TIPIFICACIÓN MOLECULAR DEL VIBRIO CHOLERAE 01 EN EL PERÚ
José Huguet T 1, Isabel Arias B1, Ysabel Montoya P2. 1Laboratorio de Enteropatógenos,
División de Bacteriología, Centro Nacional de Laboratorios en Salud Pública, Instituto
Nacional de Salud. Resumen Este estudio de ribotipificación en 75 cepas de Vibrio cholerae 01 permitió identificar tres variantes ribotípicas, referidas como Per1, Per2 y Per3, aisladas durante el periodo 1991 - 1999 en el Perú. La variante Per1 fue reportada tanto en la etapa epidémica y endémica del cólera, mientras que Per2 y Per3 se relacionaron sólo con la etapa endémica. Los resultados mostraron además una aparición constante y mayoritaria de la variante Per1, poniendo en evidencia la emergencia de un mismo grupo clonal en los brotes epidémicos del Perú. Las variantes ribotípicas encontradas fueron comparadas con los ribotipos de diferentes cepas referenciales de V. cholerae previamente caracterizadas. Se observó una identidad total del ribotipo Per1 con la variante ribotípica de aislamientos Asiáticos (Tailandia), encontrándose además altos índices de similitud entre los ribotipos Per1, Per2 y Per3, y evidenciándose una estrecha relación entre las cepas peruanas y los aislamientos asiáticos. Palabras claves: Vibrio choleraa, Ribotipificación; ARN ribosómico; Perú (fuente: BIREME). Abastract Ribotyping of seventy five Vibrio cholerae 01 strains collected from 1991 to 1999, revealed three different ribotypes, referred to as Per1, Per2 and Per3. Per1 ribotype was found in both the endemic and epidemic periods, while Per2 and Per3 ribotypes were founcl oríly in the endemic period. The resuits showed a more frequent and constant presence of ribotype Perl, and indicated the emergence of the same clonal group in the aforementioned outbreaks. At the same time, new ribotypes were compared against ribotypes from previously characterized V. cholera referential strains. The comparative analysis using similar ratios revealed a total coincidence between Per1 ribotype and the ribotype from Thailand isolates, exhibiting high similarity ratios between Per1, Per2 and Per3 ribotypes. This finding supports the close relationship between Peruvian and Asian strains of V cholerae. Key words: Vibrio cholerae, Ribotyping; RNA, ribosomal; Peru (source: BIREME). Introducción En 1991, el cólera apareció en forma epidémica en varias ciudades de la costa del Perú. El establecimiento de reservorios para el Vibrio cholerae, favorecido, entre otros factores, por la existencia de malas condiciones higiénico?sanitarias en la población, propiciaron los procesos de recombinación genética entre cepas de V. cholerae, dando origen a la aparición de variantes, que pasarían inadvertidos debido a que no se cuenta con técnicas modernas para su detección. En la actualidad, los métodos que analizan directamente el ADN o ARN de los organismos han mostrado resultados promisorios en el estudio epidemiológico del cólera 1,2,3 . El análisis en longitud de fragmentos de restricción (RFLP), es uno de los métodos más usados en la caracterización de varios microorganismos de importancia médica. La agrupación de bacterias en un sistema de tipificación usando sondas de genes que codifican el ARN ribosomal, se denomina ribotipaje. El presente trabajo tiene como objetivo describir la variabilidad genética en los aislamientos de V cholerae ocurridos en el Perú durante la última década. Buscamos, mediante patrones moleculares, caracterizar las cepas de V cholerae y correlacionar la variabilidad genética encontrada a la curva epidemiológica de enfermedad entre 1991?1999. Asimismo, buscar similitudes genotípicas entre cepas peruanas y aislamientos de otros lugares a nivel mundial, utilizando como referencia en banco de datos para patrones de hibridación, originados a partir del gen codificante del ARN ribosomal 16S3. Materiales y Metodos SELECCIÓN DE CEPAS DE VIBRIO CHOLERAE 01 Todas las cepas fueron obtenidas del cepario del Laboratorio Referencial de Enteropatógenos del Instituto Nacional de Salud. Tomando en cuenta la naturaleza descriptiva del trabajo, se consideraron como puntos de referencia 11 departamentos del territorio peruano que reportaron casos de cólera entre el periodo 1991-1999. Los puntos de referencia fueron: Lima, La Libertad, Piura, Huancayo, Junín, Ayacucho, Puno, Ancash, Cusco, Cajamarca e lquitos. Luego, el proceso de selección de cepas fue realizado en forma aleatoria tomando en cuenta los brotes epidémicos reportados en cada año de estudio. Las cepas fueron reactivadas en caldo alcalino peptonado y TCBS agar. Se excluyeron aquellas cepas que no presentaban información completa y detallada de la fecha y lugar de aislamiento, serogrupo y biotipo. A partir de estos procedimientos se seleccionaron un total de 75 cepas de Víbrio cholerae 01. Cada cepa fue codificada con las tres primeras letras del lugar de procedencia, seguidas del año de aislamiento y un número de orden respectivo (Tabla 1). Las cepas de referencia utilizadas fueron: Cepa Vibrio cholerae 01 ATCC14033. Biotipo El Tor, serotipo Inaba; Víbrio cholerae 0139 Bengal tipificada y Cepa Vibrio cholerae No0l tipificada y una cepa de Vibrio mimicus. Asimismo, se utilizaron esquemas ribotípicos anteriormente reportados para realizar las comparaciones respectivas3. PROCEDIMIENTOS Extracción de ADN genómico Para la extracción de ADN genómico se utilizó el método fenol/cloformo4. Primero, se centrifugó 5 mL de suspensión bacteriana y el sedimento fue resuspendido en solución de lisis conteniendo lisozima; posteriormente, se adicionó lauril sulfato de sodio (SDS) y proteinasa K llevando a 65°C durante 2 horas. EL ADN fue extraído con fenol/cloroformo, precipitado con etanol y resupendido en agua tridestilada. Ribotipiricación El ADN obtenido de cada de V. cholerae fue ribotipificado mediante el método descrito por Popovic3 digiriendo 8 µg de ADN con 5 U de enzima BglI durante 2 horas. Posteriormente, los productos de restricción fueron sometidos a electroforesis en un gel de agarosa al 1% y transferidos a una membrana de nylon mediante el método de Southern blot 5. Los productos de digestión fijados en la membrana fueron hibridados con una sonda de ˜1480 bp, correspondiente al gen codificante del ARN ribosomal 16S (ADNr 16S) (Figura 1). El método utilizado fue el método quimioluminiscente 6 . La sonda del gen ADNr 16S fue obtenida mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), a partir de ADN de V. cholerae, utilizando iniciadores universales para su amplificación 7 . Estos iniciadores utilizados fueron: RIBF5' AGAGTTGATMTGG3´ y RIBR5'TACCTTGUACGACTT3'; y el protocolo para la reacción en cadena de la polimerasa fue: denaturación inicial 95°C por 5 minutos, luego 30 veces el siguiente ciclo: 95°C por 30 segundos, 33°C por 1,5 minutos y 72°C por 2 min. Finalmente se realizó una extensión final a 72°C por 10 minutos. Toda la reacción se llevo a cabo en un termociclador Genamp 2400.
El proceso de hibridación con la sonda y los productos de restricción se llevó a cabo a 42°C durante 4 horas. Finalmente, la detección de la hibridación se reveló por autoradiografía 4 , observándose un patrón de bandas para cada cepa de V cholerae. Cada variante obtenida por ribotipificación (ribotipo) fue rotulada con las iniciales Per, seguida del código respectivo que identificaba la fecha y lugar de aislamiento. Cálculo de cladogramas Los perfiles de hibridación obtenidos en el film fueron esquematizados, alineando cada banda y tomando como referencia los pesos moleculares del marcador ?Hindlll. Todas las cepas ribotipadas fueron esquematizadas y comparadas con las cepas ATCC14033, BengaIO139 y V cholerae No0l. Las comparaciones con aislamientos a nivel mundial fueron realizadas utilizando como referencia los esquemas de ribotipos reportados, en los cuales se incluía una cepa V cholerae Perú 19913. Los índices de similitud para el cálculo de cladogramas fueron obtenidos usando la relación: Los cladogramas fueron diseñados ordenando los índices de similitud por cada patrón ribotípico en una tabla de doble entrada, utilizando como interfase el editor de textos NOTEPAD (Windows 97) y archivándolo en formato TXI El archivo TXT fue evaluado con el algoritmo "Método de emparejamiento por pares usando promedios ari ?méticos" (UPGMA?Unweíghted pair group method using arithmetic average)9. Resultados Tres perfiles ribotípicos distintos fueron observados en las 75 cepas evaluadas. El perfil ribotípico predominante en las cepas de V cholerae fue Per1, alcanzando 92% del total de cepas seleccionadas y apareciendo en todos los años con la mayor frecuencia. Los ribotipos restantes (Per2, Per3) se presentaron en menor número y estuvieron relacionados a los años 1993, 1994, 1995 y 1996, apareciendo tanto en aislamientos de Lima como del norte del País (Tabla 1). El ribotipo Perl mostró un patrón de nueve bandas definidas (8,0; 6,8; 6,6; 5,8; 5,6; 4,0; 3,5; 3,0 y 2,3 Kb), el ribotipo Per2 mostró un patrón de 10 bandas definidas (8,0; 6,8; 6,6; 5,8; 5,6; 5,0; 4,0; 3,5; 3,0 y 2,3 Kb), y el ribotipo Per3 mostró un patrón de 9 bandas definidas (8,0; 6,8; 6,6; 5,8; 5,6; 5,0; 4,0; 3,5 y 3,0 Kb) (Figura 2).
Los análisis de los ribopatrones indicaron una identidad total del ribotipo Per1 con el ribotipo de los aislamientos Perú 1991 y Tailandia 1991, estudiados por Popovic3. Dentro W grupo el Tor se pudo establecer subgrupos, en los cuales se relacionó a los tres ribotipos encontrados en el presente estudio. Estos tres ribotipos se encontraron en un mismo clado junto con aislamientos de Filipinas y Ruanda, indicando además una alta similitud con los aislamientos asiáticos (1992) y con Islas M Pacifico Sur ? Islas Gilbert ? Oceanía (1977). Otros aislamientos relacionados a las variantes peruanas fueron California (1991), Hawai (1991), Rumania (1991) y una cepa aislada de un brote en Guatemala, en 1990 (Figura 5).
Discusión Revisando la distribución de los ribotipos encontrados destaca la aparición constante de Per1 en todos los lugares estudiados, evidenciándose su distribución uniforme y mayor frecuencia. Los dos restantes ribotipos Per2 y Per3, aparecieron también en diferentes lugares M Perú, aunque con una menor frecuencia de presentación. La presencia de un ribotipo dominante Per1 reportado en el presente trabajo, reafirma el momento endémico M cólera en el Perú. Trabajos anteriores también publican la presencia constante de este ribotipo Per13,11, reforzando la teoría que en cada brote epidémico ocurrido en Latinoamérica reemerge la misma variante genética de V. cholerae. En cuanto a la distribución cronológica, Per1 mantiene una frecuencia alta, estando relacionada con el inicio de la epidemia en el Perú y los últimos brotes reportados en 1999; en tanto que las variantes encontradas Per2 y Per3 fueron aisladas en los años 1993, 1994, 1995 y 1996, y se correlacionan con el descenso de la curva epidémica y emergen a comienzos de una etapa endémica en el Perú. Utilizando relaciones basadas en índices de similitud se corrobora a la epidemia latinoamericana del cólera como una extensión de la séptima pandemia, agrupándose a los ribotipos encontrados en un grupo homogéneo derivado de cepas asiáticas, ya descritas con anterioridad por otros autores3. Los resultados obtenidos al agrupar los patrones de referencia en el ámbito mundial con los ribotipos obtenidos en el presente trabajo coinciden con la agrupación fenotípica de Vibrios en lo que respecta al biotipo. Todas las variantes de V. cholerae pertenecientes al biotipo Clásico se agrupan en una rama mayor, mientras que las variantes pertenecientes al grupo El Tor pertenecen a un grupo homogéneo, como se describió anteriormente. Adicionalmente, se presenta una subagrupación en las variantes M grupo El Tor, encontrándose posibles relaciones entre epidemias provocadas por la misma cepa (Perl/Tha91)3,12 , brotes aislados (Guatego90)3 o variantes provenientes de reservorios o zonas endémicas de cólera (Austral77, Austral84)3 . Esta correlación demuestra la eficacia del método de ribotipaje cuando se utiliza un banco de variantes como referencia y se compara con nuevo ribotipos encontrados. Ello debido a la excelente repetitividad de la prueba y su aceptable discriminación. El análisis entre ribotipos encontrados en cepas peruanas y cepas de referencia Bengal y No0l indican una alta similitud entre la cepa 0139 con el grupo al que pertenecen las cepas peruanas, encontrándose más alejado el grupo de las cepas No0l. Este hecho corrobora los resultados obtenidos por otros autores, respecto a la relación entre cepas toxigénicas 01 de V cholerae y la cepa responsable de epidemias en Asia 0139 - Bengal 10,11. Se reconoce variabilidad en las poblaciones de V. cholerae 01 en el Perú, encontrándose tres variantes ribotípicas muy similares entre sí y relacionadas con aislamientos asiáticos de la séptima pandemia del cólera. Sin embargo, cabe mencionar que la variante Per1 se encuentra relacionada a la mayoría de brotes epidémicos de cólera en el país, lo cual también es corroborado por un estudio realizado en la ciudad de Lima en el periodo 1991?199511. En la actualidad se están empleando nuevas metodologías que permiten una mayor discriminación entre cepas bacterianas. La electroforesis en campo pulsado es una de las técnicas que ha cobrado una mayor importancia en la tipificación de bacterias11 y otras, como el polimorfismo en longitud de fragmentos amplificados (AFLP ? Amplified? fragment length polymorphism)12 también está siendo cada día mas usada. Sin embargo, la ribotipifcación no deja de ser una herramienta de suma importancia para el estudio en la variabilidad y epidemiología M cólera y otras enfermedades transmisibles, repotenciando las metodologías convencionales para el estudio de epidemias. Finalmente, teniendo en cuenta las comparaciones entre serogrupos, serotipos, biotipos y ribotipos se podría establecer el sistema de ribotipificación como una nueva escala para la identificación y taxonomía en V cholerae. |
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