MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. LUGAR DE ESTUDIO.

El presente estudio se realizo en dos establos lecheros de crianza intensiva de la cuenca lechera de Arequipa. El establo A ubicado en la irrigacion de Santa Rita de Siguas. con 200 vacas en producción y el establo B ubicado en la irrigación de Vitor con 190 vacas en producción. Ambos establos no cuentan con un programa de vacunación contra el virus de la diarrea viral bovina, por lo menos desde hace 5 años atrás. Los problemas de abortos, repetición de servicios y mortalidad neonatal fueron mas prevalentes en el establo A.


3.2. MATERIALES

3.2.1. Animales.

Se incluyeron todos los terneros sin distinción de raza ni sexo nacidos durante los meses de julio a diciembre del 2001.

3.2.2. Equipos y materiales.

Lector de ELISA (Labsystems Multiskan Plus), cabina de flujo laminar (Steril Gardhood), centrifuga (Selecta), estufa de 37º C (Gallenhamp), microcentrifuga (National labnet CO2), tubos al vacío (sistema vacutainers), con EDTA como anticoagulante, agujas vacutainers, microplacas estériles, viales, micropipetas simples y multicanales de 5 - 50 µl ; 50 - 200 µl y de 200 - 1000 µl, espectrofotómetro, refrigeradora, tips descartables, pipetas pasteur.


3.2.3. Reactivos.

Kit de ELISA de captura de antígenos de pestivirus de procedencia comercial (Moredum Diagnostics, UK), el cual contiene: dos placas de 96 hoyos cubiertas con anticuerpos monoclonales, como contra la proteína no estructural 125 de los pestivirus, y el otro es el conjugado (anticuerpo monoclonal conjugado a peróxido de rábano silvestre (HRP)), control positivo C1, control positivo C2, control positivo C3, control negativo C4, buffer de lavado (PBSTween), sustrato, solución de bloqueo, y buffer de extracción A, B y C., para lisar globulos rojos y polimorfonucleares y lavado respectivamente.


3.3. MÉTODOS

3.3.1. Obtención de muestras.

Se obtuvieron muestras de sangre entera, mediante punción de la vena yugular de los terneros recién nacidos antes de que tomen el calostro, utilizando tubos al vacío conteniendo EDTA como anticoagulante. Las muestras fueron identificadas y transportadas adecuadamente al laboratorio de Virología de la Facultad de Medicina Veterinaria (FMV) de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (UNMSM) para su procesamiento.


3.3.2.Tamaño muestral.

No fue necesario obtener el tamaño muestral ya que se realizo un muestreo dirigido que incluyeron a todos los terneros nacidos durante un periodo de 6 meses (julio a diciembre del 2001), sin distinción de raza ni sexo. Habiéndose trabajado un total de 131 terneros recién nacidos.


3.3.3.Criterios utilizados para la detección de antígenos virales en las muestras de los terneros.

-    Primero, se realizo la detección del antígeno de virus de la DVB en muestras de sangre entera de terneros recién nacidos, mediante la prueba de ELISA de captura de antígeno.

-    Segundo, en las muestras cuyo resultado a la espectrofotometria no superaba el valor del control C2 (sospechoso), se evaluaron nuevamente utilizando el buffy coat, como recomienda el kit comercial.

-    En caso de muestras positivas o sospechosas, se realizo la confirmación de la persistencia del virus de la DVB en los animales, luego de superado los 4 meses de vida que la literatura recomienda para evitar la interferencia de los anticuerpos maternales.

-    Se investigo la presencia del VDVB en la madre del animal PI.


3.3.4.Detección de antígeno viral mediante la prueba de ELISA de captura de antígenos.

La detección del VDVB mediante la prueba ELISA de captura de antígenos fue realizado de acuerdo al manual del kit comercial (Moredun Diagnostics). El procedimiento fue el siguiente:


(a)    Preparación de buffy coat.

-    Se llevaron los buffer de extracción A, B, y C a temperatura ambiente.

-    Se centrifugaron las muestras de sangre con anticoagulante a 800 rpm por 10 minutos.

-    Se extrajo el buffy coat, utilizando pipetas pasteur y se colocaron en viales estériles, añadiendo buffer de extracción A hasta el volumen de 1.5 ml.

-    Se mezclaron suavemente hasta que los glóbulos rojos se lisaran (30 segundos).

-    Las muestras se centrifugan a 2000 rpm (1 minuto)

-    Cuando los glóbulos rojos no se lisaron completamente, se descarto cuidadosamente el sobrenadante, se añadió el buffer A hasta un volumen de 1.5 ml y se resuspendió el pellet. Se repitió los dos pasos anteriores.

-    Se descarto el sobrenadante, se lavaron los pellet 3 veces adicionando 1.5 ml del buffer B y descartando el sobrenadante después de cada lavado.

-    Se resuspendió los pellets en 1.5 ml de buffer C, por inversión y agitación; las muestras se agitaron por rotación durante 120 minutos a temperatura ambiente; y finalmente. Se almacenaron las muestras a - 20ºC hasta su utilización.


(b)    Detección de Antígenos contra VDVB.

-    Antes de iniciar la prueba los reactivos fueron mantenidos hasta que obtengan la temperatura ambiente.

-    Se colocaron 100 ul de los controles y de las muestras en los hoyos de la microplaca previamente determinados.

-    La microplaca fue colocada en una cámara húmeda y se incubo a 37º C por 120 minutos.

-    Se elimino el contenido de la microplaca, se lava tres veces con buffer de lavado, y secado sobre papel absorbente.

-    Se adiciono 100ul de conjugado a toda la microplaca.

-    La microplaca nuevamente fue colocada en una cámara húmeda y puesto a incubar a 37ºC por 60 minutos.

-    Se elimino el contenido de los hoyos de la microplaca y se lavo de la forma anteriormente descrita.

-    Se adiciono 100ul de sustrato a toda la microplaca.

-    La microplaca se incubo durante por 15 minutos a temperatura ambiente.

-    Se agrego 50 ul de la solución de bloqueo a toda la microplaca.

-    Y se procedió a la lectura a través de un espectrofotómetro con filtro de 450nm de absorvancia.


3.3.5. Análisis de Datos.

Intervalo de confianza (IC):

Los intervalos de confianza se estimaron empleando el método de Simulación Beta [ ] considerando para el cálculo de la función de prevalencia los parámetros de distribución:

     1=éxitos más 1 (positivos a la prueba)
     1=fracasos más 1 (negativos a la prueba)