SEPTIEMBRE 2000 - VOL.3 Nº1

 

OPTIMIZACION DE LAS CONDICIONES FERMENTATIVAS PARA LA
PRODUCCION Y EXTRACCION DE
b--GALACTOSIDASA
DE Kluyveromyces marxianus

 G. GAMARRA - BALLENA*, J. C. WOOLCOTT-HURTADO**

*Universidad Nacional Mayor de San Marcos - Facultad de Farmacia y Bioquímica
Jr. Puno 1002. Lima - Perú
**UniversidadNacional Mayor de San Marcos - Facultad de Química e Ingeniería Química
Av. Venezuela s/n Lima-Perú

Abstract : Five strains of Kluyveromyces marxianus a one of Candida pseudotropicalis were cultured in medium M­1 for production of B-galactosidase (E.C: 3:21:23). The strain Kluyverornyces marxianus NRRL- Y - 1109 was selecteed for the best production ( 11.6 U/ml). The maximum yield of enzyme (1330 UONPG/g of biomass) was obtained on 5% of lactose supplemented with 0.5% yeast extract , 0.75% (NH4)2 SO4 y 0.45% K2 HPO4 (w/v). The best extraction of the enzyme from viable cells was performed by toluene 2% (v/v), at pH 7,0 ± 0.1, 30°C during 15 hours of treatment, in 0.1 M potassium phosphate buffer, supplemented with 1 mM magnesium and 0.1 mM manganese sulfate. The enzyme was partially purified with acetone. It obtained a specific activity of cle 73 ULACTOSA/mg of protein and a yield of 93.3%. Optimun pH and temperature for enzyme activity were pH 6.6 and 40°C. The K, for lactose was 15 mM and V. of 7.3 x 10-5 M/min.
Key words: Enzyme, Jactase, B-galactosidase

Resumen : Cinco cepas de levadura de Kluyveromyces marxianus y una cepa de Candida pseudotropicalis fueron cultivadas en medio M -1, para la producción de B- galactosidasa (E,C. 3.2.1.23). La cepa Kluyveromyces marxianus NRIRL- Y - 1109 fue seleccionada por obtenerse mayor producción de la enzima   (11.6 Ulmi) El máximo rendimiento de la enzima ( 1330 UONPG/g de biomasa) fue obtenida con 5% de lactosa suplementado con extracto de levadura 0,5%, (NH4)2 SO4 0.75% y K2 HPO4 0.45% (p/v), Las mejores condiciones de extracción de la enzima a partir de células viables sé realizó con toiueno 2% (v/v), a pH 7.0 ± 0.1, 30°C, durante 15 horas de tratamiento en tampón fosfato de potasio 0.1 M, suplementado con 1 mM de sulfato de magnesio y 0.1 mM de sulfato de manganeso. La enzima fue parcialmente purificada con acetona, obteniéndose una actividad específica de 73 ULACTOSA/mg. de proteína y un rendimiento de 93.3%.La temperatura de 40°C y el pH de 6.6 resultaron óptimos para la actividad enzimática. El Km para lactosa fue de 15 mM y V, de 7.3 x 10-5 M/min.
Palabras clave: Enzima, Lactasa. B-galactosidasa.

INTRODUCCION

La leche contiene el 4.8% de lactosa. Este carbohidrato es poco soluble y con baja capacidad edulcorante. Estos inconvenientes han limitado su uso en alimentos como helados, confites y alimento para animales. Así como, también han limitado el uso del suero lácteo por su alto contenido de lactosa y constituye un severo problema de contaminación(22)

Se han planteado diversas altemativas para la utilización de la lactosa del suero lácteo desproteinizado. Estos estudios han sido dirigidos principalmente a la producción de biomasa celular, etanol y B-galactosidasa (2, 6, 24).

La hidrólisis enzimática de la lactosa ha sido sugerido como un medio de reducir su contenido en leche y productos lácteos (3). Las enzimas son catalizadores biológicos de naturaleza proteica con un alto grado de especificidad y eficiencia, lográndose acelerar los procesos químicos en una magnitud de hasta 1015 veces (30), debido a la acción concertada de más de un grupo químico de la proteína en la catálisis, disminuyendo la energía libre de activación. Así su aplicación se lleva a cabo en condiciones medias de pH y temperatura, las reacciones enzimáticas se llevan a cabo a temperaturas de 25 a 60T y a valores de pH 5.O a 8.0.

La lactasa B-D-galactos¡do-galactohidrolasa (E. C. 3.2.1.23), es la enzima responsable de la hidrólisis de la lactosa en galactosa y glucosa teniendo este último más poder edulcorante que la lactosa (4). Esta enzima se usa desde hace años en la preparación de productos desfactosados a base de leche y suero (15). El tratamiento enzimático mejora los problemas de insolubilidad y de baja dulzura del producto(4). Asimismo mejora la capacidad nutricional de la leche(29) y de incrementar la utilización del suero lácteo del queso (18: 31). Las levaduras lactosa fermentativas, tales como Kluyveromyces fragílís, Kluyveromyces lactis y Candida pseudotropicalis y los hongos Aspergillus nígery Aspergillus oryzae, son las principales fuentes de enzima y las más usadas comúnmente para su preparación (32).

Los factores que afectan la biosíntesis de la lactasa ( medio de cultivo, pH temperatura, aereación, agitación) de Kiuyveromyces fragilis (sinónimo de Kluyveromyces marxianus) han sido reportados (1, 7,10,14, 22,29).

El presente estudio pretende diseñar un proceso optimizado para la producción y extracción de B-galactosidasa a partir de cinco cepas de Kiuyveromyces marxianus NRRL-Y- 1109, 1207,1151, 1175 y 1196 y una cepa de Candida pseudotropicalis NRRL-Y-329, en medios químicamente formulados. Se determinará algunas propiedades de la enzima.

MATERIALES Y METODOS

Microorganismos y medio de mantenimiento. Se utilizaron 6 cepas de levaduras con capacidad de utilizar lactosa como fuente de carbono: 5 cepas de Kluyveromyces marxíanus NRRL-Y-1 109, 11751 1151, 1207, 1196 y una cepa de Candida pseudotropícalis NRRL-Y-329, procedentes de la Northern Regional Research Laboratory (NRRL), pertenecientes a la colección de levaduras del laboratorio de Microbiología Ambiental y Biotecnología de la Facultad de Ciencias Biológicas Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Las levaduras fueron mantenidas en Agar inclinado YPL(25) con la siguiente composición: Lactosa 1 %, Peptona de caseína 1 %, Extracto de levadura 0.3% y Agar 1.5% (Sigma y Merck), y conservados a 4°C, transferidos mensualmente y verificados en su pureza,

Selección de cepas de levaduras con potencial de producción de B-galactosidasa. Los inóculos fueron preparados en matraces de 500 mi con 50 mi de caldo YPL con la siguiente composicion: Lactosa 2%; Extracto de levadura 0.3%, Peptona de caseína 1%-, (NH4)2SO4 0.5%1 K2HPO4 0.5% y MgSO4 0.05%, a pH 5.5 e incubados a 30°C por 15 horas. Matraces de un litro con 90 mi de caldo Y.P.L fueron inóculados con 10% (v/v) del caldo Y P. L e incubados a 30°C con agitación constante (150 strokes/minuto). La pureza de los inóculos se verificó por microscopía.
La actividad hidrolítica de la lactasa de las levaduras fue determinada en medio
M-1 (14),con la siguiente composición: Lactosa 5%; Extracto de levadura 0.75%, (NH
4)2SO4 0,84%, K2H 0.45% y MgSO4 0.05%. Matraces de un litro con 90 ml del medio M-l, a pH 5.5 fueron inóculados con 10% (v/v) del caldo Y P. L e incubados a 30°C por 12 horas con agitación constante (150 strokes/minuto).

Optirnización de la producción de B-galactosidasa sobre medio químicamente formulado. Se siguió el diseño factorial propuesto por Chen (8) que permitió evaluar la influencia de la lactosa, extracto de levadura, (N H, )2SO4 y K2HP04, sobre la producción de B-galactosidasa de Kluyveromyces marxianus NRRL-Y-1 109. Los parámetros de fermentación fueron: pH 5.5, temperatura 30°C, agitación 150 strokes/min. El volumen de ensayo fue de 90 mi en matraces de un litro, con 10% v/v de inóculo.
El inóculo se preparó a partir de la cepa mantenidas en agar inclinado
YPL, la cual fue transferida a matraces de 500 mi conteniendo 50 mi de medio de cultivo con la siguiente composición: lactosa 2%,
(NH
4)2SO4 0.84%, extracto de levadura 0.75%, K2H P04 0.45% y MgSO4 0.05%.

Los factores evaluados se distribuyeron aleatoriamente, siguiendo el diseño factorial propuesto. El diseño factorial aplicado comprende 3 niveles siendo estos: concentración de lactosa 25.0, 50.0 y 75.0 g/l, concentración de (NH 4)2 SO, 5~O, 7.5 y 10.0 g/l concentración de extracto de levadura 2.5. 5.0 y 7.5 g/l. concentración de K2HPO4 3.0, 4.5 y 6.0 9/l.

Extracción de la enzima Para la extracción de la enzima se siguió el procedimiento descrito por Mahoney y Fenton (13, 22). Células frescas de un cultivo fueron centrifugadas a 20,000 rpm por 20 minutos en una centrifuga refrigerada MIKRO RAPID a 4°C. Las células lavadas fueron tratadas con 1 a 3% de tolueno (Sigma) (v/v) bajo agitación por 90 minutos a 30°C. La extracción de la enzima se realizó en tampón fosfato de potasio a concentraciones de 0.001 M a 1 M, a pH 6.0-8.0. suplementado con 1 mM de sulfato de magnesio y 0. 1 mM de sulfato de manganeso (tampón suplementado). El tiempo de extracción fue de 15 a 20 horas. a temperaturas de 22 a 37°C.

Purificación parcial de la enzima. Se trabajo con un cultivo freso, las células fueron centrifugadas a 10,000 rpm por 20 minutos a 4°C. Se descarto el sobrenadante y las células fueron tratadas con 2% de tolueno (v/v) por 90 minutos bajo agitación (133 22), se adicionó el tampón suplementado y se mantuvo por 15 horas a 30°C, Se centrifugaron a 10,000 rpm por 20 minutos a 41°C. Se recolecto el sobrenadante con una actividad de 156 U LACTWN se adicionó un volumen de acetonaa 4°C. La acetona residual fue evaporada en un flujo de aire y el precipitado fue redisuelto en un volumen de tampón suplementado y ditioeritritol 1 mM como estabilizador.

Propiedades de la enzima soluble. El pH óptimo y temperatura para la actividad de la enzima se determinó en un rango de pH de 5.8 - 8-0 a 40°C y para la temperatura un rango de 25 a 55°C, usando lactosa 58 mM preparada en tampón suplementado 0. 1 M. Los valores de Km y Vm para concentraciones de lactosa entre 5 - 100 mM para la enzima fueron determinados por el método de Lineweaver­Burk. Para la constante de inhibición K¡ se utilizaron las mismas concentraciones utilizadas para la determinación de Vim y Km adicionándole a cada concentración galactosa 28 mM, La termoestabilidad de la enzima se determinó entre 25 y 55°C. Las muestras fueron mantenidas por 15 minutos a las temperaturas indicadas en tampón suplementado 0. 1 M y luego colocadas en un baño de hielo.

Determinación de la actividad enzimática. La actividad enzimática fue determinada espectrofotométricamente en un espectrofotómetro SPECTRONIC 20D MILTON ROY, siguiendo el procedimiento descrito por Mahoney y col, (27), utilizando como substrato 1.25 mM de O-Nitrofenil 13-B-ga lactopiranósido (ONPG) en tampón suplementado 0. 1 M, pH 6.6. Tampón que se utilizará en todas las determinaciones de actividad enzimática. La mezcla de reacción contenía 2 mi de ONPG y 0.1 mi de¡ extracto enzimático (dilución apropiada), luego se incubó a 400C durante 2 minutos, la reacción fue detenida con 0.9 mi de Na 2 Co 3 0.5 M y se leyó a 420 nm comparándose los resultados con una curva estándar de O-Nitrofenol (Sigma).

La actividad de la enzima también fue determinada con lactosa (Sigma), a concentraciones de 58 mMl en tampón suplementado 0. 1 M. La mezcla de reacción contenía 2 ml de la solución de lactosa y 0.1 ml de la enzima.
La glucosa liberada fue determinada por el método de la glucosa oxidasa(Sigma), La unidad de actividad de G-galactosidasa es definida como la cantidad de enzima que libera un micromol de O-Nitrofenol o glucosa por minuto por miligramo de proteína.

 Análisis. El peso seco de las levaduras fue determinado gravimétricamente para lo cual se extrajeron muestras de (cultivo de 5 ml las cuales fueron centrifugadas a 10,000 r.p.m. por 20 minutos a 4°C y lavadas dos veces con agua destilada y transferidas a placas petri de 1 OX75 mm previamente pesadas, dejadas secar toda la noche en la estufa a 100°C MEIVIMERT S 30 y pesados en una balanza analítica SARTORIUS.
La lactosa se determinó de acuerdo al método de Miller (27) empleando el ácido 3,5 Dinitrosalicílico (Sigma).
La proteína fue determinada por el método de Lowry (21) empleando el reactivo Folin­Ciocalteau yseroalbúmina de bovino 0.1
mg/ml (Sigma) como estándar.

RESULTADOS Y DISCUSION

Selección de las cepas de levaduras con potencia¡ de producción de B-galactosidasa. Los resultados de la actividad específica y de unidades de actividad por miligramo de peso seco de las levaduras productoras de B-galactosidasa en lactosa y ONPG como substratos son mostrados en la tabla 1. La levadura Kluyveromyces marxianus NIRRL-Y-1109, maxímiza la respuesta, en relación a la actividad específica y a las unidades de actividad por miligramo de peso seco. Siendo estos valores de 14.5 U/mg de proteína y de 3.5 Unidades de actividad por mg de peso seco para lactosa y de 5.43 U/mg de proteína y de 1.31 Unidades de actividad/ mg de peso seco para ONPG, en contraste con los valores obtenidos por Mahoney y Witaker (22) de 8.39 Ulmg proteína y 3.29 U.Al mg peso seco y 3.11 U/mg proteína y 1.22

Tabla 1. Selección de cepas productoras de B- Galactosidasa en medio M-I

Cepas Actividad enzimática sobre ONPG como substrato Actividad enzimática sobre Lactosa como substrato
Proteína mg/ml Actividad Específica U/mg proteína Unidades
de
Actividad/
mg peso
seco
Proteína
mg/l
Actividad específica
U/mg
proteína
Unidades
de
Actividad/
mg peso
seco
Kluyvermyces marxianus
NEEL -Y-1109
Kluyvermyces marxianus
NRRL-Y-1151
Kluyvermyces marxianus
NRRL-Y-1196
Kluyvermyces marxianus
NRRL-Y-1175
Kluyvermyces marxianus
NRRL-Y-1207
Candida pseudotropicalis
NRRL-Y-329
2.15

1.91

1.99

1.91

1.97

1.84
14.50

13.58

12.8

12.2

12.02

11.00
3.50

2.92

3.23

2.53

3.05

2.68
2.15

1.91

1.99

1.91

1.97

1.84
5.43

5.07

4.80

4.53

4.44

4.05
1.31

1.09

1.22

0.94

1.13

0.99

U.A/mg peso seco para lactosa y ONPG respectivamente.

Optimización de medio de cultivo para la producción de B-galactosídasa de K. marxianus. El análisis estadístico del diseño factorial simplificado se muestran en la tabla 2, en base a solo 15 experimentos, tuvo como objetivo encontrar las variables que maximizen tanto la actividad específica, como las unidades de actividad por miligramo de peso seco. El modelo que permite encontrar las variables(factores) que influyen significativamente en el diseño factorial con una confiabilidad del 95% fue el de paso a paso (9, 17). Los factores obtenidos fueron factor B [ (NH4)2SO4] factor C (extracto de levadura) y factor D (K2HPO4) y la interacción de ellos. El factor A (lactosa) no influye significativa mente en el diseño factorial empleado, sin embargo con las concentraciones usadas y la interacción de los otros factores maxímizan las respuestas de actividad específica y unidades por miligramo de peso seco para las variables significativas en el nivel 2 del diseño.

Los valores que permitieron obtener las mejores respuestas en el nivel 2 corresponden en g/l a: lactosa 50.0, (NH4)2SO4 7.5. extracto de levadura 5-0 y K2HP04 4.5. Con estos valores se obtuvieron 1330 unidades de ONPS por gramo de biomasa. Valores entre 1049 a 4000 un¡dades de ONPG de actividad por gramo de biomasa fueron obtenidos en medios conteniendo entre 45 y 150 g/l de lactosa (5, 14, 19. 22 ). A un nivel de 75 g/l de lactosa no se obtuvo un mayor rendimiento de unidades de actividad de la enzima esto podría ser debido a las características fermentativas de Kluyveromyces marxianus y a la interacción de los otros factores. Esta levadura tiene un efecto «crabtree» negativa, en la cual etanol es producido bajo condiciones de oxígeno limitante. Los cultivos en matraces agitados se consideran limitados de oxígeno y por esta razón exhiben una larga fase de crecimiento restrictivo asociado a la producción de etanol(20, 26).
Con un nivel de 25 g/l se obtuvieron menores rendimientos, esto podría deberse a que la concentración de lactosa presente en el medio y la interacción de los otros factores no permitieron una adecuada síntesis de la enzima (10,12)

Extracción de la enzima.- Los resultados se muestran en la tabla 3. Las condiciones óptimas fueron obtenidos cuando se empleo 2% de tolueno (v/v). tampón fosfato de polasio suplementado 0.1 M, pH 7.0 ± 0.1, 30°CI y 15 horas de extracción. Tiempos de 17 y 21 horas bajo condiciones similares han sido reportados para Kluyveromyces. marxianus. (13,22).

El resultado de la purificación parcial de la enzima se muestra en la tabla 4. La purificación parcial con acetona permitió obtener una actividad específica de 73 ULACTOSA/mg de proteína y un rendimiento de pur cacion de 93.3%. Valores de 89 y 97% son reportados (16,23).

Propiedades de la enzima. El perfil de temperatura se determinó entre 25 y 55°C a pH 6.6. La temperatura óptima fue de 40°C (Fig1).

Tabla 2. Respuesta factorial de la optimiza

N° de
Experimento

Factores

Concentración
celular (g/l)
Rendimiento
Y x/s
Proteína
(mg/ml)
Respuesta
Actividad
Específica
U/mg proteína
Respuesta
Unidades Actividad
ONPG/mg.
Peso seco
celular
Unidades de
Actividad
ONPG/I
A B C D
(NH4)2SO4
g/l
E. Levadura
g/l
K2HPO4
g/l
g/l
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
25
50
25
50
25
50
25
50
75
50
75
50
75
50
75
5.0
5.0
7.5
7.5
5.0
7.5
5.0
7.5
7.5
10.0
10.0
7.5
10.0
7.5
10.0
2.5
2.5
5.0
2.5
5.0
5.0
2.5
5.0
5.0
7.5
5.0
7.5
7.5
5.0
7.5
3.0
4.5
4.5
3.0
4.5
3.0
4.5
4.5
4.5
6.0
4.5
6.0
4.5
6.0
6.0
8.06
8.17
8.53
8.09
7.71
8.35
7.90
8.92
7.97
8.32
8.28
8.88
8.35
8.24
8.24
0.306
0.160
0.322
0.158
0.289
0.158
0.297
0.170
0.101
0.156
0.104
0.168
0.104
0.155
0.104
2.07
2.10
2.00
2.00
2.18
2.51
2.22
2.17
2.10
2.25
2.11
2.14
2.12
2.52
2.27
4.08
4.08
4.59
5.28
4.50
4.37
4.67
5.45
4.48
4.56
4.97
5.27
5.25
4.34
4.42
1.045
1.045
1.070
1.300
1.275
1.310
1.320
1.330
1.175
1.320
1.265
1.265
1.330
1.310
1.220
8,423
8,538
9,127
10,517
9,830
10,939
10,428
11,864
9,365
10,982
10,474
11,233
11,106
10,794
10,053

 

Tabla 3. Condiciones óptimas para la extración de B-Galactosidasa de Kluyveromyces marxianus NRRL-Y-1109.

   Factores Promedio Intervalo de confianza 99%
Actividad específica
U/mg proteína
Unidades de
ActividadONPG/
mg peso seco
Actividad
específica U/mg
proteína
Unidades de
ActividadONPG/
mg peso seco
Concentración
de Tolueno (%)
1
2
3
Tiempo de
Extracción (h)
15
17
20
Temperatura (°C)
22
30
37
pH
6.6
7.0
7.4
Tampón fosfato
depotasio (M)
0.001
0.1
1
 
 
3.37
4.07
2.87


3.62
3.39
3.31
 
3.43
3.85
3.57

3.61
3.85
3.40


3.54
3.93
3.38
 

0.84
1.19
0.91


1.00
0.98
0.97

1.00
1.16
1.10

1.05
1.16
1.05


0.97
1.20
1.09
 

3.31-3.43
4.01-4.13
2.81-2.92


3.56-3.68
3.33-3.45
3.25-3.37

3.32-3.55
3.73-3.97
3.45-3.69

3.48-3.72
3.73-3.97
3.28-3.51


3.42-3.66
3.81-4.05
3.26-3.50
 

0.83-0.86
1.18-1.20
0.90-0.92


0.99-1.01
0.97-0.99
0.96-0.98

0.99-1.03
1.13-1.18
1.07-1.12

1.03-1.07
1.14-1.19
1.03-1.07


0.94-0.99
1.18-1.23
1.07-1.12

 

Tabla 4. Purificación parcial de la enzima

Procedencia Volúmen
(ml)
Actividad
U/ml
Proteína
(mg/ml)
A. Específica
U/mg proteína
Unidades
totales
Rendimiento
(%)
Extracto crudo
Precipitación con acetona
300
10
155.63
4330
5.36
59.4
29.02
72.90
46,689
43,300
100
93.3

 

pag19_fig1.jpg (19759 bytes)

Figura 1. Perfil de temperatura

 

pag20_fig2.jpg (19910 bytes)

Figura 2 :Perfil de pH

 

pag20_fig3.jpg (19327 bytes)

Figura 3 :Estabilidad de la enzima

 

pag20_fig4.jpg (23906 bytes)

Figura 4 :Constantes cinéticas Km, Vm, Ki

El perfil de pH se determinó en un rango de 5,8 y 8.0, utilizando tampón suplementado 0. 1 M. La maxima actividad se obtuvo a pH 6.6. (Fig 2). Los resultados de la estabilidad de la enzima a la temperatura se muestran en la figura 3. La mayor actividad relativa se obtuvo a 25°C, reteniendo 88% de la actividad original a 40°C y un 3.3% a 55°C. La vida media de la enzima fue de 56 minutos. Una hora de vida media es reportado (19).

Usando lactosa como substrato a varias concentraciones se obtuvo un valor de Km de 15 mM y una Vm de 7.3 x 10-15 M/min. La constante de inhibición fue de 15 mM. (Fig 4). Los valores obtenidos son similares a los reportados (3,4,11,19).

CONCLUSIONES

La cepa de Kiuyveromyces marxianus NRRL­Y-1109 demostró ser la mejor productora de B-galactos idasa sobre medio M-l. Los mejores rendimientos de la enzima se obtuvieron con lactosa 5%, extracto de levadura 5%, (NH4)2SO4 0.75% y K2HPO4 0.45%. Las óptimas condiciones establecidas para la extracción de la enzima incluyeron 2% de tolueno (v/v), pH 7.0 ± 0. 1, 15 horas de tratamiento, a 30°C en tampon suplementado 0. 1 M. Se obtuvo 93.3% de rendimiento en la purificación de la enzima con acetona.

Agradecimiento: El presente trabajo fue parcialmente financiado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología del Perú CONCYTEC, convenio No.6868-09-94-OAI. El agradecimiento a la Magister Fatima Medina de la Facultad de Matemáticas de la UNMSM por el análisis estadístico del presente trabajo

Ver Bibliografía

 

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