PROTEÍNAS INMUNODOMINANTES DE Brucella melitensis
EVALUADAS POR WESTERN BLOT

Anaya Elizabeth¹, Montoya Ysabel¹ y Carrillo P Carlos^1,2

Introducción.-

La Brucelosis es una enfermedad conocida desde el siglo XIX, cuyo agente causal fue aislado por David Bruce en 1956 [1] es una antropozoonosis originada por bacterias gramnegativas del género Brucella que constituye una causa importante de morbilidad en los seres humanos y animales. En el Perú, la forma principal de transmisión es la vía oral, y el contagio directo a través de piel y mucosa, constituyéndose una enfermedad endémica con focos episódicos donde Brucella melitensis biotipo 1 es responsable del 97% de los casos de Brucelosis humana [2].

El diagnóstico de esta enfermedad en el Perú se realiza mediante aislamiento de patógenos en cultivos in vitro y pruebas serológicas (i.e. Rosa de Bengala, test de aglutinación en placa, y test de aglutinación en tubo). Estas pruebas serológicas rápidas debido a su relativa sensibilidad y especificidad, presentan reacción cruzada y falsos positivos con anticuerpos homólogos correspondientes a otros patógenos tales como: Vibrio cholerae, Francisella tularensis, Yersinia enterocolítica y Mycobacterium tuberculosis [3,5].

Se evaluó la inmunogenicidad de las proteínas totales de B. melitensis para usarlas como marcadores mediante la técnica de Western Blot a fin de disponer de un test de diagnóstico alternativo con mayor especificidad y sensibilidad.

La técnica denominada Western Blot o Inmunoblotting [6] combina la capacidad de resolución de la electroforesis en gel para separar a las proteínas, con la especificidad de la detección inmunológica con los anticuerpos. Asimismo, esta técnica, contribuye a determinar características importantes de los antígenos como su presencia, cantidad, peso molecular relativo de las cadenas polipeptídicas y grado de pureza [7].

En la literatura científica aparecen algunos trabajos sobre la seroreactividad de una combinación de sueros humanos infectados con Brucelosis, los cuales fueron enfrentados a un extracto de proteínas de B. abortus 19-S, ubicando varias bandas antigénicas entre 30 y 60 kDa [8]. Asímismo, se identifica una proteína citoplasmática de 18 kDa obtenida de B. ovis considerada como un marcador serológico de infección activa de Brucelosis humana y bovina [8].

En el Perú, el diagnóstico de esta enfermedad mediante cultivos in vitro y pruebas serológicas ofrecen una buena sensibilidad cuando se aplica adecuadamente4. Este trabajo describe el desarrollo de una prueba diagnóstica alternativa con mayor sensibilidad y especificidad como es el Western Blot utilizando proteínas totales de B. melitensis.

Materiales y Métodos.-

Bacteria: La cepa de B. melitensis proviene de un paciente peruano en fase aguda, aislada por hemocultivo en Medio modificado de Ruiz Castañeda, y tipificada mediante pruebas bioquímicas y serológicas, según los procedimientos recomendados por OMS y ASM. La cepa bacteriana se mantiene criopreservada en medio Skim Milk (Difco) a -70°C.

Preparación del Extracto de Proteínas Totales: El extracto de B. melitensis fue preparado a partir de una suspensión de bacterias en solución salina tamponada (SSB, pH 6.4) con modificaciones del protocolo de la Guía de Práctica de Western Blot de la división de Biología Molecular [9].

Las bacterias previamente inactivadas a 96°C por una hora se rompen con shock térmico de-70°C y 37°C, con intervalos de 7 minutos cada uno. Posteriormente, las proteínas son cuantificadas por el método de Lowry [10] y se almacenan en alfcuotas a -70°C.

Western blot: Trescientos microgramos de las proteínas totales de B. melitensis son separadas en un gel preparativo de SDS-PAGE al 15% a 120 volt. (25 mAmp) por 2 horas.

La transferencia de las proteínas se realizó en papel de nitrocelulosa por una hora a 120 volt, (32 mAmp.) Las membranas de nitrocelulosa son incubadas con leche desgrasada, descremada y deshidratada al 2%, y los anticuerpos secundarios usados fueron IgG anti-humano conjugado con peroxidasa e IgG anti-humano conjugado con Fosfatasa Alcalina.

Se analizó por Western Blot la reactividad inmunológica de 34 sueros de pacientes de los que se cuenta con datos clínicos completos. Estos sueros fueron analizados previamente por Rosa de Bengala, Aglutinación en placa, Aglutinación en tubo y 2-Mercapto-Etanol, tres sueros de voluntarios sanos sin historia previa de Brucelosis (control negativo); dos sueros muy reactivos de pacientes con Brucelosis (control positivo); 26 sueros de otras enfermedades: Cólera (n=12), Tifoidea (n=2) y Tuberculosis (n=2).

Resultados y Discusión.-

La técnica de Western Blot utilizando proteínas totales de B. melitensis como antígeno, ofrece un test alternativo para el diagnóstico de brucelosis humana, logrando una sensibilidad del 90% (Figuras 1 y 2). Asimismo, es de resaltar que el sistema desarrollado no tiene reacción cruzada cuando es evaluada con sueros de pacientes de otras enfermedades como V. cholerae, Salmonella typhi y Mycobacterium tuberculosis obteniéndose por lo tanto una especificidad del 100%.

El test de inmunodiagnóstico desarrollado fue optimizado usando IgG anti-humana conjugado con peroxidasa como anticuerpo secundario al evaluar sueros de pacientes infectados con Brucella sp. y otras enfermedades (ver Material y Métodos). La prueba detectó bandas seroreactivas con un 100% de especificidad y 90% de sensibilidad a diferencia de la IgG anti-humano conjugado con Fosfatasa Alcalina con el cual se obtuvo sólo 70% de sensibilidad (Fig. 1). Las principales proteínas inmunogénicas detectadas en B. melitensis correspondieron a proteínas de 8,14, 18, un complejo de 25-48 y 58 kDa. (Fig. 1).

Fig. 1: Seroactividad de proteínas totales de B. melitensis. Análisis de Western Blot de un asilamiento de B. melitensis. Sensibilidad de cada una de las bandas obtenidas en el listado de las proteínas totales.

La reacción cruzada observada en las pruebas serológicas convencionales se debería a la presencia de una o varias moléculas de perosamina en el lipopolisacárido (LPS) y que constituye el principal antígeno de superficie de Brucella sp11.

Este LPS es evidenciado en pruebas de aglutinación convencionales dando reacción falsos positivas para Brucella en pacientes con diarrea por V cholerae, sin embargo no presenta reacción en los ensayos de Western Blot [12].

Dos proteínas inmunogénicas presentes en nuestro sistema: el complejo proteico 25-48 kDa y la proteína 58 kDa, también han sido descritos por otros autores [7], quiénes utilizan como antígenos un extracto de proteínas citoplasmáticas libres de LPS de A abortus 19-S, y obtienen bandas definidas entre 25 y 48 kDa. En el sistema de Western Blot desarrollado en este trabajo se utilizan proteínas totales de B. melitensis las cuales presentan LPS y glicoproteínas. Sin embargo, no se observan bandas definidas a nivel del complejo proteico 25-48 kDa. Se sugiere entonces que la interferencia en la resolución de las bandas del complejo 25-48 kDa de nuestro sistema se relacione con la presencia de LPS y/o glicoproteínas de la bacteria.

Fig. 2: Seroactividad de proteínas totales de B. melitensis. Análisis de Western Blot de un asilamiento de B. melitensis determinando la sensibilidad de cada una de las bandas obtenidas en forma combinada.

Otra proteína inmunodominante de B. melitensis hallada en este trabajo, es la proteína de 18 kDa, la cual también ha sido reportada por otros autores en B. ovis [8] y que constituye una proteína citoplasmática considerada a ser un fuerte marcador serológico.

Otras proteínas inmunodiagnósticas reportadas para Brucella sp. es la proteína de 20 kDa [13] y 26 kDa [14], las cuales reaccionan con algunos sueros de pacientes peruanos infectados con Brucella sp., pero cuya reactividad no es constante.

Finalmente, las bandas seroreactivas reportadas en este artículo nos han permitido identificar la reactividad de los sueros individuales contra los antígenos totales de B. melitensis aislada en nuestro país. Es necesario validar el test incrementando el número de sueros de pacientes con Brucelosis y de otras enfermedades. En tal sentido, la División de Biología Molecular continúa analizando un mayor número de sueros.

AGRADECIMIENTOS:

Agradecemos a la Sra. Alida Navarro por su constante y valioso apoyo técnico en la producción de los antígenos de Brucella melitensis. Así mismo, al Laboratorio de Bacteriología Especial de la División de Bacteriología, CNLSP, INS por proporcionar los sueros de brucelosis.


Bibliografía

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1. División de Biología Molecular. Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública, Instituto Nacional de Salud, A.P 451 Lima, Perú.
2. Departamento de Microbiología. Universidad Peruana Cayetano Heredia, A.P 4314, Lima 100, Perú.

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