DETECCIÓN DE COPROANTÍGENOS DE FASCIOLA HEPÁTICA EN OVINOS Y BOVINOS MEDIANTE UN MÉTODO DE ELISA
ABSTRACT The diagnosis of Fascioliosis in sheep and cows by coproscopic analysis and capture ELISA in fecal samples from 85 sheep and 45 cows slaughtered in Cajamarca city, Perú were accomplished, The results of both tests were confirmed by the parasite finding at necropsy. The prevalence of Fasciola hepática by coprologic analysis in sheep and cows were 69.4 and 71.1%, and sensibility of 75.6 and 71.7%, while for capture ELISA test, the prevalence results were: 90.5 and 95.5%, and sensibility of 98.7 and 97.7%. The especificity for diagnosis of Fascioliosis in both tests were 100% in sheep and cows. The L. Page analysis indicate that finding antigen of Fasciola hepática is more efficient than eggs finding in fecal samples. Key words: Fasciola hepática, ELISA, sheep, cows.
RESUMEN El diagnóstico de Fascioliosis ovina y bovina fue realizado mediante el análisis coproscopico e inmutioenzimático de ELISA de captura en muestras de heces de 85 ovinos y 45 bovinos beneficiados en un matadero de la ciudad,le Cajamarca, Perú. Los resultados de ambas pruebas fueron confirmados con el hallazgo del parásito a la necropsia. Mediante el análisis coproscopico en muestras de ambas especies se obtuvo una prevalencia de la Fasciola hepática del 69.4 y 71.1% y una sensibilidad de 75.6y 7117%, así como tina concordancia de 0.29 y 0.57. Con ELISA de captura se obtuvo una prevalencia de 90 5 y 95,5 %, una sensibilidad del 98.7 y 97.7% y una concordancia de 0.69 y 0.93. La especificilad de ambas pruebas fue del 100% para el diagnóstico de fasciolosis en ovinos y bovinos. El análisis de tendencia de L de Page ha demostrado que el hallazgo de antígenos es más eficaz que el hallazgo de huevos del parásito en heces. Palabras claves: Fasciola hepática, ELISA, ovinos, bovinos.
INTRODUCCIÓN La fascioliosis, es una enfermedad parasitaria que afecta a los animales domésticos y silvestres, incluyendo al hombre. La importancia de esta parasitosis está ligada al aspecto económico, pues en el Perú se pierde aproximadamente 10.5 millones de dólares anuales. Cajamarca, importante cuenca lechera, es considerada como zona enzoótica de la faciolosis. Estudios realizados indican que las especies más afectadas son los bovinos y ovinos1-3 con 75.5 y 59.5% de prevalencia, al análisis coproscópico y 95.6 y 91.4% al examen postmorten. El análisis coproscópico, con la técnica de concentración y cuantificación de Dennis modificado, se basa en el hallazgo de huevos en heces. Esta técnica tiene el inconveniente de diagnosticar la presencia del parásito en el hospedero después de 8 a 12 semanas postinfección, tiempo que tarda la Fasciola hepática para convertirse en adulta y eliminar huevos4-6. Las desventajas del método coproscópico motivo a realizar estudios comparativos utilizando la prueba de ELISA, bajo la forma de Kit Diagnóstico (FASCIDIG). Esta prueba detecta coproantígenos de excreción/secreción (AES) usando un anticuerpo monoclonal ES-78 (sub clase IgG 2a), que reconoce un epitope de los antígenos AES del parásito. FASCIDIG time sensibilidad y especificidad muy superior a cualquiera de los métodos directos; e indirectos utilizados para el diagnóstico de fasciolosis7-9. Dada la importancia de la fascioliosis en Cajamarca se planteó el uso de ELISA de captura para el diagnóstico de esta parasitosis en ovinos y bovinos.
MATERIALES Y MÉTODOS Material de estudio. Se tomaron muestras en 4 5 bovinos y 85 ovinos de diferentes edades, en forma aleatoria de una población promedio de 100 bovinos y 240 ovinos que representar, el promedio de animales beneficiados semanalmente en el Camal Municipal de Cajamarca. Las especies en estudio provinieron de la zona rural de Cajamarca, sin haber sido sometidos a ningún tratamiento fasciolicida.
Diagnóstico de laboratorio. El análisis coproscopico se realizó utilizando la técnica de concentración y cuantificación de Dennis modificado. El método ininunoenzimático (ELISA de captura) se realizó utilizando el Kit diagnóstico FASCIDIG. Para esto se tomó 1 g de heces, se homogenizó en 2 ml de agua destilada, se centrifugó durante 30 segundos a 1,500 rpm, del sobrenadante se tomo 100 m l y fue colocado en los pozos de las tiras del Kit, además se colocó en un pozo el control positivo y en otro el negativo, luego se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente en cámara húmeda. Posteriormente se retiraron las muestras para ser lavadas por 6 veces con solución Buffer y secados en papel filtro, se añadió 100 m l de conjugado, se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente en cámara húmeda, se lavó 6 veces y se secó con papel filtro; se añadió 100 m l de sustrato y se incubó por 30 minutos en cámara húmeda y en oscuridad, finalmente se añadió 50 m l de ácido sulfúrico. Las tiras fueron leídas en microlector utilizando un filtro de 492 nm.
RESULTADOS Los resultados obtenidos después de realizar el diagnóstico de la fasciolosis se muestran en el Cuadro 1. En los Cuadros 2 y 3 se observan la eficacia de los análisis coproscópico e inmunoenzimático (ELISA de captura) según la edad, tanto en ovinos como en bovinos. El Cuadro 4 muestra la sensibilidad, especificidad e índice de concordancia de las pruebas diagnósticas en estudio para ambas especies.
DISCUSIÓN En el Cuadro 1 se aprecia que la prevalencia de Fasciola para ovinos y bovinos con ELISA de captura (90.5 y 95.5%) es mayor que la prevalencia al análisis coproscópico (69.4 y 71.1%).
En los Cuadros 2 y 3 se observa que la capacidad diagnóstica del ELISA de captura es mayor que el análisis coproscópico, en los diferentes rangos de edad, además que la prevalencia va disminuyendo conforme avanza la edad de las especies en estudio, debido posiblemente a que los animales van presentando inmunidad adquirida natural activa, por las continuas reinfecciones. La mayor sensibilidad obtenida por el ELISA de captura se debe a que se utilizó un anticuerpo policlonal de conejo anti - AES de Fasciola hepática conjugado con peroxidasa que reconoce antígenos de excreción secreción del parásito. Similares resultados fueron obtenidos en Cuba10 utilizando el mismo Kit de ELISA en muestras de bovinos. La especificidad de los métodos en las especies en estudio fue del 100%, porcentaje superior al encontrado por Castro8 en Cuba (99%), debido a que el ELISA de captura, en el presente trabajo, fue confirmado con la necropsia, En ELISA los antígenos son capturados mediante el uso de un anticuerpo monoclonal de excreción-secreción ES-78 de la subclase IgG 2a que esta fijado en los pozos de las tiras de microtitulación.
El índice de concordancia del análisis coproscópico y del ELISA de captura en ovinos fue de 0.29 y 0.69 y para bovinos de 0.57 y 0.93, quedando establecido que existe una relación directa con la eficacia de la prueba diagnóstica de ELISA7,8. La superioridad en la sensibilidad del ELISA de captura mostrada frente al examen coproscópico ha sido confirmada con el análisis de tendencia de L de page (L>Lc = 54.5 > 54).
CONCLUSIONES Existen diferencias entre la sensibilidad del ELISA de captura y el análisis coproscópico de 98.7 y 75.6% en ovinos y de 97.7 y 71.7% en bovinos, respectivamente, indicando que ELISA de captura tiene mayor sensibilidad para la detección de Fasciola en ovinos y bovinos (98.7 y 97.2%) que el análisis coproscópico (75.6 y 71.7%). La especificidad del ELISA de captara y del análisis coproscópico fue del 100% en ambas especies. La concordancia del ELISA de captara con la necropsia (0. 69) es sustancial en ovinos y casi perfecta en bovinos (0.93). El diagnóstico determinado por ELISA de captura tanto en ovinos (90.5%) como en bovinos (95.5%) es mayor que lo encontrado por el análisis coproscópico en ovinos (69.4%) y bovinos (71.1%), respectivamente.
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