ESTANDARIZACIÓN DE LA PCR PARA
EL DIAGNÓSTICO DEL VIRUS
Hijar G1, Carrillo C.3, Padilla C.1, Cabezas C.2, Suárez M.2, Romero G.2 y Montoya Y.1
Introducción El Perú un país con más de veintitrés millones de habitantes tiene un promedio de prevalencia entre 1 a 2% para antígeno de superficie (HBsAg) y de 20-30% para anticuerpos contra HBsAg3 del virus de la Hepatitis B (VHB). La prevalencia de la hepatitis B varía de acuerdo a las diferentes regiones geográficas1, localidades, habitat y los grupos de población distribuidas en las diversas áreas geográficas, presenta zonas hiperendémicas en la región de la selva alta que incluye a 10 departamentos que cuentan con selva alta y áreas rurales de la selva baja6. Además en algunos valles de la vertiente oriental de la cordillera de los Andes como Abancay y Huanta2,7. El HBsAg es el primer antígeno que aparece en el suero, debido a que ésta proteína es la más inmunogénica y se considera como un marcador temprano de infección por VHB. Cinco a diez por ciento de adultos con infección por VHB, normalmente no se recuperan de la infección y permanecen con seropositividad al HBsAg por largos periodos de tiempo. Estos pacientes se convierten en portadores sanos y/o desarrollan una hepatitis crónica. Se considera que más de dos mil millones de habitantes en el mundo han sido infectados por el virus de la Hepatitis B, de los cuales 280 millones serán portadores crónicos positivos HBsAg Se conoce fue el virus se replica activamente en el hígado de los pacientes infectados aumentando la presencia del HBsAg y antígeno de envoltura (HBeAg) en suero, de allí la importancia de poder detectar por la técnica de ELISA a estos dos antígenos. Sin embargo estos antígenos pueden quedar circulantes indefinidamente teniendo una relación directa de la infección y seroconversión del paciente. Por lo que las técnicas moleculares resultan muy útiles para determinar la presencia del ADN del virus tanto en pacientes agudos, crónicos y los que se encuentren en periodo de ventana de la infección. Hasta la actualidad se cuentas con pruebas inmunológicas que son utilizados para el diagnóstico clínico pero la PCR ayudaría a mejorar el diagnóstico de la enfermedad identificando directamente al virus, lo cual es importante para poder determinar la fase de la enfermedad, pronostico v tratamiento del paciente. MATERIALES Y MÉTODOS MATERIAL BIOLÓGICO Los seis sueros empleados para este estudio tuvieron como carácter de inclusión la reactividad dc al HBsAg y HBeAg del HVB empleando la técnica de ELISA. La confirmación serológica de estos pacientes fue realizada por la División de Virología del INS. Para este sistema es necesario contar con controles positivos y como controles negativos. El control positivo es un suero de paciente positivo a HBsAg v HbeAg, y el control negativo es un suero de paciente que no ha tenido antes la enfermedad o que no se encuentre en dreas endémicas. EXTRACCIÓN DE ADN VIRAL El método de extracción de ADN a partir de 200 microlitros de suero, el cual está basado en la lisis de la membrana del virus bajo ciertas condiciones químicas como detergentes, enzimas que permitan lisar la membrana del virus dejando libre el material genético y luego es tratado por una resina de carga catiónica y eluida con agua pura libre de DNAsas y RNAsas. Luego el ADN es cuantificado por espectrofotometría para conocer la cantidad a utilizar en PCR y poder determinar la sensibilidad. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) fue realizada usado oligonucleótidos iniciadores (primers) ya reportados que son específicos para la región del gen del antígeno de superficie (HBsAg) y para todos los subtipos de Hepatitis B11.
Para amplificación se utilizó una enzima ADN Polimerasa, los dNTPs, agua para PCR libre ADNsa y RNAsa, Cloruro de Magnesio, (MgCl,). Los tubos de reacción fueron sometidos a diversas temperaturas: Denaturación del ADN a 95°C por 30 segundos, hibridación de los primers a 55°C por 30 segundos y una extensión a 72°C por 30 segundos. Se repitieron estas 3 temperatura 35 veces y la extensión final a 72°C por 5 minutos. Se realizó la estandarización de la temperatura de hibridación de los primers, curvas de concentraciones de MgCl, y curvas de ADN para demostrar la sensibilidad de la técnica. Los productos de amplificación fueron visualizados en geles de poliacrilamida al 12 %, coloreados con bromuro de etidio y fotografiadas. Resultados El método de extracción fue realizado satisfactoriamente obteniéndose una cantidad de 250ng. aproximadamente de ADN para cada muestral así como también la calidad de ADN fue de alta pureza la cual es óptima para ser aplicado a técnicas moleculares como PCR. En la técnica de PCR se probaron diferentes temperaturas de anillamiento de primers desde 50 a 56°C, siendo la más óptima de 55°C (figura 1). Teniendo esta temperatura se probaron diferentes concentraciones de MgCl2 desde 1 a 4 mM, siendo la más óptima de 2mM (figura 2). Para determinar la sensibilidad se probaron diferentes cantidades de ADN desde 100ng. a 1µg. siendo la sensibilidad de hasta 1 a 10µg que corresponde de 1 a 10 copias de virus circulante. Las condiciones para ser usadas en PCR fueron aplicadas usando la temperatura de anillamiento de los primers fue de 55°C, la concentración de MgCl, óptima fue de 2 mM. En la estandarización de la técnica se pudo determinar que PCR tiene una sensibilidad alta de aproximadante detecta hasta 10 partículas virales circulantes y la especificidad fue de un 100%. Además se realizó el PCR de 6 sueros de pacientes infectados, teniendo resultados positivos (figura 3). Se concluye que esta técnica será de mucha ayuda en el diagnóstico y pronóstico de la enfermedad así como del seguimiento al paciente en caso de ser un portador crónico. Del mismo modo podría emplearse en estudios epidemiológicos de la enfermedad.
Discusión La presencia del ADN del virus de la hepatitis B (HVB) en suero indica la infectividad y la replicación del virus9. El empleo de las últimas técnicas moleculares como Southern o spot-blot hibridación utilizando marcaje radiactivo detectan 0,01-1,0 pg de ADN, que equivale a 3x 103 a 3x 106 copias de HVB, respectivamente. Sin embargo, métodos más sensibles detectan 3 x 106 pg. La PCR es una técnica que nos permite amplificar fragmentos de ADN dando una sensibilidad de 1 a 10 copias y se aumenta la sensibilidad empleando después una hibridación con una sonda marcada.11 En una infección con Hepatitis Viral B (HVB) el marcador más sensible es la detección el ADN del virus en suero ya que indica la replicación y la infectividad del virus10. En el estado crónico de esta enfermedad la técnica de PCR sería muy importante ya que podría determinar si el paciente está en una fase replicativa, lo cual ayudaría al tratamiento del paciente y al pronóstico de la enfermedad. Con ésta técnica se podrían realizar estudios de monitoreo de la respuesta inmunológica del paciente infectado, así como detectar con la presencia de ADN circulante en casos de reactivación del virus y por su alta sensibilidad determinar los casos donde el paciente se encuentre en el periodo de ventana.
_____________________________________ 1 División de Biología
Molecular del Instituto Nacional de Salud, Lima-Perú |
