ASOCIACION DEL VIRUS DEL COLERA PORCINO CON MORTALIDAD NEONATAL EN CRIANZA PORCINA NO TECNIFICADAª Mario Ríos Bb, Hermelinda Rivera Gc, Nieves Sandoval Chc, Alberto Manchego Sc, Carlos Camacho Sb y Raúl Rosadio Ac.
ABSTRACT Hog cholera is a viral disease responsable for large economic losses in the Peruvian pig industry. The virus can run from high te moderate and low virulence in pathogenecity and is associated with acute, chronic and subclinical outcomes. Acute outbreaks are generally associated with virulent strains and are more frequently observed on small farms throughout the highlands and jungle, as well as in illicit production operations around big cities. Subclinical forms caused by low virulent strains are usually seen in well managed comercial farms along the coast. In order to examine the association between neonatal mortality and HCV in illicit operations, 40 piglets aged I to 45 days from 15 small herds at Parque Porcino de Ventanilla located at 20 Km at north of Lima were studied for the presence of HCV antigen. Causes of death were reported to be diarrhea (n=10), pneumonia (n=7) and undeterminated (n=23), but none, showed acute HC signs. The piglets were necropsied and samples taken with special attention paid to lymphoid tissue including the thymus. HCV antigen was detected by immunofluorescence test using a polyclonal anti-HCV FIT conjugated on frozen cut sections. HCV antigen was detected in 72.5% of the piglets. It was present in most tissues and especially in tonsils (89.6%), spleen (76%), Kidney (48%) and retrofaringeal lymph nodes (27.5%). Severe thymic atrophy was found in 82.5% of the piglets showing evidence of lymphotropism. The presence of HCV antigen in neonatal pig tissues indicates that HCV is highly prevalent in animals from illicit herds. Although none of the pights studied showed signs of HC, HCV antigen was found in 80, 71.4 and 69.5% of piglets reported to have died from enteric, respiratory and undetermined causes respectively, suggesting a possible association between HCV and neonatal piglet mortality. Key words: Hog cholera, virus, antigen, piglets.
RESUMEN El Cólera porcino (CP) es una enfermedad de etiología vital prevalente y de gran significancia para el desarrollo de la industria porcina nacional. El virus del cólera porcino (VCP) presenta diversos grados de virulencia asociados con diferentes manifestaciones clínicas. Las infecciones subclínicas son frequentes en los porcinos de gran as tecnificadas y no tecnificadas. Estudios previos han demostrado la existencia de cepas de baja virulencia en granjas tecnificadas, mientras que cepas virulentas son mas prevalentes en porcinos de crianza no tecnificada como las de la sierra, selva peruana y los animales ubicados en los alrededores de ciudades como Lima. Uno de los problemas mas frequentes observados en los animales ce crianza informal es la elevada mortalidad de lechones. Con el objetivo de determinar la responsabilidad del virus del cólera porcino en la mortalidad de lechones de este tipo de crianza porcina, se seleccionaron al azar 15 criadores en el Parque Porcino de Ventanilla (PPV) de los cuales, se obtuvieron 40 lechones de 1 a 45 días de edad muertos por problemas diarreícos (n=10), neumónicos (n=7) y causas diversas como aplastamiento, etc. (n=23). De cada uno de estos lechones se obtuvieron tejidos en especial del sistema linforetícular para la detección de antígeno viral mediante la técnica de inmunoflurescencia directa. El 72.5% de los lechones estudiados presentaron antígeno viral principalmente en tejidos del sistema inmune, Además, el 82.6% de lechones evidenciaron severa atrofia tímíca. Estos resultados evidencian una alta prevalencia del virus del cólera porcino en animales de este tipo de crianza y la ocurrencia de infecciones subclínicas características de cepas de baja virulencia y con fuerte tropismo por el tejido linfoide. La presencia de antígeno viral en tejidos de animales muertos por problemas entéricos (80%), neumónicos (71.4%) y otras causas (69.5%) indica la asociación del VCP con la mortalidad neonatal en animales del PPV. Palabras claves: Cólera porcino, virus, antígeno, lechones.
INTRODUCCIÓN La población porcina del Perú es aproximadamente de 2.2 millones de animales, el 46.8% de esta población se encuentra en la costa en manos de criadores que utilizan mediana y alta tecnología, el resto pertenece a pequeños ganaderos de la sierra y selva que utilizan escasa o pobre tecnología y a aquellos criadores informales ubicados en los alrededores de las grandes ciudades como Lima1. La falta o escasa tecnología utilizada y la no disponibilidad de programas de control sanitario a nivel nacional de enfermedades como el cólera porcino constituyen factores que limitan el desarrollo de este importante sector de la ganadería en manos de pequeños ganaderos. El Cólera Porcino (CP) es una enfermedad de distribución mundial y de gran significancia económica. La enfermedad afecta a porcinos de todas las razas y edades, manifestándose en diversas formas clínicas, dependiendo principalmente del grado de virulencia del agente causal2. La mortalidad puede variar de 0 a 100% como suele ocurrir con los animales de los pequeños ganaderos de la sierra y selva peruana. La enfermedad es causada por el virus del cólera porcino (VCP), que conjuntamente con los virus de la Diarrea Viral Bovina (DVB) y Enfermedad de la Frontera (EF) pertenecen al género Pestivirus, de la familia Flaviviridae3. Estos 3 agentes virales están molecular y antigénicamente relacionados y son capaces de inducir infecciones interespecies, complicando la epidemiología, diagnóstico y control de estas enfermedades4. El VCP se replica en diversos tipos de células epiteliales y células linfoides del sistema inmune. Esta característica hace del virus un agente inmunodepresor, predisponiendo al animal a infecciones secundarias y oportunistas que muchas veces es de carácter fatal5. Estudios moleculares del virus DVB esta permitiendo una mejor comprensión de la biología de los pestivirus en general, así como el desarrollo de reactivos y técnicas de gran utilidad para la investigación y diagnóstico de estas enfermedades6,7. El virus DVB posee 2 biotipos: citopatogénico y no citopatogénico, la diferencia entre ambos biotipos radica a nivel molecular, el citopatogénico posee dos proteínas (p125 y 80), mientras que el no citopatogénico solamente la p125. El surgimiento de las cepas citopatogénicas se debe a procesos de recombinación entre secuencias de nucleótidos de origen celular y viral7,8,9. Las cepas de campo del VCP son usualmente no citopatogénicas, esta característica le confiere al VCP y los otros pestivirus la capacidad de inducir infecciones persistentes a través de trasmisiones prenatales. La existencia de cepas de diversos grados de virulencia son ampliamente conocidos. Porcinos susceptibles infectados postnatalmente con cepas virulentas, muestran signos clínicos de CP agudo descritos y conocidos por los veterinarios y ganaderos. Si un animal susceptible es infectado en la etapa postnatal con cepas de baja virulencia desarrolla el CP subclínico. El animal con infección subclínica no muestra signos clínicos de CP agudo, pero el virus replica principalmente en el tejido linfoide ocasionando inmunodepresión y predisponiendo sobre todo al animal joven, a infecciones secundarias especialmente del tracto digestivo y respiratorio. Una marrana preñada infectada con cepas de baja virulencia, presenta un conjunto de fetopatías dependiendo del período de la gestación al momento de la infección. Une de las consecuencias relevantes es el nacimiento de lechones inmunotolerantes al VCF e infectados persistentemente. Esta condición es muy similar a lo observado en las infecciones por pestivirus bovino y ovino5,10-13. Estos lechones inmunotolerantes son los reservorios y principales diseminadores del virus. En las granjas tecnificadas el control del CP es realizan por inmunización, pero a pesar de varias décadas de esfuerzos la enfermedad no ha sido controlada. El escaso conocimiento de la biología viral, epidemiología de la enfermedad as¡ como la proliferación de la crianza porcina informal en los alrededores de las grandes ciudades, y la no disponibilidad en el país de técnicas serológicas de monitoreo como ELISA, etc., son algunos de los factores que contribuyen al reducido progreso en el control de esta enfermedad. Los animales de los parques porcinos son criados bajo pobre o ninguna protección sanitaria, constituyendo focos de enfermedades y diversos problemas sanitarios. La elevada mortalidad de los lechones observados en el Parque Porcino de Ventanilla (PPV), hizo suponer el compromiso de agentes virales como el VCP. Con la finalidad de tener una mejor comprensión de la epidemiología del CP en este tipo de crianza, se diseñó el presente trabajo para determinar la responsabilidad de este virus en la mortalidad neonatal desde el primer día de nacido hasta los 45 días de edad.
MATERIALES Y MÉTODOS Materiales. Animales. El estudio fue realizado en porcinos de 15 criadores escogidos al azar en el PPV, ubicado aproximadamente a 20 km. al norte de la ciudad de Lima. Se estudiaron 40 lechones de diferentes camadas que murieron desde pocas horas después de nacer hasta los 45 días de vida. Las muertes de todos los lechones no fueron atribuidos clínicamente al CP agudo pero estuvieron asociados a debilidad, aplastamiento, caquexia, problemas diarreicos y neumónicos. El tamaño muestral (n=40) fue obtenido en base al método de muestreo simple al azar, tomando como referencia el 45% de positividad al antígeno del VCP por inmunofluorescencia (IF), obtenidos en el Laboratorio de Virología de la Facultad de Medicina Veterinaria (FMV) de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (UNMSM) (Rivera H datos no publicados) con niveles de confianza del 99%.
Muestras de tejidos. En cada uno de los lechones en estudio se realizó la necropsia observándose las lesiones macroscópicas. De cada uno se colectaron asépticamente muestras de tonsilas, timo, bazo, gánglios retrofaríngeos, pulmón, riñón, íleon y cerebro. Las muestras fueron mantenida, y transportadas refrigeradas al laboratorio para el procesamiento y búsqueda de antígeno de CP por IF.
Encuesta socioeconómica Simultáneamente al muestreo, se realizó una encuesta con apoyo del Instituto para el Desarrollo Urbanismo y el Medio Ambiente (PROMOS-CRS) en 20 de un total de 500 criadores de porcinos para conocer aspectos relacionados al manejo sanitario.
Métodos. Detección de antígeno del VCP. El antígeno viral fue detectado en cortes congelados de los tejidos colectados empleando un criostato mediante la prueba de Inmunofluorescencia (IF) empleando un conjugado policlonal (NSVL-AMIES Iowa, USA) de acuerdo al protocolo del Laboratorio de Virología de la FMV de la UNMSM. Las láminas fueron observadas en un microscopio para IF con luz incidente. La muestra fue considerada positiva ante la observación de la fluorescencia en el citoplasma de las células epiteliales y/o células del sistema inmune infectadas. Los cortes de las tonsilas fueron realizadas transversalmente con la finalidad de diferenciar células epiteliales de las criptas tonsilares y /o células linfoides.
RESULTADOS Los resultados se presentan en los Cuadros 1,2,3, y 4. El 72,5 % de los lechones tuvieron antígeno viral, aún cuando estos lechones no mostraron signos clínicos de CP agudo antes de morir (Cuadro 1). El 75.8% de los lechones muertos entre el 1º al 7º día de nacido tuvieron antígeno viral, el 100% de los lechones muertos entre el 7º y 30 días de nacido y el 42.8 % de los que murieron entre 31 a 45 días. En el Cuadro 2, se muestra la presencia de antígeno viral en lechones con lesiones macroscópicas distintas al CP agudo. El mayor porcentaje de estos lechones mostraron lesiones que se caracterizaron por cuadros congestivos en tonsilas y esplenomegalia. Los signos clínicos observados en los lechones antes de morir se presentan en el Cuadro 3. Antígeno del VCP fue observado en el 80% de los lechones que presentaron diarrea, 71.4% de los que presentaron neumonía y en el 69.5% de los que murieron por causas diversas, corno aplastamiento, caquexia, etc. La frecuencia de presentación de antígeno viral fue mayor en las tonsilas (89.6%) seguida por el bazo, timo, riñón y cerebro (Cuadro 4). La presencia del antígeno fue mayormente en las células del folículo linfoide y células epiteliales de las criptas tonsilares, as¡ como en los folículos linfoiles del bazo y ganglios linfáticos (Fotomicrografia 1 y 2).
* Aplastamiento, debilidad, caquexia, etc.
* La mayoría de animales presentaron hipoplasia o aplasia de timo
DISCUSIÓN Cepas virulentas del VCP son prevalentes en animales de crianza no tecnificada de la sierra y selva peruana y criadores informales de los parques porcinos ocasionando muchas veces efectos devastadores para estos ganaderos, mientras que, cepas de bija virulencia son más frecuentemente observadas en porcinos de granjas tecnificadas (Rivera H, comunicación personal). Sin embargo, os resultados del presente estudio muestran que cepas del VCP de baja virulencia son también prevalentes en porcinos de crianza informal como los del PPV. El 72.5% de positividad, al VCP en los lechones muertos por causas diferentes al CP agudo (Cuadro 1), indica que estos animales estuvieron infectados subclínicamente y predispuestos a infecciones secundarias, como lo demuestran las diversas lesiones macroscópicas encontradas durante la necropsia (Cuadro 2). Un animal con CP subclínico está predispuesto a infecciones secundarias debido a que el virus se replica principalmente en el tejido del sistema inmune ocasionarlo inmunodepresión11. Las marranas infecta, las subclínicamente transmiten el virus a sus fetos y si la transmisión ocurre en estadíos tempranos de la gestación, es decir, durante los primeros 45 días, la posibilidad del establecimiento de la inmunotolerancia es mayor. Los animales inmunotolerantes y con infección persistente, mueren usualmente durante la primera semana o meses de vida. Esta condición podría estar ocurriendo en el PPV, pues el 75.5% de los criadores encuestados durante el muestreo, manifestaron que el promedio de nacimiento de las cama das es de 10- 12 lechones pero el 18 a 20% de los mismos mueren durante los primeros meses de vida por causas diversas. El efecto de los pestivirus bov¡no y porcino sobre el sistema inmune es conocido. La replicación en las células del sistema inmune conlleva a un profundo despoblamiento de células linfoides afectando el grado de la respuesta inmune del animal12,14. Antígeno del VCP detectado en el 89.6% de las tonsilas seguidas por bazo y timo podría indicar el tropismo de estas cepas por el tejido del sistema inmune de estos animales. El hallazgo de antígeno viral en lechones muertos por procesos diarreicos (80%), neumónicos (71.4%) y otras causas como aplastamiento, etc. (69.5%) podría asociar al VCP de baja virulencia con la elevada mortalidad neonatal en animales del PPV probablemente por su rol inmunodepresor y predisponente a infecciones secundarias (Cuadro 2 y 3). Estudios a nivel molecular del virus DVB, están mostrando una amplia variedad de cepas e incluso algunos con marcado tropismo por células del tracto digestivo y respiratorio5,15. Hallazgos similares referentes al CP no han sido reportados, aunque Riley16. menciona al VCP como uno de los principales agentes en el denominado complejo respiratorio en porcinos. Estos resultados aunque en menor grado, son similares a lo encontrado en lechones de 1 a 30 días de nacido procedentes de granjas tecnificadas (Rivera H, datos no publicados), en los cuales se detectó antígeno viral en 30% y 63% de los lechones muertos igualmente por procesos diarreicos y neumónicos. Probablemente infecciones pre y postnatales con cepas de baja virulencia son también frecuentes en explotaciones tecnificadas causando similares efectos a los observado en la crianza no tecnificada. La detección de antígeno viral en animales en los primeros meses de vida son al parecer características de persistencia viral. La presencia de antígeno de CP en lechones muertos durante el primer día de vida son sin lugar a dudas consecuencia de infecciones prenatales. Hipotéticamente estas mismas infecciones prenatales podrían ser responsables de las muertes de los lechones entre 7-30 días de edad (Cuadro 1). La viremia en estos animales es controlada por los anticuerpos calostrales que tienden a desaparecer catabólicamente 2 a 3 semanas después del nacimiento permitiendo reactivaciones de cepas persistentes de consecuencias fatales9 El lechón con infección persistente tiende a morir tempranamente víctima de infecciones oportunistas o desarrolla CP atípico, pero algunos suelen tener apariencia normal y llegan a la etapa reproductiva trasmitiendo el virus a sus crías y propiciando la sobrevivencia del virus. La presencia de cepas de baja virulencia en los animales estudiados es sustentada por el alto porcentaje (33/40) de lechones con ausencia o atrofia tímica, La afinidad tímica de ciertos virus con habilidad de persistencia no solo es característica del género pestivirus, otros agentes Virus inmunosupresores tales como el distemper canino y algunos lentivirus incluyendo el HIV, se replican en el timo y su actividad linfocitolítica es responsable del severo despoblamiento línfoide que explicaría la acelerada involución y/o destrucción tímica observada en estos tipos de infecciones virales17. Sorprendentemente, de los 29 lechones positivos, sólo en 2 se pudo identificar el timo y en uno de ellos se observó antígeno de CP (Cuadro 4). Van Oirschot10, demostró que durante la infección por CP se produce tina hiperplasia de la zona fascicular de la glándula adrenal resultando en una incrementada secreción d i~ la hormona glucocorticosteroide, la cual, al menos en parte, conlleva a la atrofia del timo, Probablemente el estrés debido a la falta de agua, comida etc. sea otro factor que indirectamente conduzca a la atrofia tímica como lo indica el mismo autor quien también manifiesta que las cepas de moderada y baja virulencia se ven favorecidas en animales con permanente estrés. En el presente trabajo no se evaluó las características histológicas de la glándula adrenal ni del timo, pero la alta prevalencia del antígeno del VCP y el estrés a que están sometidos los animales del PPV son al parecer argumentos que coinciden con lo afirmado por Van Oirschot10. La presencia de cepas de baja virulencia del VCP asociadas con cuadros atípicos de la enfermedad en estos tipos de explotaciones porcinas tiene importantes implicancias epidemiológicas. En una encuesta paralela realizada durante el estudio se determinó que el 80% de estos criadores sacrifican y venden sus animales informalmente. Esta modalidad de venta representa una fácil diseminación viral y un gran riesgo para la salud animal y para llevar a cabo el programa de control del CP.
CONCLUSIONES a. El 72.5 % de positividad al VCP encontrado en los lechones de 1 a 45 días de edad sin mostrar signos clínicos de CP agudo, indica que cepas de baja virulencia están muy difundidas en los animales de crianza no tecnificada causando infecciones de tipo subclínica. b. La presencia de antígeno viral en el 89,6% de las tonsílas seguidas por el bazo y timo indica el tropismo de estas cepas por células del sistema inmune. c. La detección del antígeno del VCP en el 80, 71.4 y 69.5% de los lechones muertos por procesos diarreicos, neumónicos y otras causas como aplastamiento, podría asociar al VCP con la elevada mortalidad de lechones de crianza informal del PPV.
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