SÍNTESIS in vitro DE LA PROTEÍNA
DE LA ENVOLTURA DEL VIRUS PERUANO DE LA FIEBRE AMARILLA
Carlos Yábar V 1, Ysabel
Montoya P 1
1 División de Biología Molecular, Centro Nacional de Salud Pública,
Instituto Nacional de Salud.
Correspondencla: Carlos Yábar Varas. Instituto Nacional de Salud. Calle Cápac Yupanqui
1400, Lima 11, Perú. Apartado postal 471. Telf.: (0511) 4719920 - Fax: (0511) 4710179.
E-mail: cyabar@ins.sid.pe
Resumen.-
Objetivo: Sintetizar la proteína recombinante de la envoltura (Er) del virus peruano de
la Fiebre Amarilla (FA) utilizando técnicas moleculares. Materiales y métodos: El gen de
la proteína de interés fue amplificado por transcripción reversa-reacción en cadena de
la polimerasa (RT-PCR) y clonado en un vector plasmídico para ser analizado mediante
secuenciamiento de ADN. El inserto de ADN fue subdonado en un vector de expresión para
ser traducido a proteína. Se purificó la proteína mediante cromatografía de afinidad
bajo condiciones denaturantes, siendo visualizada por electroforesis en SDS-PAGE.
Resultados: Se sintetizó y purificó la pr E del virus de la FA. Presentó un peso de 66
kDa, y luego de tres horas de inducción a partir de 1x108 células (OD=0.5) se
obtuvo 10 mg/mL de la proteína a miniescala. Conclusión: El análisis de la secuencia de
aminoácidos demostró que Er podría ser un buen candidato a ser evaluado
serológicamente y luego ser usado como herramienta de diagnóstico específico para la
FA.
Palabras clave: Fiebre amarilla; Proteína / aislamiento & purificación; Reacción en
cadena por polimerasa de transcriptasa reversa (fuente: BIREME).
Abstract.-
Objective: To synthesise envelope recombinant protein (Er) from Peruvian yellow fever
virus (FA) by using molecular approaches. Materials and Methods: The gene that codes this
protein was analysed by RT-PCR, then cloned into a plasmid vector and sequenced by using
DNA sequencing. Later, the DNA insert was subdoned into an expression vector to be
translated to protein. Results: The protein was purified through an affinity column under
denaturing conditions and visualised by SDS-PAGE electrophoresis. Results: The recombinant
protein was 66 kDa molecular weight and it was obtained about 10 mg/ml from 1x108
cell (OD=0.5) after three hours of induction. Conclusion: Amino acid sequence analysis
showed that Er might be a good candidate to be tested using sera and then to be used as a
specific yellow fever diagnosis tool.
Keys words: Yellow fever; Protein/isolation & purification; Reverse transcriptase
polymerase chain reaction (source: BIREME).
Introducción.-
La Fiebre amarilla (FA) es una enfermeclad viral infecciosa que afecta a cerca de 200,000
personas al año en todo el mundo y se estima que ha causado 30,000 muertes [1].
En el Perú esta enfermedad ha cobrado un alto número de víctimas en los útimos
decenios [2] y, pese a que existe una vacuna eficaz para controlar esta enfermedad, la
mortalidad y morbilidad en nuestro país sigue sigue siendo un problema de salud. Un
inconveniente es la dificultad de diferenciar la FA de otros síndromes
icterohemorrágicos como malaria, bartonelosis, leptospirosis y hepatitis, cuyos síntomas
clínicos suelen confundirse [3]. Por ello, se recurre a las pruebas de diagnóstico
serológico como ELISA de captura de IgM e IgG (MAC-ELISA y GAC-ELISA, respectivamente)
[4], pruebas inmunológicas altamente sensibles y de bajo costo, usadas como rutina en
nuestro país. Sin embargo, su especificidad es baja debido al alto índice de reactividad
cruzada con otros flavivirus relacionados, como el virus dengue y, posiblemente, el virus
de la encefalitis de San Luis, entre otros.
La reactividad cruzada se debe a la estrechez genética entre el grupo de los flavivirus,
cuyos epítopes presentes en sus antígenos pueden ser reconocidos por anticuerpos que
presentan reactividad frente a otros virus del mismo grupo [5]. Este problema dificulta la
confirmación diagnóstica, puesto que las pruebas serológicas utilizan antígenos
totales del virus de la FA (cóctel de proteínas que incluyen antígenos altamente
conservados entre los flavivirus).
Por ello, sería importante utilizar un solo antígeno del virus de la FA altamente
antigénico. Un candidato a ser usado como herramienta diagnóstica es la glicoproteína
de la envoltura (gp E), primer antígeno viral reconocido por los anticuerpos
neutralizantes del hospedero durante el proceso de infección [6] y que además presenta
propiedades inmunogénicas en ratones [7].
En ese sentido muchos investigadores han aprovechado las características de la proteína
E para analizar la presencia de epítopes de reactividad cruzada y específicos entre
grupos de flavivirus. De acuerdo a ello, la proteína de la envoltura del virus dengue
presenta tres principales dominios; epitópicos denominados A, B y C. El dominio A
comprende los aminoácidos de las posiciones 50-130 y 185-300 [8], el dominio B se
localiza entre los aminodcidos 298?400 [9] y el dominio C está situado entre las
posiciones 130-185 [8]. Las evidencias descritas en estos estudios demuestran la
existencia de diferentes epítopes de valor diagnóstico en la proteína E del virus de la
FA, que podría ser aprovechado en futuros ensayos serológicos.
El presente trabajo reporta la síntesis y purificación in vitro de la proteína
recombinante E del virus de la FA utilizando técnicas moleculares.
Materiales y Métodos.-
AISLAMIENTO VIRAL:
Se trabajó con una cepa del virus de la FA obtenida de un paciente infectado procedente
del departamento de San Martín (año 1999). La cepa viral fue cultivada en células C6/36
de mosquito Aedes albopictus y mantenida en un medio enriquecido MEM.
EXTRACCIÓN DE ARN:
El ARN total fue extraído a partir de la muestra de cultivo usando un kit de extracción
de ARN QlAmp viral RNA kit (QIAGEN) de acuerdo a las recomenclaciones de sus fabricantes
[10]. Para tal efecto, un volumen de 140 ml de cultivo viral fueron lisados utilizando una
solución denominada AVL, añadiéndose la mezcla total a una columna de purificación, se
centrifugó a 8000 RPM por un minuto y las impurezas remanentes fueron removidas mediante
sucesivos lavados con etanol. Nuevamente se realiz6 una centrifugaci6n a 8000 RPM por un
minuto, siendo el ARN recuperado en tubos de 1.5 mL de capacidad mediante elusión con
agua libre de ARNasas y almacenados a -80°C.
TRANSCRIPCIÓN REVERSA-REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA:
40 ng de ARN fue sometida a una reacción de transcripción reversa en solución
conteniendo 200 U de la enzima transcriptasa reversa Supercript II, 25 mM Tris-HCl, pH
8.3, 37,5 mM KCl, 1,5 mM MgCl2 y 1 mM DTT (Gibco), 200mM de 0,2 mM de dATP,
dCTP, dGTP y dTTP y finalmente 20 nmoles de primer reverso YF2 [11]. La mezcla de
reacción fue incubada a 42°C por 60 minutos.
Para realizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), 400 pg de ADN complementario
(ADNc) fueron mezclados en un tubo conteniendo 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM
MgCl2 0.01% en w/v de gelatina, 2 mM Cl2Mg, 0.2 mM de cada uno de
los cuatro nucleótidos trifosfatos y 20 nmoles del primer reverso YF2 y el primer forward
YF7 [11], y 0.05U/ml de Taq ADN polimerasa. La muestra fue procesada en un termociclador
GeneAmp PCR System 9600 (Perkin-Elmer) por 35 ciclos. Cada ciclo consistió de 95°C por
30 seg, 56°C por 90 seg y 72°C por 2 min con una extensión final de 72°C por 10 min.
Para visualizar las bandas de ADN, una alícuota de 5 mL del producto final fue resuelto en un gel de agarosa 1%.
Posteriormente, el gel fue teñido con bromuro de etidio y las bandas visualizadas
mediante fluorescencia con rayos ultravioleta.
CLONAMIENTO Y SECUENCIAMIENTO:
El producto de amplificación fue purificado y ligado en un vector plasmídico pGEM-T easy
(Promega). El plásmido recombinante denominado pGEM-FA99 fue introducido en bacterias E
coli. cepa XL1 Blue mediante electroporación. Las colonias recombinantes fueron
rastreadas mediante un ensayo de minipreparación de plásmidos. Los plásmidos que
portaron el inserto de ADN de interés fueron purificados y secuenciados mediante el
método de terminación de dideoxinucleótidos usando un secuenciador automático ALF
Express (Pharmacia).
SUBCLONAMIENTO Y SÍNTESIS DE LA PROTEÍNA RECOMBINANTE:
Una concentración de 5 ng del plásmido pGEM?FA99 fue sometido a PCR usando primers
modificados con sitios de restricción YF7BgII y YF2HindIII. El producto resultante
denominado FA99 fue digerido con 10 U de las enzimas de restricción BgII y HindIII. Al
mismo tiempo, el plásmido de expresión pQE40 (QIAGEN) fue seleccionado para llevar a
cabo la subclonación del producto de amplificación FA99-BgII-HindII. Para tal efecto, 1
mg de pQE40 fue digerido con 10 U de las enzimas BgII y HindII. El inserto de ADN y el
plásmido fueron ligados y el plásmido recombinante pQE40-FA99 fue utilizado para
transformar bacterias XL1-BLUE. Las bacterias recombinantes fueron seleccionadas mediante
preparación de ADN plasmídico.
La síntesis de la proteína recombinante se realizó siguiendo las recomendaciones de los
fabricantes del Kit QIA expressionist [12] con algunas modificaciones: las bacterias
portando la construcción pQE40-FA99 fueron incubadas en caldo LB ampicilina por toda la
noche. Un inóculo de 1.5 ml de cultivo de toda la noche fue mezclado con 3 mL de caldo LB
ampicilina fresco e incubado por tres horas hasta que el OD=0.5. Una concentración de 1
mM de isopropiltiogalactopiranósido (IPTG) fue inoculado para inducir la síntesis de la
proteína. Las bacterias fueron recuperadas por centrifugación a 12000 RPM por 6 minutos
y el pellet fue resuspendido en una solución de lisis A (6M de Guanidina hidroclorhidra,
0.1 M de NaH2PO4, 0.01 M de Trizma-HCl, pH 8.0). El lisado fue
centrifugado a 14000 RPM por un minuto y el sobrenadante fue recuperado en un tubo nuevo.
Esta solución fue mezclada con 50 mL de resina Ni-NTA e incubada por 30 minutos con
movimiento constante. La resina fue precipitada por centrifugación y los contaminantes
fueron removidos mediante una solución de lavado conteniendo 8 M de úrea, 0.1 M NaH2PO4,
0.01 M de Trizma-HCl, pH 6.3. La proteína fue recuperada en tubos nuevos mediante un
proceso de elusión usando una solución conteniendo 8 M de úrea, 0.1 M NaH2PO4,
0.01 M de Trizma-HCl, pH 4.5. Para la visualización de la proteína recombinante se
realizó una electroforesis en SDS-PAGE, en donde el gel fue teñido en azul brillante de
Coomasie y las bandas fueron visualizadas mediante lavados con solución decolorante.
ANÁLISIS:
Se emplearon para el análisis de alineamiento de secuencias e hidrofobicidad de la
proteína E del virus de la FA dos paquetes software: Expasy (hftp://ww.expasy.ch/) y
Dialign 2.1 (http://www.bibiserv.techjack.uni-bielefeld.de/dialing2/).
Resultados.-
El inserto de ADN FA99 correspondió a una región genética que codifica una porción
carboxiterminal de 337 aminoácidos de la proteína de la envoltura.
La secuencia de nucleótidos del ADNc del virus de la FA obtenida de la reacción de
secuenciamiento denominada FA99, reveló un marco de lectura de 1011 pares de bases que
codificaban 337 aminoácidos. Mediante el análisis de alineamiento con secuencias
reportadas en el banco de genes, se pudo determinar que la región en estudio comprendió
el 68% del gen entero, desde las posiciones 107 al 444 de los 493 aminoácidos totales. La
zona en estudio correspondió a un porción carboxiterminal de la proteína. Cabe resaltar
que la secuencia de aminoácidos de FA99 abarcó las regiones epitópicas de
reconocimiento humoral (Ver Figura 1).
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Figura 1: Secuencia
de nucleótidos y de aminoácidos del gen de la glicoproteína E del virus de la FA de San
Martín, año 1999. Los epítopes o dominios antigénicos reportados por Roehrig [8] y
Simmons [9] son señalados: la secuencia roja indica el dominio A, la secuencia subrayada
indica el dominio C y la secuencia azul, el dominio B. |
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El perfil hidropático de la secuencia de
aminoácidos de FA99 fue conservado respecto a otras cepas de referencia de FA y Dengue.
Para determinar si la proteína de FA99 presentó un perfil primario similar a otros
flavivirus se diseñó el perfil de hidropatía según Kyte [13], observándose diferentes
picos hidrofóbicos e hidrofílicos altamente conservados entre una cepa y otra; sin
embargo, la presencia de cambios aminoacídicos en FA99, trajo consigo la formación de
nuevos picos hidrofílicos respecto a las otras cepas de referencia. La Figura 2 muestra
que la proteína a sintetizarse podría presentar una característica altamente
hidrofóbica, es decir, cargada negativamente.
De otro lado, es importante resaltar que esta región de la proteína presenta diferencias
muy marcadas con otros flavivirus, especialmente con el virus dengue.
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Figura 2: (A)
Análisis de hidropatía de la secuencia de 337 aminoácidos del gen de la glicoproteína
E del virus de FA, aislamiento de San Martín, año 1999, N° de acceso AF312554; (B)
Aislamiento africano, cepa 17D, N° de acceso X03700; Virus Dengue 2, proveniente de
Amazonas, año 1996, N° de acceso AF093674.
Nota: el eje de las abcisas indica señala el número de aminoácidos y el eje de las
ordenadas señala el índice de hidrofobicidad. |
La proteína recombinante fue
exitosamente sintetizada usando un sistema de expresión procarionte.
El análisis de SDS-PAGE mostró la presencia de una banda correspondiente a un tamaño de
aproximadamente 66 kDa. Esta banda correspondió a una proteína de fusión conformada por
la proteína de interés a partir de FA99 y una proteína de 26 kDa de la dehidrofolato
reductasa de ratón (DHFR). La proteína fue obtenida en buena concentración usando
sistemas denaturantes de purificación basado en úrea. Luego de tres horas de inducción
a partir de 1x108 células (OD=0.5), pudo obtenerse aproximadamente 10 mg/mL de
la proteína de interés a miniescala (Figura 3).
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Figura 3:
Electrofóresis de SDS-PGE 10% para el análisis y visualización de la prteína
recombinante de la envoltura del virus de la FA, aislamiento peruano (San Martín, 1999).
1° carril: Marcador etándar de peso molecular; 2° carril: Dehidrofolato reductasa de
ratón; 3°, 4° y 5° carril: Proteína de fusión recombinante inducida por 1, 2 y 3
horas, respectivamente con isopropopiltiogalactopiranosida (IPTG). La flecha superior
señala la proteína de fusión de la envoltura y la DHFR, mientras que la flecha interior
señala la DHFR sola. |
Discusón.-
En el presente trabajo hemos seleccionado una porción genómica del gen de la proteína
de la envoltura (E) del virus de la FA para ser sintetizada como proteína recombinante.
Esta proteína es importante debido al rol que cumple durante los procesos de
reconocimiento del virus al receptor Fc, y en la inducción de anticuerpos neutralizantes
específicos [8]. Estas características convierten a la proteína E en un antígeno
alternativo en el diagnóstico específico de la FA en ensayos serológicos.
De otro lado, hemos realizado un análisis del perfil hidropático de la región estudiada
sobre la base de su secuencia de aminoácidos. Este análisis es importante porque nos
permite caracterizar picos hidrofílicos en la proteína. Cabe mencionar que la presencia
de dominios con picos hidrofílicos podrían ser sitios potencialmente antigénicos, como
fue demostrado previamente en el virus dengue [5]. De acuerdo a nuestro análisis, es
importante mencionar que FA99 presentó un perfil hidropático muy conservado con respecto
a otras cepas del virus de la FA de referencia como la cepa Africana 17D. Sin embargo al
comparar el perfil hidropático de FA99 con el de la proteína de la envoltura del virus
dengue se observaron importantes diferencias, principalmente en algunos picos
hidrofílicos (Figura 2). Esta observación es importante porque los anticuerpos inducidos
por cada una de las proteínas, podrían presentar una especificidad preferencial por
epítopes conformacionales. Este alcance podría ser aprovechado para la identificación
de anticuerpos específicos contra el virus de la FA utilizando su propia proteína de
envoltura.
Asimismo, ciertas zonas en donde se encuentran localizadas algunas regiones epitópicas no
presentaron variación en su perfil hidropático, es decir, no hubo mayores cambios
aminoacídicos de tipo no conservativos. La razón probablemente se deba a que ciertos
dominios epitópicos de la proteína están involucrados en el reconocimiento del receptor
Fc del macrófago. Estos dominios, por naturaleza, son altamente conservados entre los
flavivirus, como es el caso del dominio B14.
Por otro lado, hemos logrado sintetizar la proteína recombinante usando técnicas
moleculares bajo un sistema de expresión procarionte. El tamaño de la proteína
visualizada en el gel de electroforesis SDS-PAGE corresponde al tamaño esperado de
acuerdo a su secuencia de aminoácidos. La producción a miniescala de la proteína en E
coli, incluyendo los procesos de extracción y purificación no demandan generalmente
mucho esfuerzo ni material de trabajo.
Es importante resaltar que esta proteína podría ser una fuerte candidata a ser evaluada
por serología y posteriormente ser utilizada como herramienta diagnóstica. De hecho,
algunos autores han empleado construcciones de esta proteina recombinante para detectar
anticuerpos frente al virus dengue en ensayos de ELISA [15]. Bajo este contexto, cabe
mencionar que en la actualidad los sistemas de diagnóstico serológico convencionales no
presentan una alta especificidad debido a la presencia de reactividad cruzada frente a
otros flavivirus. En consecuencia, el uso de una sola proteína del virus, con menos
epítopes de reactividad cruzada, podría mejorar esta inconveniencia de inespecificidad,
principalmente en los sistemas MAC ELISA y GAC ELISA para el diagnóstico serológico de
la FA. Asimismo, el uso de una proteína de fusión tipo DHFR disminuiría en gran
magnitud los riesgos de reactividad inespecífica debido a la baja afinidad que existe
entre los anticuerpos humanos y los epítopes de DHFR de ratón [12].
Finalmente, es importante mencionar que otras proteínas candidatas a ser usadas como
herramientas de diagnóstico están siendo sintetizadas. Entre ellas podemos mencionar a
las proteínas C - prM, NS1 y NS3. Próximos experimentos usando ensayos de Western blot y
ELISA permitirán seleccionar la proteína más antigénica y con menor reactividad
cruzada o, en todo caso, usar un coctel de construcciones de fragmentos de proteínas que
conserven los epítopes de mayor especificidad y antigenicidad.
Agradecimientos:
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONCYTEC) por subvencionar parcialmente el
presente proyecto, a la División de Virología del Instituto Nacional de Salud por
proporcionamos la cepa viral de FA y a los Sres. Juana Choque Portilla y David Garcia
Neyra, personal técnico del laboratorio de Biología Molecular del Instituto Nacional de
Salud por su valiosa asistencia en las técnicas moleculares.
Ver Bibliografía
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