SUSCEPTIBILIDAD DE ALPACAS ADULTAS A LA INFECCIÓN EXPERIMENTAL DE CORYNEBACTERIUM PSEUDO TUBERCULOSIS1 Walter Braga L.2
In order to demonstrate alpaca susceptibility to Corynebacterium pseudotuberculosis isolated from abscesses in alpacas and llamas, thirteen adult male alpacas were selected, from wich nine were intradermally inoculated in the left flank whith 1. 1 x 101 colony forming units (CFU) of C. pseudotuberculosis from llama (n=4) and alpaca origin (n=5). A control group (n=4) were inculated only with PBS. Animals were observed at pre and post inoculation stages, and sacrificed at 16, 58, 93 and 128 days. Inoculated alpacas experienced a persistent febrile response and a marked inflammation at the injection site, exuding a whiteyellowish purulent material, from which Cpseudotuberculosis was isolated. All infected animals displayed a heavily persistent leucocytosis (30 x 103 m l-1) and variations in hernatocrit (Ht), that increased from 32% to 40% at the third day post infection, while the hemoglobin values (Hb) decreased by the first day PI from 14,5 to 12,7 g dl-1. Internal abscesses were only seen by 58 day post infection, localized mainly in the renal lymph node that was heavily affected. Focalized lesions were characterized as typical pyogranulomas with a central caseous necrosis and a peripheral mantle of mononuclear cells composed mainly of macrophages, epitheliod cells and lymphocytes. More extensive lesions were associated with gross connective tissue, inflammatory mononuclear cells and abundant neutrophils envolving a central liquefaction necrosis. Steiner staining and microbiology analysis demonstrated bacterias from almost all the main lesions. In conclusion alpacas are susceptible to C pseudotuberculosis infection, with a febrile response, leucocytosis, variations in Ht and Hb values, and lesions characterized by internal abscesses mainly in renal lymph nodes, with histologic figures of granulomatous and/or a chronic suppurative lymphadenitis. Key words: Alpacas, Corynebacterium pseudotuberculosis, abscesses.
1. UNMSM-FMV-IVITA. Progreso finaciado por Internacional Foundation for Science (IFS) Suecia 2. Práctica privada
Resumen Con el fin de demostrar la susceptibilidad de la alpaca a la infección por Corynebacterium pseudotuberculosis y estudiar el desarrollo de la enfermedad causada por dicha bacteria, trece alpacas Huacaya, macho, de 2 años de edad fueron tratadas; cuatro fueron inoculadas vía intradermal en el flanco izquierdo con una dosis de 1,1 x 106 unidades formadoras de colonias (UFC) de C. pseudotuberculosis procedente de una cepa aislada en llama. Otras cinco alpacas fueron tratadas de igual manera con una cepa de dicha bacteria procedente de alpaca. Las cuatro alpacas restantes fueron inoculadas sólo con solución tampón de fosfato salino (PBS) como control. Los animales se observaron antes y después de la infección, y se sacrificaron a los 16,58,93 y 128 días postinoculación. Las alpacas experimentaron aumento de temperatura corporal y una marcada inflamación en el punto de inoculación, de donde exudaba un material purulento blanco amarillento del cual se aisló C. pseudotuberculosis. Los animales infectados desarrollaron una fuerte y persistente leucocitosis (30 x 103 ml-1), y variaciones en los valores de hematocrito, el cual se elevó de 32% a 40% el tercer día postinfección (PI), mientras que la hemoglobina disminuyó de 14,5 a 12,7 g dl-1 al primer día postinfección. Abscesos internos fueron observados desde los 58 días PI, principalmente en el nódulo linfático renal. Las lesiones histológicas iniciales consistieron en plogranulomas, con necrosis cascosa central y un manto periférico de macrófagos, C células epiteloides y linfocitos. Lesiones más extensas estuvieron dadas por una densa capa de tejido conectivo, células mononucleares y abundantes neutrófilos rodeando una gran área central de necrosis liquefactiva. Las tinciones de bacterias en los tejidos mediante la coloración de Steiner y las muestras microbiológicas donde se aisló C pseudotuberculosis, demostraron bacterias en casi todas las lesiones principales. El presente estudio demuestra que la alpaca es susceptible a la infección por C pseudotuberculosis, desarrollando un cuadro patológico caracterizado por temperatura febril, leucocitocis, variaciones en los valores de hematocrito y hemoglobina, además de la formación de abscesos en el punto de inoculación y en el nódulo linfatico renal principalmente, cuya lesión histológica se caracterizaba por la formación de granulomas y/o una linfadenitis supurativa crónica. Palabras clave: Alpaca, Corynebacterium pseudotuberculosis, abscesos.
Introdución El Corynebacterium pseudoluberculosis, bacilo cocoide Gram positivo, es el agente etiológico de la denominada linfadenitis cascosa de los ovinos y caprinos. La enfermedad, caracterizada por la formación de abscesos en linfonódulos y otros órganos, tiene amplia distribución mundial y ocasiona graves pérdidas económicas debido a la contaminación de las carcasas y el decomiso de éstas u órganos afectados (Batey, 1986). En ovinos, el microorganismo ingresa principalmente por heridas de esqu¡la (Ayers, 1977), y ocasionalmente se infecta la piel esquilada no lesionada (Nairn et al., 1974). En alpacas las heridas de esquila generalmente se asocian con presentaciones de abscesos purulentos en linfonódulos y otros órganos. De estos abscesos se aisló principalmente C pseudotubercidosis, así como Streptococcus zoopidemicus, Actinomyces Pyogenes y Staphylococcus aureus, (Villena, 1985). Recientes estudios evidenciaron que las alpacas y llamas frecuentemente presentan abscesos internos producto de infecciones mayormente por C. pseudotuberculosis. (Braga,1993) Sin embargo, las cepas aisladas no han sido inoculadas experimentalmente. Tampoco se ha estudiado el cuadro clínico, el tipo de lesión histopatológica que produce, M si existen diferencias patogénicas entre C. pseudotuberculosis aislados de alpacas y llamas. Actualmente no existen mayores estudios de C. Pseudotuberculosi y efectuados en alpacas. El presente trabajo tuvo como objetivo reproducir experimentalmente la infección causada por C. pseudotuberculosis en alpacas; evaluándose las alteraciones clínicas y las lesiones anátomohistopatológicas producidas. Adicionalmente se evaluó si existen diferencias patogénicas entre dos cepas de C. pseudotuberculosis aisladas de alpaca y llama.
Material y Métodos
Alpacas Se utilizaron trece alpacas machos, de la raza Huacaya de aproximadamente 2 años de edad, color blanco, provenientes de zonas sin antecedentes de linfadenitis caseosa de la SAIS Túpac Amaru Ltda. Las trece alpacas fueron mantenidas en potreros de pastoreo compuestos por ryegrass y trébol en la sede de IVITA Huancayo.
Medios de cultivo e identificación El Medio de Cary y Blair (Difco) fue utilizado como transporte, el de agar infusión cerebro-corazón (Difco) con 5% de sangre desfibrinada estéril de ovino y 0,05% de Tween 80 (Sigma), como medio de enriquecimiento, y el agar Miger (Difco) como medio de conservación. Las colonias se identificaron bioquímicamente mediante el sistema API (API CORYNE -Biomerieux).
Inóculos Los inóculos fueron las cepas 7P y 23GM de C. pseudotuberculosis aisladas de abscesos pulmonares de una alpaca y de la glándula mamaria de una llama, respectivamente (Braga, 1993), suspendidas en una solución tampón de fosfato salino (PBS pH 7,2). Las densidades bacterianas fueron calculadas según la escala N.° 7 de Mc Farland (2,1 x 106-1 ml), y confirmadas mediante el recuento a las 48 horas de la siembra de 0,5 ml de inóculo en medio enriquecido
Inoculación experimental Los trece animales fueron distribuidos en los grupos A, B y C. Los grupos A y B fueron inoculados con 1,1 x 106 UFC de C pseudotuberculosis, cepas 23GM y 7P, respectivamente, el grupo C (control), recibió sólo PBS pH 7,2 (Cuadro 1). Los inóculos se aplicaron vía intradermal mediante jeringas estériles de 3 ml de capacidad y con agujas N.° 23 x 1 pulgada.
Análisis clínicos Los animales fueron pesados a los días 35 y 21 preinfección, y los días 16, 30, 58 y 128 días postinfección. Se tomó la temperatura rectal los primeros 7 días y luego el día 16, postinfección. Las muestras de sangre fueron obtenidas 35 y 21 días preinoculación experimental y durante los primeros 7 días y el día 16 postinfección, según técnicas convencionales (Benjamín, 1984).
Análisis histopatológico Las muestras de tejidos obtenidas durante la inspección de las alpacas sacrificadas, fueron fijadas en formol al 20%, y procesadas según técnicas convencionales de Hematoxilina y Eosina y la coloración de Steiner (Freller et al., 1992).
Análisis estadístico La significancia de la prueba de las variables para los datos de temperatura rectal en los grupos A, B y C, fue establecida empleando el análisis de varianza.
Resultados Análisis Clínicos Temperatura rectal La temperatura rectal promedio se elevó hasta 39,40°C el segundo día (P<.05) en las alpacas infectadas de los grupos A y B, permaneciendo invariable, en 38,81°C en las alpacas del grupo C (Fig. 1). Aunque la temperatura rectal en las alpacas infectadas disminuyó hasta 38.0"C al tercer día de la infección experimental, continuó siendo mayor que la del grupo control (37,3 °C), con una significativa diferencia (P < .01).
Hematocrito En la figura 2, se observa que el porcentaje promedio de hematocrito se incrementa hasta 40% en las alpacas de los grupos A y B el tercer día postinfección, respecto al 32% del grupo C.
Hemoglobina Los valores de hemoglobina promedio del grupo A disminuyeron de 14,6, obtenido preinfección, hasta 12,5 g dl-1 durante los dos primeros días de la infección experimental. En el grupo B, se observó una disminución de 14,5 a 12,8 g dl-1 en el primer día PI, en las alpacas del grupo 2. En las alpacas del grupo 3 utilizadas como control el valor promedio de hemoglobina permaneció entre 12 y 13,3 g dl-1, durante los días pre y postinfección (Fig. 3).
Recuento de leucocitos. En la figura 4 se aprecia que el número de leucocitos es similar para los tres grupos antes de la infección experimental. Sin embargo, al tercer día postinfección el número de leucocitos de los grupos A y B disminuyen hasta 21 y 23 x 103 respectivamente, para luego incrementarse. Dicho incremento en ambos grupos se debió fundamentalmente, al aumento del porcentaje de neutrófilos en un 25% aproximadamente, con relación al período preinfección (Fig. 5). En cambio, los valores hematológicos obtenidos preinfección en las alpacas de los grupos 1, 2 y 3, y durante el experimento, en las alpacas del grupo C, fueron similares a los valores referenciales (Copaira, 1953). Los valores promedio del grupo C permanecieron casi estables entre 14 y 17 x 101 leucocitos /~tl durante todo el expenmento.
Análisis Bacteriológico Cpseudottiberculosis fueron aislados de los abscesos formados en el punto de inoculación. A la necropsia, se aislaron bacterias en abscesos de los nódulos linfáticos renales, en todos los animales infectados, excepto la alpaca E327 sacrificada a los 128 días postinfección (Cuadro 2). Las colonias de C. pseudotuberculosis desarrollaron de 48 a 72 horas en agar sangre enriquecido.
*Evaluación tisular de bacilos: -ausencias, +presencia.
Alteraciones Anátomo patológicas Examen ante mortem del punto de inoculación La inoculación intradennal de los aislados 23GM y 7P en los animales de los grupos A y B, respectivamente, produjeron cambios inflamatorios en el punto de inoculación y posteriormente acumulación de material purulento de color blanco amarillento, y necrosis de la piel. Finalmente la piel necrosadacedió y aparecieron fístulas entre el quinto y sexto día en las alpacas del grupo A, y entre el sexto y octavo día en las alpacas del grupo B. Los abscesos llegaron a tener de 10 a 15 cm de diámetro, de piel amarillenta y escasa en fibras, y una elevación de 3 a 5 cm respecto a la piel circundante no afectada, pero cicatrizaron rápidarnente una vez que drenaron. En las alpacas del grupo C (control), no se observaron alteraciones.
Examen post mortem Solamente la alpaca SA38 del grupo A, sacrificada a los 16 días post-infección, mostró en el punto de inoculación un absceso fistulado de 3 a 5 cm de extensión. El área de piel comprometida estaba necrosada y con escasa fibra de color amarillenta. Al diseccionar la piel se observó el absceso de paredes delgadas, conteniendo escaso material purulento y adherencias al punto de contacto con la pared abdominal, la cual presentaba una zona cicatrizada de color blanquecino. En la alpaca E295 del grupo B, sacrificada también a los 16 días postinfección, sólo se apreció la cicatriz en la pared abdominal. En los demás animales, sacrificados a los 58, 93 y 128 días post-infección, no se distinguieron lesiones aparentes en el punto de inoculación, y tampoco en aquellos del grupo C (Cuadro 3).
* Entre paréntesis números de abscesos observados. + Edema, aumento de volumen y/o presencias de hemorragias, exudado purulento escaso ++Presencias de micro-abscesos múltiple 1 a 5 mm +++ Prresencias de abscesos único o múltiples de 3 a 5 cm
Internamente, en las alpacas de los grupos A y B se apreciaron abscesos únicos o múltiples de variado tamaño, localizados principalmente en nódulos linfáticos renales, desde los 58 días postinfección (Cuadro 3). Los abscesos más grandes medían de 4 a 8 cm, únicos, firmes al tacto, y al corte presentaban una gruesa cápsula de tejido fibroso, conteniendo un material purulento espeso de color blanco amarillento (Fig. 6). Los abscesos múltiples midieron de 2 a 3 cm y al corte presentaban un material purulento más escaso y no toda la corteza del nódulo estaba afectada. Se observaron también microabscesos de 1 a 5 mm, localizados principalmente en la corteza de un nódulo linfático renal de una alpaca del grupo A (Fig. 7).
Lesiones histopatológicas A partir de los 58 días postinfección se observó una severa linfadenitis granulomatosa, a manera de micro granulomas incipientes o en plena formación, confinados a la corteza del nódulo linfático y conformados por células mononucleares, como macrófagos y células epitelioldes dispuestos en el seno subcapsular y las zonas paracorticales. Se observaron bacterias en el citoplasma de algunos macrófagos y alrededor de las zonas inflamatorias en los espacios paracorticales y medulares (Fig. 8). Estas lesiones progresan y se observaron mejor organizadas en secciones de tejidos de los animales sacrificados a los 93 y 128 días; los macrófagos y células epitelioldes alternan en forma de capas con una infiltración moderada de tejido conectivo alrededor de áreas centrales de necrosis caseosa, con un precipitado basófilo y pétreo de calcio distrófico (Fig. 9). Tras la confluencia de estas zonas, los folículos linfoides se mostraban atrofiados con una sustancia hialina reemplazándolos, con cese de actividad y linfocitolisis, y rodeados de macrófagos de amplio citoplasma globoso. Alrededor del material necrótico se observaron polimorfonucleares neutrófilos en regular proporción, muchos de ellos lisados. En este caso la lesión granulomatosa ocupaba un espacio similar o mayor al de un folículo linfoide.
La linfadenitis supurativa crónica fue considerada consistentemente severa, y se observó desde los 58 días postinoculación. Microscópicamente se distinguieron diversos tipos celulares, los cuales formaban capas alrededor de un área de necrosis liquefactiva muy amplia. La zona de necrosis estaba conformada por restos celulares y abundantes PMNs en proceso de desintegración con sus núcleos picnóticos, y alrededor PMNs aún activos. Más externamente se observaban capas de células mononucleares conformadas principalmente por macrófagos, linfocitos y células plasmáticas, infiltradas por tejido conectivo que conformaba una densa capa (Fig. 10).
Discusión La inoculación intradennal de 1,1 x 106 UFC/0,5 ml de C. pseudotuberculosis de los aislados 7P (grupo A), y 23 GM (grupo B), en alpacas adultas, produjo alteraciones clínicas y anátomo-patológico. El C. pseudotuberculosis fue aislado de los abscesos formados en linfonódulos, principalmente el renal, corroborando su participación primaria en el desarrollo de las lesiones. No se hallaron diferencias significativas entre los grupos de alpacas infectadas con diferente cepa. En las alpacas inoculadas con C. pseudotuberculosis la temperatura rectal disminuyó, luego que el exudado purulento acumulado en el punto de inoculación drenó al exterior a partir del sexto día. Esto pudo ser debido al efecto del drenaje de dicho exudado con alto contenido de bacterias, por lo que la toxina bacteriana presente como factor piogénico y pirogeno, a su vez disminuye (Hsu et al., 1985). El drenaje de pus del sitio primario de infección hacia el exterior, ha logrado detener el progreso de la enfermedad en algunos casos, según se ha descrito en alpacas (Moro, 1965). Las alteraciones clínicas observadas en animales infectados con C. pseudotuberculosis están relacionadas a la naturaleza del agente y su capacidad de producir fosfolipasa-D (PLD), una exotoxina, que facilita la invasión bacteriana incrementando la permeabilidad vascular (Zaki, 1965; Jolly, 1965). Este efecto toxigénico ha sido estudiado en corderos gnotobióticos, en donde la inoculación vía subcutánea de 1,2 x 101 UFC de C. Pseudotuberculosis indujo la muerte en 48 horas, con hemoglobina incrementada las últimas 24 horas y una anemia hemolítica severa observada a la necropsia (Hsu et al., 1985). Histológicamente, se ha descrito una mayor vascularización y edema en el punto de ¡noculación, pocas horas después de la infección experimental en corderos y cabras (Pépin et al., 1988). En el presente caso la necrosis de la piel observada en el punto de aplicación del inóculo, puede ser un indicador de la naturaleza tóxica de esta bacteria. El volumen del inóculo, 1,1 x 106 UFC de bacterias viables, la vía intradermal utilizada y el punto de aplicación, representan modificaciones de un modelo experimental descrito en cabras (Brown et al., 1985). Bajo condiciones normales, la dosis del inóculo debe influir en el resultado de la infección, tal como se ha observado en casos de infecciones experimentales, en donde a mayor número de microorganismos se presentaron lesiones más severas, y éstas se localizaron en mayor número de órganos (Brogden et al., 1984; Brown et al., 1985). En el presente caso, los resultados de la infección experimental de C. pseudotuberculosis en alpacas concuerdan con los hallazgos de necropsias efectuadas en el campo (Braga, 1993), en donde la presentación de abscesos era más frecuente en nódulos linfáticos internos, especialmente el nódulo renal. Sin embargo, otros autores describen la presentación de abscesos más frecuentemente en tejido subcutáneo de crías de alpacas, y atribuyen este hecho a la mala desinfección del cordón umbilical (Villena, 1985). Al parecer, el tipo de lesión y el órgano o tejido involucrado en la infección natural de C. pseudotuberculosis en alpacas, dependería de la edad y del estado inmunológico del animal, muy relacionado a su vez al estado nutricional. Al respecto, el hallazgo de alpacas muertas en estado caquéctico con grandes abscesos en el abdomen de hasta 25 cm de diámetro, especialmente en época seca (Moro, 1965; Braga, 1993), confirmarían esta hipótesis. Sin embargo, en ovinos, la caquexia se ha observado también en infecciones por C. pseudotuberculosis, una bacteria capaz de inducir la secreción del factor de necrosis tumoral alfa (Ellis et al., 1991). Se puede afirmar que el nódulo Enfático renal es aquél que drena el punto de aplicación del inóculo en el flanco abdominal y áreas adyacentes, según los resultados del presente estudio en donde fue el nódulo más afectado. Por otro lado, no se observaron lesiones en los pulmones ni en los nódulos linfáticos superficiales, como sucede en ovinos y caprinos (Ayers, 1977; Ellis et al., 1987), lo cual establece una mayor diferencia anátomopatológica en relación con esas especies. Al parecer, el sistema linfático es una importante vía de diseminación del C. pseudotuberculosis en alpacas. La leucopenia transitoria observada al tercer día de la infección experimental ha sido atribuida según varios autores, a la migración masiva de PNINs circulantes, hacia las lesiones primarias producidas por dicha bacteria durante las primeras etapas de la infección (Ayers, 1977; Pépin et al., 1991). A pesar de esta rápida respuesta tras la infección con C. pseudotuberculosis), se conoce que la contribución de los PNINs a la protección contra las bacterias con localización intracelular es mínima, comparada a la contribución de los macrófagos (Carter et al., 1974). La localización intracelular de C. pseudotuberculosis en macrófagos localizados en nódulo linfático renal (Fig. 8), implicaría a dicha célula en la patogenia de la enfermedad en alpacas. A pesar que el desarrollo de plogranulomas está asociado con una limitada diseminación bacteriana (Pépin et al., 1991), se ha observado que estos permiten la persistencia del agente, sobre todo dentro de macrófagos no activados, en los cuales lleva a cabo sus efectos tóxicos, sobrevive y se multiplica (Kende, 1982; Hard, 1975). Esta persistencia crea un estímulo antigénico constante y ocasiona que el absceso progrese en algunos casos, hasta un tamaño muy grande como los abscesos hallados en alpacas. Por otro lado, en la imagen histológica se observaron múltiples granulomas en formación y que en algunos casos, la reacción inflamatoria rodeaba un área central de necrosis de tipo cascoso, aunque no en todos los casos y sólo se observó en lesiones focalizadas e iniciales. La necrosis caseosa es característica de la enfermedad en ovinos principalmente, y se ha observado en infecciones experimentales o naturales (Ayers, 1977; Nairn et al., 1974). En alpacas bajo condiciones naturales, aún no se ha podido demostrar esta lesión (Villena, 1985; Braga, 1993), predominando la linfadenitis supurativa crónica. Finalmente, al no existir diferencias significativas en cuanto al tipo de cepas utilizadas en el presente trabajo, se sugiere un estudio comparativo con las cepas originarias de ovino, a fin de establecer el origen del C. pseudotuberculosis involucrado en la presentación de abscesos en alpacas. Se ha demostrado la susceptibilidad de la alpaca a la infección de C. pseudotuberculosis. Las lesiones anátomo-patológicas se caracterizaron por la formación de abscesos en el punto de inoculación y aquellos internos de variado tamaño localizados sobre todo en el nódulo linfático renal. Histopatológicamente, la lesión inicial correspondió a una linfadenitis granulomatosa, mientras que en lesiones más amplias y maduras se observó una linfadenitis supurativa crónica. El autor desea expresar su reconocimiento a los profesores A. Hun- y A. Chayera por su asesoría, y al Dr. M. Gamarra, ex gerente de la SAIS Túpac Amaru por su colaboración desinteresada.
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