| Rev Inv Vet Perú. Vol.
12 • Nº 1 • 2001 |
CONSERVACIÓN DE SEMEN CAPRINO EN
LOS DILUTORES
CITRATO-YEMA Y LECHE-DESCREMADA YEMA
Lily Palomino T.1, José
Camacho S.2, Wilfredo Huanca L.3
y Néstor Falcón P.4
Abstract |
Introducción
La inseminación artificial (IA), una de las biotecnologías de gran relevancia que se viene desarrollando desde hace varios años y que permite un rápido avance genético, con el mejor aprovechamiento de los sementales de características productivas superiores. El éxito de la IA depende en gran medida del desarrollo de diluyentes satisfactorios para el semen, el cual debe incrementar el volumen de un eyaculado, proteger a los espermatozoides durante el enfriamiento y prolongar su vida con un mínimo efecto sobre la fertilidad.
La IA en caprinos es limitado en comparación con otras especies, debido entre otros factores a la dificultad para congelar y descongelar el semen, ya que algunos diluyentes pueden resultar tóxicos para los espermatozoides.
Actualmente en el mercado existe un número variable de diluyentes comerciales, como; el Illini variable temperatura (IVT), Laiciphos, caprogen, entre otros, pero dentro de los más aplicables y efectivos, considerados así por diversos autores, tenemos a los dilutores citrato-yerna y leche descremada-yema.
Los dilutores conteniendo yema de huevo son beneficiosos en la preservación de la fertilidad de espermatozoides, en la protección contra el shock por frío y variaciones de temperatura de conservación, por las lipoproteinas y lecitinas contenidas en la yema de huevo. La leche descremada usada como dilutor también protege del shock por frío a los espermatozoides manteniendo su fertilidad, debido a la caseína presente en la leche (Cole y Cupps, 1977).
Este trabajo tuvo por objetivo evaluar "in v¡tro" la eficiencia de la solución citratoyema y leche descremada-yema, como dilutores de semen caprino, siendo sometidos a T° ambiente (20-26.4°C) o refrigeración (4°C). La eficiencia de los dilutores se determinó a través de la evaluación de la motilidad masal y progresiva de las células espermáticas, hasta las 96 horas post-dilución.
Materiales y métodos
La preparación de los dilutores y evaluación del semen diluido en las soluciones citrato-yema y leche descremada-yema se realizó en el laboratorio de Reproducción de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos. La Granja Modelo PRO-CABRA, proporcionó los machos reproductores de los cuales se obtuvieron las muestras de semen.
Se seleccionaron cuatro machos de los cruces Anglo Nubia x criollos, con edades entre los 18 a 24 meses. La obtención del semen se realizó con vagina artificial dos veces por semana durante dos semanas, obteniéndose en total 16 eyaculados. La vagina artificial se mantuvo a una temperatura interna de 42°C - 45°C; el tubo colector graduado en mililitros y estéril se mantuvo a 37°C para evitar el shock por frío de los espermatozoides. Inmediatamente después de recogido el semen se procedió a la evaluación del volumen, densidad, color, pH, concentración espermática y motilidad masal, para luego ser diluidas con citratoyema y leche descremada-yema, mantenidas en baño maría a 37°C, en una dilución de 1:6 de semen y dilutor respectivamente (Simon, 1981), equivalente a 0. 1 ml (3 gotas) de semen y 0.6 ml de dilutor.
El color del semen se valoró en el mismo tubo de colección. El pH se midió con el papel tornasol, el cual varió de 6.6 a 6.8. El volumen se midió directamente en el tubo graduado de colección. La concentración espermática se determinó con una dilución de 1 en 300 en solución salina al 3% con formaldehido, para inmovilizar a los espermatozoides, y la lectura se realizó con la cámara de Neubauer. La motilidad masal del semen obtenido se estimó en base al vigor de la onda de movimiento.
Después de diluido el semen, se evaluó a las 6, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84 y 96 hrs. la motilidad masal, el porcentaje de espermatozoides vivos y el porcentaje de motilidad progresiva. Para la evaluación del semen puro se utilizó la escala de 0 a 5 y para el caso del semen diluido la escala del 0 a 100% (Evans, 1990 y Salina et al., 1988). El porcentaje de espermatozoides vivos, previa coloración con Eosina-Nigrosina (Tizol et al., 1991), se determinó observando al microscopio a 40X, 10 campos al azar, evaluándose un total de 100 espermatozoides, y para la evaluación de la motilidad progresiva se colocó una gota de semen en una lámna porta objeto, limpio y mantenido a 37°, al microscopio se observó a un aumento de 40X, en 10 campos al azar. En cada campo se evaluó la motilidad de 10 espermatozoides.
La preparación del dilutor Citratoyema descrito
por Simon (1981) se realizó de la siguiente manera:
| Citrato de Sodio | 2.9 g |
| Agua bidestilada | 100 cc |
| Penicilina | 500,000 UI |
| Estreptomicina | 2 g |
De esta solución se tomó el 80% y se le adicionó 20% de yema de huevo. El pH del
dilutor preparado varió de 6.6 a 6.8.
En la preparación del dilutor leche
descremada-yema se utilizó leche descremada líquida comercial, el cual se colocó en
baño maría sometiéndolo a una temperatura de 92- 95°C durante 10 minutos, después de
enfriar a temperatura ambiente se procedió a filtrar para eliminar la espuma y las natas.
| Leche descremada | 25 ml |
| Penicilina (solución) | 0.25 ml |
| Estreptomicina (solución) | 0.125 ml |
De esta solución se tomó el 80% y se le adicionó 20% de yema de huevo.
La dilución del semen se realizó individualmente de tal manera que en cuatro viales se depositó tres gotas de semen/vial de un eyaculado, en dos de estos se adicionaron 0.6 ml del dilutor citrato-yemalvial. Uno de estos viales se conservó a temperatura ambiente por un periodo de 96 horas y el otro se conservó a esta misma temperatura sólo por una hora y luego fue sometido a 4°C hasta las 96 horas. Los otros dos viales restantes con semen, fueron diluidos con leche descremada-yema en la misma proporción que la dilución anterior, y conservados de igual manera.
A través del análisis de tiempo a un evento (Curva de Kaplan Meier), se determinó en que tiempo la motilidad progresiva de las células espermáticas llegó al 60%, considerando el análisis de cada eyaculado en forma independiente. Utilizando las variables: dilutor, animal, día de muestra y temperatura para el análisis de regresión de Cox, se determinó las variables estadísticamente significativas, que intervienen sobre la viabilidad de los espermatozoides del semen caprino.
Resultados
De los dilutores evaluados se obtuvo mejores resultados con el dilutor citratoyema, sometido a 4°C, a comparación de la leche descrernada-yema, siendo el único dilutor que mantuvo un promedio del 60% de motilidad progresiva de los espermatozoides a las 96 horas post- dilución.
El análisis estadístico empleando las curvas de Kaplan Meier (Figuras 1, 2, 3 y 4) y la prueba de regresión de Cox determinaron que existía diferencias estadísticas significativas para el efecto del dilutor (p=0.0000) y temperatura (p=0.0000). Las variables día de muestreo (p=0.7909) y animal (p=0.4904) no ejercen ningún efecto en el modelo de regresión de Cox.
Discusión
La comparación de ambos diluyentes a diferentes temperaturas, evidenció una clara superioridad del citrato-yema como dilutor de semen caprino a diferencia de la leche descremada-yema, pero sobre todo cuando el semen diluido con citrato-yema es conservado a 4°C. Estos resultados fueron muy influenciados por las variables: temperatura y dilutor.
El semen diluido y conservado a temperatura ambiente dio resultados poco favorables. La conservación de semen a esta temperatura con el dilutor de leche descremadayema no superó las 6 horas post-dilución, mientras que con el dilutor citrato-yema la viabilidad espermática se mantuvo hasta un período de 48 horas post-dilución. En general la conservación del semen diluido a temperatura ambiente, siempre tendrá menor duración que a temperatura de refrigeración, debido a que la tasa metabólica tiende a ser proporcional a la temperatura absoluta, acumulándose con mayor rapidez los productos tóxicos.
La disminución de la temperatura ha sido el medio principal para reducir las reacciones químicas y prolongar la vida de las células espermáticas. El semen caprino diluido y conservado a una temperatura de CC dio mejores resultados, manifestado por una motilidad progresiva superior al 60% a las 96 horas post-dilución, debido a que se prolonga la capacidad de fertilización de los espermatozoides al reducir su movilidad y reacciones metabólicas, además de limitar la multiplicación de la flora microbiana de aparición secundaria mientras que con el dilutor leche descremada-yema la regular viabilidad espermática no superó las 48 horas post-dilución.
La dilución de semen caprino conteniendo citrato-yema proporcionó mejores resultados tanto a temperatura ambiente como en refrigeración a comparación de la leche descremada-yema, donde la viabilidad espermática no superó las 48 horas en ningún caso. Similares resultados han obtenido diversos investigadores con el uso de leche descremada como dilutor de semen caprino, donde las dificultades fueron generadas por la interacción del plasma seminal con los fósfolípidos existentes en dicho dilutor: Nuñes (1980 y 1993), Memon et al. (1985), Hellemann et al. (1992), Pellicer et al. (1997), Pellicer (1998) y Chemineau et al. (1999) han revelado que la Upasa bulbo uretral es la responsable del deterioro de los espermatozoides. Por otro lado Simon (1981), Salisbury et al. (1982), Bonadona (1986) y Evans (1990) manifiestan que el empleo de la leche de vaca descremada y esterilizada, como dilutor de semen, no da siempre resultados uniformes, debido a que presenta variabilidad en su composición. También algunos investigadores recomiendan el empleo de los diluyentes a base de leche cuando se practica la conservación por congelado a -79°C aún empleando la leche descremada comercial común (1.9 % de grasa), homogeneizada y esterilizada con el agregado de 15 a 20 % de yema de huevo (Bonadona, 1986).
Los mejores resultados obtenidos con el dilutor yema de huevo-citrato, debido a la composición de la yema, la que contiene fósfolípidos, lecitinas, lipoproteínas y cefalinas, sustancias a las cuales parece deberse la mayor acción protectora y su presencia en una proporción del 3 al 12 % aumenta de manera evidente la acción contra el choque de frío.
Conclusiones
De los resultados obtenidos en este trabajo se concluye lo siguiente:
- La solución Citrato Yema, a comparación de la Leche descremada Yema demostró ser mejor dilutor para la conservación "in v¡tro" del semen caprino.
- La conservación del semen caprino a 4°C arrojó resultados más constantes y favorables que a temperatura del medio ambiente.
- La dilución y conservación del semen con el dilutor Citrato-Yema, bajo condiciones de campo puede ser realizada de manera fácil, rápida y a un bajo costo, considerando que kg de citrato de sodio cuesta $10 para preparar 100 ml. dilutor sólo se necesita 2.9g. lo cual equivale a unas 500 a 2000 dosis aprox. para realizar inseminaciones a nivel intracervical o intrauterino.
Se recomienda realizar posteriores evaluaciones in vivo sobre la eficiencia de las soluciones Citrato-Yema y Leche descremada-Yema como dilutores de semen caprino, para evaluar el porcentaje de fertilidad y correlacionar con los datos de la validación in vitro.
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1 Práctica privada
2 Laboratorio de Producción Agropecuaria - FMV - UNMSM
3 Laboratorio de Reproducción - FMV-UNMSM
4 Laboratorio de Medicina Veterinaria Preventiva - FMV - UNMSM
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