C. REACTIVOS:
Todos los reactivos fueron de grado analítico. El carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, ácido clorhídrico, fosfato monosódico, fosfato disódico y peróxido de hidrógeno fueron adquiridos de E. Merck. Epinefrina, EDTA, BSA, ác. tiobarbitúrico, CDBN y GSH fueron obtenidos de Sigma Chemical Co. la vitamina E fue una donación de Química Suiza.

Las ratas fueron colocadas individualmente en jaulas metálicas en un ambiente iluminado y ventilado. Se les proporcionó doce horas de luz y doce horas de oscuridad y temperatura ambiente de 26 ± 1 grado C. El tratamiento fue por 12 semanas (corto plazo) [15].

Después de 12 semanas, se sacrificaron los animales por decapitación e inmediatamente se extrajo el hígado, se colocó en baño de hielo y luego se procedió a la limpieza, pesado y separación (1,5 g) de una porción de hígado del lóbulo más grande que se lavó con el medio de homogenización para eliminar la sangre (tres veces). El homogenizado al 10 % p/v fue preparado en un homogenizador de vidrio tipo Potter-Elvehjem con émbolo de teflón. El medio de homogenización contenía 50 mmol/L de buffer fosfato de sodio pH 7,0.

El homogenizado fue centrifugado a 750 g X 10 min para eliminar células intactas, núcleos y restos de membrana celular. Una segunda centrifugación del sobrenadante a 9 800 g X 15 min para eliminar mitocondrias y una tercera centrifugación para obtener "citosol", el sobrenadante de la segunda centrifugación se llevó a 22 000 g X 100 min. Todas las centrifugaciones fueron hechas en una centrífuga Sorvall tipo RC2-B, rotor SS34 a una temperatura entre 0 y 5 grados centígrados.

1. Medida de lipoperoxidación:
Se realizó según la técnica de Buege y Aust [5] con algunas modificaciones, midiendo la producción de malondialdehído que al reaccionar con el TBA, forma un complejo coloreado que se lee a 535 nm.
El procedimiento fue: 0,5 mL de homogenizado más 1,0 mL de TCA al 20 % se lleva a baño maría hirviente por 10 min, se enfría y se agrega 1,5 mL de TBA al 0,67 % HCl 0,25 N, se lleva otra vez a baño maría hirviente por 30 min. Se enfría en agua helada y se centrifuga a 4 000 rpm por 10 min, se extrae el sobrenadante y se lee.
Para los cálculos se utilizó el coeficiente de extinción molar 1,56 X 10⁵ mmol^-1cm^-1 del complejo coloreado formado por el malondialdehído-tiobarbitúrico.

2. Actividad de SOD:
Se utilizó el método de Misra y Fridovich [37] modificado por Sun y Zigman [47], que se basa en la capacidad de la SOD de inhibir la autooxidación de la epinefrina a adrenocromo.
La cubeta de reacción contenía 2,94 mL de buffer carbonato 0,05 mol/L pH 10,2,EDTA 1 X 10^-4 mol/L y 10 uL de citosol. La reacción se inicia adicionando 50 uL de epinefrina 5,5 mg/mL. Se lee a 320 nm.
Los cálculos se hicieron a partir de los datos obtenidos de la porción lineal de la cinética de reacción.
La unidad SOD se define como la cantidad de enzima que inhibe la autooxidación del 50 % del total de epinefrina presente en la reacción.

3. Actividad de Glutation transferasa:
Se realizó por la técnica de Habig y colaboradores [28].
El fundamento de la reacción es la capacidad del GSH de conjugarse con el CDNB. El incremento de la absorbancia a 340 nm por 1 min, es directamente proporcional a la actividad de la enzima presente.
En la cubeta de ensayo de 1 mL se coloca 940 uL de un tampón que contiene buffer fosfato 0,1 mol/L pH 6,5 y 3,3 mg de GSH, se añade 40 uL de una solución etanólica de CDNB al 0,5065 g %, se incuba a 25 grados centígrados por 5 min y la reacción se inicia añadiendo 20 uL de citosol.
Para los cálculos se hace uso del coeficiente de extición molar del CDNB 9,6 mM^-1m^-1.

4. Determinación de proteínas:
Las proteínas del homogenizado y del citosol se realizaron según la técnica de Lowry [34].
Las mediciones espectrofotométricas se realizaron en un Gilford modelo 240, el registrador también Gilford modelo 6051 y en un espectro LKB modelo Ultrospec II, conectado a una computadora Apple.

5. Análisis estadístico:
Se realizó mediante un análisis de varianza de entrada simple, cuando los grupos resultaron en diferencias significativas, se sometieron además a un análisis por pares según el método de Fisher [21].