la enzima  sin tratamiento, (2) actividad de la enzima tratada con EDTA, (3) y (4) efecto del Ca++ 0.75 y 1.5 mM, (5) y (6) efecto del Ng++ 0.75 y 1.5 mM, (7) y (8) efecto del Zn++ 0.75 y 1.5 mM.

El resultado encontrado por nosotros puede tener 2 explicaciones. Por un lado, la estructura de la enzima tratada con EDTA podría haber sido alterada drásticamente de modo que la inhibición resulta irreversible; y por otro lado, podría deberse a que el metal ligado a la enzima sea diferente de los utilizados. Algo similar se ha encontrado con la proteasa J del veneno de B. jararaca, la cual es irreversiblemente inactivada por EDTA y o-fenantrolina (Tanizaki et al., 1989). Sin embargo, en otros casos la actividad de la enzima inhibida por EDTA puede ser restablecida por Zn⁺⁺ como en el caso de L. muta o por Ca⁺⁺, como en el caso de V. lebetina (Escobar et al., 1992; Gasmi et al., 1991).

Acción sobre otras proteínas. La acción proteolítica sobre coágulos de fibrina, evaluada por PAGE-SDS, se evidenció desde los 5 minutos sobre la cadena a mientras que a partir de los 20 minutos esta acción se extendió a la cadena b (Fig. 9). Cuando la actividad fibrinolítica se evaluó por el método de Astrup y Mulertz, fue posible observar una progresiva disolución del coágulo desde los 30 minutos, que se hizo mucho más evidente a partir de las 2 horas (Fig. 10).

Fig. 9: Evaluación por PAGE-SDS de la actividad de la enzima sobre fibrina. El patrón electrofotorético de la fibrina (c) fue modificado por acción de la proteasa desde los 5 minutos de incubación.

Fig. 10: Evaluación de la actividad fibrinolítica por el método de Astrup  y Mulertz.

Asimismo, la enzima mostró tener una elevada actividad hidrolítica sobre albúmina bovina, evidenciándose una lisis completa de ésta, mediante la formación de diferentes productos de menor peso molecular; asimismo se observó una actividad muy similar sobre caseina. A diferencia de lo anterior, no se evidenció ninguna alteración en los patrones electroforéticos de hemoglobina y mioglobina. En todos los carriles donde se colocó la proteína mas la enzima se observó una tenue banda correspondiente a la enzima, semejante a la presentada en el carril control (Fig. 11).

Fig. 11: Actividad proteolítica sobre otras proteínas. En los carriles 1, 3, 5  y 7 se muestran los controles de albúmina, caseína, hemoglobina y mioglobina respectivamente . Los carriles 2, 4, 6 y 8 corresponden a la actividad de la enzima sobre caseína, hemoglobina y mioglobina respectivamente, mientras que (c) es el control de la enzima.

El hecho de que la enzima también hidrolice fibrina permite denominarla enzima fibrino(geno)lítica, es decir, con capacidad de digerir tanto fibrinógeno como fibrina. De este modo, durante el envenenamiento, la actividad de esta enzima estaría involucrada no sólo en la destrucción de fibrinógeno sino también en la hidrólisis de microcoágulos formados pocas horas después de la mordedura y posteriormente a la coagulación intravascular diseminada (Escobaret al., 1992). Por otro lado, la actividad fibrinolítica de la enzima, bajo las condiciones en las que se ha determinado, indica que es de acción directa al igual que otras fibrinogenasas como la Bitis gabonica (Forbes et al., 1969) y la de A. c. contortrix (Herzig et al., 1970). Otras proteasas que también digieren coágulos de fibrina actúan de un modo indirecto, vía conversión de plasminógeno en plasmina tal como se ha reportado en los venenos de Crotalus atrox y C. adamanteus (Budzynsky et al., 1984; Budzynsky et al., 1988). Este modo de acción indirecto, en el caso de la enzima en estudio, no ha sido verificado.

Por otro lado, la fuerte actividad de la enzima sobre albúmina indicarían que esta proteasa no es totalmente específica en su acción sobre fibrinógeno y/o fibrina, por lo que durante el envenenamiento esta proteasa tendría una participación muy activa. Sin embargo, su acción proteolítica sobre albúmina constituiría una desventaja desde el punto de vista de la posibilidad de su aplicación como agente trombolítico.


AGRADECIMIENTO:

Los autores agradecen a la IFS de Suecia por su apoyo financiero para esta investigación.



Bibliografía

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* Laboratorio de Biología Molecular. Facultad de Ciencias Biológicas. UNMSM.

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