COMPARACIÓN DE
UNA PRUEBA DE ELISA ESTÁNDAR Y ELISA DE RANGO EXTENDIDO PARA LA ENFERMEDAD INFECCIOSA DE
LA BURSA EN AVES
Magali Salas M.1, Eliana Icochea D’A.2 y César Gavidia Ch.3
. RESUMEN
.
INTRODUCCIÓN
.
MATERIALES Y MÉTODOS
. RESULTADOS
. DISCUSIÓN
.
CONCLUSIONES
RESUMEN
Se utilizaron 180 muestras de suero pareadas procedentes de 3 lotes de reproductores
abuelos y padres de pollos de carne y gallinas de postura, testadas entre 1 a 3 días, 16
y 27 semanas de edad para detectar anticuerpos contra el virus de la Enfermedad Infecciosa
de la Bursa, por la prueba de ELISA. Se compararon dos kits comerciales de ELISA, uno
convencionalmente usado “ ELISA IBD” y uno nuevo de Rango Extendido denominado
“ ELISA IBD-XR”. La prueba de ELISA IBD-XR detectó más títulos que la prueba
de ELISA estándar. Los reproductores padres de carne mostraron los mayores niveles de
anticuerpos mostrando tener mejor capacidad de respuesta inmune que las reproductoras
abuelas y las gallinas de postura. La distribución de títulos entre ambas pruebas
mostró mayor uniformidad en la prueba de ELISA Estándar que en la de Rango Extendido,
sin embargo, a diferencia de la prueba de ELISA Estándar todos los títulos estuvieron
por encima de los rangos mínimos aceptables (p<0.05). Estos resultados permiten
concluir que el nuevo kit de ELISA de Rango Extendido fue más eficiente en detectar
anticuerpos contra el virus de la Enfermedad Infecciosa de la Bursa que el Kit de ELISA
Estándar.
Palabras clave: Virus de la Enfermedad Infecciosa de la Bursa (VEIB), anticuerpos,
ELISA Estándar (ELISA IBD), ELISA de Rango Extendido (ELISA IBD-XR)
SUMMARY
A total of 180 paired serum samples from 3 breeder groups (broiler’s grandparents and
parents), and layers) were used to detect antibodies against the Infectious Bursal Disease
virus through the ELISA test. Animals were tested at three ages (1-3 days, 16, and 27
weeks of age). Two commercial kits were tested: the standard ELISA (ELISA-IBD) and the new
named Extended Range ELISA (ELISA-XR). The latter detected higher titres of antibodies
than the ELISA-IBD. Broiler’s parents had the higher levels of antibodies indicating
better immune response than the other two groups. The titre distribution had a more
uniform distribution using the ELISA-IBD rather that the ELISA-XR; however all titres were
above the minimum accepted ranges when the ELISA-XR was used (p<0.05). The results
indicated that the new ELISA-XR was more efficient in detecting antibodies against the
Infectious Bursal Disease virus.
Key words: Infectious Bursal Disease virus (IBDV), antibodies, ELISA Standard (ELISA
IBD), ELISA of Extended Range (ELISA IBD-XR)
|
Una de las enfermedades
que causa más daño en la economía de las empresas avícolas es la Enfermedad Infecciosa
de la Bursa (EIB), caracterizada principalmente por su efecto de inmunosupresión en su
presentación subclínica. Este virus tiene predilección por atacar los linfocitos B
inmaduros de aves jóvenes, atrofiando la Bursa de Fabricio, lo cual causa graves daños
en el sistema inmune del ave.
Durante los últimos años y debido a los cambios observados en el comportamiento del
virus de la Enfermedad Infecciosa de la Bursa (VEIB) como la aparición de cepas
variantes, la empresa privada4 ha desarrollado un kit de ELISA denominado ELISA de rango
extendido para la detección de anticuerpos contra el VEIB. El kit está basado en la
misma técnica de la prueba de ELISA estándar, utilizada convencionalmente, pero emplea
como antígeno la proteína VP2 para recubrir las microplacas, parte hipervariable del gen
que la codifica, con lo cual ha demostrado tener una mejor detección de anticuerpos
específicos para una amplia variedad de antígenos del VEIB. Esta técnica es capaz de
detectar tanto cepas clásicas como las variantes (Jackwood, 1997). El programa particular
de ELISA, FlockChek, con el cual se trabajó en el presente estudio, permite estimar la
cantidad de anticuerpos presente en una muestra de suero en particular.
La utilización de la prueba de ELISA, como un sistema de chequeo de parvadas, es el
método más efectivo, ya que permite hacer un seguimiento de títulos y detectar
anormalidades en la curva de anticuerpos, en com- paración a un estándar establecido por
cada empresa. El responsable de la producción utiliza esta información para identificar
y manejar efectivamente un problema de salud en los lotes de aves.
El objetivo del presente estudio fue comparar dos pruebas serológicas: la prueba de ELISA
Estándar y el ELISA IBD-XR para la detección de anticuerpos contra el VEIB.
Muestra
El tamaño de muestra se obtuvo mediante la fórmula de diferencia de medias. Para el
presente trabajo, el tamaño de muestra fue de 20 aves por lote, siendo el total de lotes
igual a 9 (n=180). Para el estudio, las aves fueron agrupadas tomando en cuenta el tipo de
explotación (3 grupos) y la edad (3 grupos) como se detalla en el Cuadro 1.
Las muestras de sangre fueron colectadas mediante punción de la vena braquial con agujas
desechables 21G x 11/2, en frascos de vidrio estériles, identificadas adecuadamente, y
almacenadas en refrigeración a +4ºC hasta su uso análisis.
Pruebas de ELISA
Las 180 muestras de suero pareadas fueron evaluadas simultáneamente por la prueba de
ELISA Estándar (IBD) y ELISA de Rango Extendido (IBD-XR) para la detección de
anticuerpos contra el VEIB.
Los materiales y reactivos utilizados son los mismos para las dos pruebas, con la
diferencia que el antígeno es de origen bursal (gp58) para el caso del ELISA Estándar, y
de origen viral (VP2) para el caso del ELISA de Rango Extendido.
Controles Positivo y Negativo
Para que el ensayo sea válido, la diferencia entre la absorbancia promedio para el
control positivo y el control negativo (CPx-CNx) debió ser mayor que 0.075. La
absorbancia promedio para el control negativo debió ser menor o igual que 0.150. La
presencia o ausencia de anticuerpos contra el virus IBD se determinó por medio de una
relación entre el valor de A(650) de la muestra con el promedio para el control positivo.
El control positivo está normalizado y representa concentraciones significativas de
anticuerpos anti-IBD en el suero de pollo. La concentración relativa de anticuerpos en la
muestra se determinó a través del cálculo del cociente de la absorbancia de la muestra
con respecto a la del control positivo (M/P).
Cuadro 1. Distribución de los lotes
de trabajo por líneas de explotación y edad
|
Tipo de reproductores |
1-3 días |
16 semanas |
27 semanas |
Abuelos de carne
Padres de carne
Postura |
Lote A
Lote B
Lote C |
Lote D
Lote E
Lote F |
Lote G
Lote H
Lote I |
Interpretación
Las muestras de suero que tuvieron cocientes M/P inferiores o iguales a 0.2 fueron
consideradas negativas. Los cocientes M/P superiores a 0.2 (títulos superiores a 396)
fueron considerados positivos indicando que hubo inmunización o exposición al virus IBD
(IDEXX Laboratories, 1999).
Análisis Estadístico
Se aplicó el análisis de varianza de una sola vía para analizar las pruebas
serológicas comparando cada etapa de vida y línea comercial. La prueba de Tukey fue
aplicada para determinar diferencias entre promedios.
En el Cuadro 2 se puede
observar que la prueba ELISA IBD-XR incrementó la capacidad en la detección de
anticuerpos, comparado con la prueba ELISA Estándar para la EIB (p<0.05). Por otro
lado se pudo apreciar que los tres lotes de aves evaluadas mostraron el mayor nivel de
anticuerpos a las 27 semanas. Así mismo, se puede observar que las reproductoras de carne
poseen un perfil de respuesta inmune que sigue una tendencia ascendente para alcanzar su
máximo nivel a las 27 semanas de edad. Las diferencias estadísticas entre promedios
encontrados entre lotes de diferentes edades según la prueba utilizada se muestran en el
Cuadro 2.
Los resultados indican que si bien se obtuvieron mayores títulos de anticuerpos con la
prueba de ELISA IBD-XR en comparación con el ELISA Estándar, se obtuvo mayor uniformidad
con la prueba del ELISA Estándar que con la prueba ELISA IBD-XR (Cuadro 3).
En la crianza de aves
reproductoras, ponedoras comerciales y pollos de carne se aplican intensos programas de
vacunación. Sin embargo, un programa de vacunación es incompleto si no incluye el
monitoreo serológico periódico a través del ciclo de vida a fin de determinar si el
lote experimentó algún desafío en campo y evaluar la eficacia de la vacunación
(Zander, 1997).
Cuadro 2. Títulos promedio
por la prueba ELISA Estándar (E) y de Rango Extendido (RE) en reproductores de carne
abuelos y padres, y reproductoras de postura, en muestras colectadas a tres edades.
|
| Tipo de
reproductores |
Edad |
| 1-3 días |
16
semanas |
27
semanas |
| E |
RE |
E |
RE |
E |
RE |
Abuelos de
Carne
Padres de Carne
Postura |
2,585a
4,204b
3,282ab |
4963a
9453b
4279a |
3124a
5090b
2278a |
3785a
10615b
4154a |
7247a
6953a
4197b |
14,024a
18530b
5131c |
| a,b,c Valores con letras
diferentes entre columnas(prueba de ELISA entre lotes de una misma edad) son
estadísticamente diferentes (p < 0.05) |
Cuadro 3. Coeficiente de
variación obtenidos por la prueba ELISA Estándar (E) y de Rango Extendido (RE) en
reproductoras de carne abuelos y padres, y reproductoras de postura, en muestras
colectadas a tres edades.
|
Tipo
de reproductores |
Edad |
| 1-3 días |
16
semanas |
27
semanas |
| E |
RE |
E |
RE |
E |
RE |
Abuelos de Carne
Padres de Carne
Postura |
2,585a
4204b
3282ab |
4963a
9453b
4279a |
3124a
5090b
2278a |
3785a
10615b
4154a |
7247a
6953a
4197b |
14024a
18,530b
5131c |
| a,b,c Valores con letras
diferentes entre columnas (prueba de ELISA entre lotes de una misma edad) son
estadísticamente diferentes (P < 0.05) |
La prueba de ELISA
es la prueba serológica más usada en la evaluación de anticuerpos del virus de la
Enfermedad Infecciosa de la Bursa (Lukert y Saif, 1997). Durante la última década,
debido a la presión los pollos de carne sería más alta que la que recibirán las
pollitas de postura comercial. Se ha afirmado que la inmunidad materna en estos dos
últimos tipos de aves es de menor interés, porque este tipo de aves son sometidas a
estrictas condiciones de aislamiento de granja, medidas de bioseguridad y manejo, a
diferencia de los pollos de carne donde la exposición a agentes infecciosos puede ocurrir
tan temprano como al primer día de edad, siendo la inmunidad pasiva en este caso de vital
importancia (Zander, 1997). De otro lado, los pollos de carne son mucho más susceptibles
a la EIB que pollitas o reproductoras como consecuencia del estrés fisiológico que
produce su alta tasa de crecimiento (Lukert y Saif, 1997).
La lectura del histograma de la prueba de ELISA expresa principalmente dos valores: el
nivel o título de anticuerpos y la uniformidad de los mismos. Referente a esto último,
la distribución de títulos entre ambas pruebas mostró una mejor uniformidad en la
prueba de ELISA Estándar que en la de Rango Extendido (Cuadro 3). Sin embargo se
considera que el efecto de la desuniformidad sobre el lote de aves sería negativo si
alguna de las muestras estuviera por debajo del mínimo permisible, para garantizar una
transferencia de inmunidad pasiva adecuada de las reproductoras a la progenie
(5,000-7,000), o si estos están por debajo de los niveles que indican protección contra
un desafío de campo (500). Títulos por debajo de las cifras señaladas fueron obtenidos
en la prueba de ELISA Estándar pero no en la de IBD-XR. Estos hallazgos permiten concluir
que el nuevo Kit de ELISA es superior al convencionalmente usado. Sin embargo su
introducción en los laboratorios de diagnóstico tomará tiempo porque las compañías
avícolas tienen establecidas sus líneas de base de títulos de anticuerpos para
vacunación o desafío de campo en función del ELISA Estándar.
La prueba ELISA IBD-XR
detectó mayor nivel de anticuerpos contra el virus de la Enfermedad Infecciosa de la
Bursa que la prueba de ELISA Estándar en los nueve lotes analizados, demostrando tener
mejor capacidad para la detección de anticuerpos contra el VEIB.
Bibliografía
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1
Práctica privada
2 Laboratorio de Patología Aviar y Producción Avícola,
FMV-UNMSM.
E-mail: micochead@vet.unmsm.edu.pe
3 Laboratorio de Medicina Veterinaria Preventiva, FMV-UNMSM
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