Aída Cordero Rb; Felipe San Martín Hc, Luisa Echevarria Cc; Wilfredo Huanca Ld , Hugo Casas Pc, Julio SumarKc.
ABSTRACT The effects of blood temperature storage (TS) (enviroment and 4 ºC) and interval time between blood collection an centrifugation (ITCC) (0.0, 0.5, 1.0, 1.5, 3.0, 6.0,12.0, 24.0 y and 48.0 h) on the plasma progesterone concentration (PPC) in alpacas and llamas were studied. Technical of radioimmunoassav was used to determine PPC. Nine llamas and 8 alpacas were used in a factorial (2x9) randomized block design. In llamas, there was not TSeffect on the PPC (P<0.05). At the 48h post-colection and enviroment temperature the P11C decresed, with respect to 0.0 h, in 10.3% (P<0.05), whereas at 4 ºC the PPC increased in 3.3% (P<0.05). In alpacas, there was a significant difference in the TS an ITCC interaction (P<0.05). At the 48 h post-colection and at enviroment temperature the PPC decreased in 9.4%. It is concluded that the PPC responses in llamas and alpacas are due to blood biochemestry differences in both species. Key words: Progesterone, llama, alpaca, plasma, RIA, temperature, storage.
RESUMEN El presente trabajo fue realizado en el Valle del Mantaro a 3 200 m de altitud, con el propósito de evaluar el efecto de las variables temperatura de almacenamiento de la sangre (TALM) (medio ambiente y 4 ºC) e intervalo de tiempo transcurrido entre la colección de sangre y la centrifugación (TPC) (0.0, 0.5, 1.0, 1.5, 3.0, 6.0, 12.0, 24.0, 48.0 h); en el manipuleo de las muestras, las cuales puedan afectar la determinación de los niveles de progesterona en el plasma de alpacas y llamas. Se utilizó la técnica del RIA para la determinación de progesterona, utilizándose un diseño con arreglo factorial 2x9. En llamas, no se observó efecto (P<0.05) de la TALM sobre los niveles plasmáticos de progesterona. La pérdida porcentual de progesterona a temperatura ambiente a las 48 h postcolección, con respecto al tiempo 0.0 h, fue de 10.3% (P<0.05) mientras, que a 4 ºC hubo un incremento de 3.3% (P<0.05).En alpacas, se obtuvo diferencias en la interacción TALM y TPC (P<0.05). La pérdida porcentual de progesterona a temperatura ambiental 0.0 h, fue de 30.6% y a 4 ºC de 9.4%. Se concluye que la diferente respuesta en llamas y en alpacas se explica a posibles diferencias bioquímicas en la sangre de ambas especies. Palabras clave: Progesterona, llama, alpaca, plasma, RIA, temperatura, tiempo.
Los camélidos sudamericanos, especialmente la alpaca y la llama, son mamíferos de gran importancia en la región alto andina del Perú, tanto desde el punto de vista social como económico. Uno de los factores que afectan la productividad de los camélidos es el aspecto reproductivo, que viene siendo estudiado durante los últimos 30 años por el Centro de Investigación IVITA de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Una de las técnicas utilizadas últimamente es el Radioinmunoensayo, para la determinación de los niveles hormonales. Los trabajos experimentales se realizan en el campo, lugares normalmente alejados del laboratorio, carentes de equipos apropiados (refrigeradoras, centrífugas, balanzas de precisión, etc.) que permitan un óptimo manejo de las muestras. Esta limitante conlleva a la búsqueda de alternativas sencillas, prácticas y confiables para el manipuleo de las muestras, tendientes a facilitar el trabajo sin disminuir la confiabilidad de los resultados. En base a lo señalado se planteó evaluar el efecto de algunas de las variables, en el manipuleo de muestras, que puedan afectar la determinación de los niveles de progesterona en el plasma de alpacas y llamas. Se evaluó: el efecto de la temperatura de almacenamiento de la sangre y el efecto del intervalo de tiempo entre la colección de sangre v la centrifugación.
MATERIALES Y METODOS El estudio se llevó acabo en la Estación Experimental de IVITA Huancayo situada a 3 249 m de altitud, una temperatura máxima de 20.8 ºC, una mínima media de 6.3 ºC y una precipitación anual de 716 mm. El estudio fue realizado entre Octubre 91 y Mayo 92; se utilizaron 9 llamas y 8 alpacas adultas preñadas (entre 47 meses de preñez) con aceptable condición física. Los animales estuvieron sometidos a un esquema de pastoreo intensivo en pasturas cultivadas de Rye grass y trébol. Se colectó 80 ml de sangre por animal en frascos Erlenmeyer de 100 ml de capacidad, a los cuales se les había adicionado previamente EDTA. Los análisis de laboratorio se efectuaron en la Unidad de Radioinmuno Análisis de la Facultad de Medicina Veterinaria de la UNMSM. Los tratamientos fueron, 1) tiempo transcurrido entre la colección de la muestra de sangre y la centrifugación (TPC): 0.0, 0.5, 1.0, 1.5, 3.0, 6.0, 12.0, 24.0, 48.0 h, y 2) la temperatura de almacenamiento antes de la centrifugación (TALM):4 ºC y temperatura ambiental, siendo la temperatura media del mes de Diciembre de 13.4 ºC. El tiempo inicial de 0 horas correspondió al tiempo transcurrido entre el muestreo y la separación de la sangre en viales, el cual en ningún caso fue mayor de 30 minutos. Cada, muestra se subdividió en 17 viales (alícuotas), para cada uno de los animales; 8 alícuotas se almacenaron a temperatura ambiente, 8 alícuotas a 4 ºC y una alícuota se centrifugó en forma inmediata. Las alícuotas fueron centrifugadas a 3 500 rpm, por 10 minutos, de acuerdo a la secuencia de los tiempos arriba señalados. La alicuota para el tiempo cero a 4 ºC fue la misma que se obtuvo para el tiempo cero a temperatura ambiente. Luego, dicha muestras fueron almacenadas a -20 ºC hasta su análisis. La determinación del contenido de progesterona, fueron realizadas mediante la técnica de fase sólida de radioinmunoensavo (RIA), utilizando Kits del OlEA, Viena, Austria. El diseño experimental fue de bloques con arreglo factorial 2 x 9, con desigual número de repeticiones, utilizando 2 subunidades en cada unidad experimental. El análisis estadístico de los datos fue realizado, para cada especie, mediante el análisis de varianza (ANDEVA) v la prueba de rango aplicada fue la DMS (protegida) acorde a los procedimientos del GLM en el Análisis de Sistema Estadístico. Los niveles de progesterona encontrados en las muestras fueron expresados en nmol/L. Se estableció el porcentaje de disminución de los niveles de progesterona para cada uno de los tiempos, en relación a la concentración de progesterona obtenida en el tiempo cero, a fin de poder determinar la posible pérdida porcentual de progesterona.
RESULTADOS LLAMAS En la Fig. 1 se puede observar, las diferencias entre los promedios de los valores plasmáticos de progesterona bajo ambas temperaturas (P<0.05). Los valores de progesterona de las muestra mantenidas al medio ambiente tienden a incrementar ligeramente, al ser centrifugadas una hora post-colección de sangre (8.9 nmol /L), para luego declinar en forma continua pero muy leve hasta las 48 h post-colección (7.8 nmol/L). Esta declinación entre el inicio del muestreo Y los valores presentes a las 48 horas fue de 10.3% (0.9 x 100/8.7). En la sangre mantenida a 4 ºC, existe una leve elevación de los valores de progesterona a las 1.5 horas post-colección (9.1 nmol /L), para continuar una leve elevación y alcanzar su valor más alto a las 48 h (9.4 nmol/L), con incremento porcentual del 3.3% (0.3 x 100/9.1).
ALPACAS En la Fig. 1, los valores de progesterona plamática en alpacas, tiene diferencias (P<0.05). Al analizarse el efecto de la interacción TPC con cada una de las TALM (medio ambiente y 4 ºC) se encontró diferencia significativa (P<0.05) de la interacción TPC y temperatura medio ambiente, observándose que los tiempos pueden agruparse en tres períodos (0.0 – 0.5, 1.0 - 24.0 y 48.0 h) existiendo diferencias (P<0.05) entre éstos. Los niveles de progesterona son más altos durante el primer período disminuyendo en el segundo período, en donde se mantienen estable hasta las 24 horas, para luego sufrir otra disminución al pasar al tercer período (48 h). En las muestras de suero mantenidas al medio ambiente, existe en los niveles de progesterona una tendencia a disminuir en el tiempo, de (D50.05) 8.5 nmol/L a las 0.0 h a 5.9 nmol/L a las 48 h, estimándose una pérdida porcentual del 30.6% (2.6 x 100/83). Cuando las muestras se conservan a 4 ºC, las muestras centrifugadas a 1.5 h (7.3 nmol/L), pierden con respecto a la muestra inicial a las 0 h (8.5 nmol/L) 14.1% (1.2 x 100/85); incrementándose levemente a las 3 h (7.6 nmol/L). A las 6 h presenta valores similares al de 1.5 h, posteriormente exhiben un incremento gradual, llegando a alcanzar valores de 7.7 nmol / L a las 48 h, lo que representa una pérdida de 9.4% con respecto del valor de las 0 h (0.8 x 100/85).
DISCUSION El uso del RIA, para la determinación de los niveles hormonales en las diferentes especies domésticas, puede ser de gran utilidad para los profesionales del campo e investigadores, siempre y cuando se obtengan muestras de excelente calidad y sean sometidas a un buen manejo, antes de su análisis. Bajo las condiciones de crianza de los camélidos sudamericanos, se carece del apoyo y facilidades necesarias para garantizar una óptima obtención de las muestras, condiciones que pueden llevar a sesgar los resultados obtenidos y crear desventajas para los investigadores. Los resultados del presente trabajo muestran diferencias con los valores de progesterona hallados en otros trabajos. En flamas se ha determinado valores promedio entre 6.7 a 8.8 nmol/L (con un rango de 4.0-17.0), lo que difiere de los valores de 17.5 a 24.7 nmol/L.I Posiblemente explicable por las diferentes condiciones en que se obtuvieron las muestras y porque los animales utilizados en el presente trabajo tienen un mayor tiempo de gestación (4-7 meses vs 30 días). Similar tendencia se presenta con las muestras de alpacas, donde los valores encontrados se sitúan entre 6.47 a 7.62 nmol / L, con valores promedios notificados por el mismo' (13.3 a 16.3 nmol / L.). Existen reportes sobre la relación entre la formación de un coágulo sanguíneo y el proceso de degradación de la progesterona, debido a una menor exposición de la progesterona a las células sanguíneas.2 Así mismo3 reportan una menor concentración de progesterona en muestras inmediatamente hemolizadas con respecto a las muestras que no sufrieron hemólisis; atribuida a la acción enzimática debida al contacto de la progesterona con la pared celular de los glóbulos rojos. En las muestras de sangre de llamas mantenidas a temperatura ambiente existió una pérdida porcentual de los niveles plasmáticos de progesterona del 10.3% (P<0.05) al ser centrifugados a las 48 horas post -colección. Este porcentaje difiere de trabajos realizados con sangre bovina, donde se reportan pérdidas de hasta 30% en muestras almacenadas a temperaturas de 22 ºC por 12 a 48 horas;2 pérdidas del 25% de muestras centrifugadas a las 3.30 h post-colección, bajo temperatura ambiental de 25 ºC a la sombra4 y disminución en las concentraciones plasmáticas de progesterona desde 6.6 ng/ml a las 0 h a 1.7 ng/ml a las 6 h, en temperaturas de incubación de 40 ºC.2 Y disminución, en plasma porcino, del 26% en la concentración de progesterona, 24 h después de la colección y manteniendo a 4 ºC.2 Existe cierta similitud con el comportamiento de las muestras de sangre de cabras, que permanece sin cambios a las 24 h mantenidas a temperatura ambiente.6 En lo que respecta a las muestras mantenidas a 4 ºC, existe un ligero incremento (P<0.05) del 3.3%, con respecto a la muestra inicial de 0 h, lo que podría indicar una ligera tendencia a la recuperación de los niveles perdidos de progesterona en el plasma bajo condiciones de medio ambiente;1 pero difiere de valores encontrados por5, quienes reportan una disminución de los valores de progesterona plasmática de 6.6 ng/ml a las 0 horas a 4.2 ng/ml a las 24 horas. Al examinar el efecto de la TALM y los TPC, se halló que los niveles de progesterona a 4 ºC fueron superiores (P<0.05) a los del ambiente. Esto se explica porque al mantener la muestra en temperatura de refrigeración se disminuye el metabolismo de la progesterona, por retardo de la acción enzimática. Esta enzima posiblemente es la 20 a -hidroxy-esteroide dibydrogenasa, principal responsable de la conversión de la progesterona en 20 a -dihidroprogesterona en la sangre y eritrocitos de diversas especies animales.8 Los resultados obtenidos parecen indicar que los niveles de progesterona en las muestras de sangre de llamas no son rápidamente metabolizadas; y si bien existe una ligera pérdida del 10.3%, en las muestras mantenidas bajo ambiente, no modifica sustancialmente los valores de progesterona plasmática obtenidas. En el reporte6, se señala una recuperación de los niveles de progesterona a las 48 h postcolección, debido a un proceso de interconverción de la progesterona a partir de los metabolitos presentes.8 Los resultados obtenidos a temperatura ambiente y a 4 ºC parecen reafirmar la sugerencia de que la progesterona en las muestras de sangre de llamas no son rápidamente metabolizadas. El comportamiento de las muestras de sangre de llama, podría explicarse por las diferencias existentes con la sangre de las demás especies domésticas, posiblemente debido a una acción disminuida de catalizadores como el 20 a -dihidroxyesterio de deshidrogenasa, necesario para convertir la progesterona libre en metabolitos como el 20 a -dihidroprogesterona, metabolito no reconocido por el anticuerpo contra progesterona utilizado en la técnica RIA.7 Así mismo hay que considerar la importancia del nivel de glucosa disponible para favorecer la formación de los componentes reducidos (20 a -dihidroprogesterona). Se menciona que la incubación de progesterona con eritrocitos lavados de oveja, en presencia de glucosa, favorece la formación del metabolito 20 a -dihidroprogesteron.9 La diferencia en la sangre de llama con respecto a la de otras especies domésticas podría deberse a un bajo nivel de glucosa circulante ó a una inhibición en el uso de glucosa, lo que afectaría la metabolización de la progesterona. El uso de anticoagulantes a base de oxalato de potasio y floruro de sodio disminuye el efecto del tiempo de incubación y temperatura sobre el nivel de progesterona en sangre, debido al afecto del floruro sobre la glicólisis, inhibiendo la enolasa y con ello inhibiendo la capacidad de las células rojas para utilizar la glucosa disponible y generar Adenosin trifosfato.10 En lo referente a los resultados de las muestras de alpacas, se observa un comportamiento diferente al de las llamas, hallándose un efecto significativo (P<0.05) en la interacción TALM y TPC sobre los niveles de progesterona; especialmente en las muestras conservadas a 4 ºC y centrifugadas a las 0 y 0.5 horas post-colección (P<0.05) con respecto a los demás TPC. Esto puede explicarse por la metabolización de la progesterona, debido a la acción catalítica de las enzimas, acorde a los reportes.2,3,4 En síntesis, en base a los resultados obtenidos en el presente trabajo, se sugiere la existencia de diferencias entre el comportamiento de la sangre de llamas y de alpacas, por posibles diferencias bioquímicas entre ambos tipos de sangre. Aparentemente la sangre de llamas presenta deficiencias de enzimas encargadas de metabolizar la progesterona libre; ó bien un bajo nivel de glucosa circulante ó inhibición del uso de glucosa, necesaria para favorecer la metabolización de la progesterona en las muestras de sangre.
CONCLUSIONES Los resultados permiten concluir: 1) No se encontró diferencias significativas entre las pérdidas de progesterona en muestras de plasma de llamas en función a la temperatura de conservación de la muestra y tiempos de centrifugación post-colección; determinándose solo 12% de pérdida a las 48 horas a temperatura ambiental, y 2) La pérdida en la concentración de progesterona en muestras de sangre de alpacas sometidas al ambiente fue de 30.6% en condiciones de Huancayo (3 249 m de altitud).
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