Revista de Gastroenterología del Perú - Volumen 18, Nº2 1998

 

Método de la Cuerda Encapsulada (Enterotest) comparado con el examen de heces en el diagnóstico de Criptosporidium spp. e Isospora bellí en pacíentes VIH (+) con síntomas gastrointestinales

*Dr. Luis Fernando Venegas Tresierra, **Dr. Luis Cuéllar Ponce de León, ***Dr. Raúl Tello Casanova, ****Dr. Alberto Flores Granda, ****Ing. Wilfredo Mormontoy.

 

 

RESUMEN

Se colectó de pacientes VIH (+) con síntomas gastrointestinales muestras fecales y contenido intestinal obtenido por Enterotest en el periodo comprendido entre diciembre de 1994 a enero de 1996.

Se realizó una comparación multiatributiva entre muestras fecales (no concentradas y concentradas por Sheater, Ritchie y Sedimentación espontanea) y contenido intestinal recuperado por Enterotest; todas ellas teñidos con la coloración de ácido resistencia modificada de Z¡ehl Nielsen, en base a los siguientes parámetros: rendimiento, costo en realizar cada técnica, morfología y número de parásitos por campo; en el diagnóstico de Críptosporidium spp. e Isospora bellí.

El contenido intestinal recuperado por Enterotest, no fue superior al examen de heces pero a un costo medianamente alto alcanzó un buen rendimiento diagnóstico, con morfología y número de parásitos adecuados en el diagnóstico de Críptosporídium spp. e Isospora bellí; convirtiéndose en un método adicional al examen de heces y alternativo al uso de la endoscopía en el diagnóstico de estos parásitos en lugares donde esta no sea disponible.

Palabras clave:Criptosporidium spp; Isospora belli, Enterotest, contenido duodenal, diarrea crónica.


SUMMARY

Fecal samples and small intestinal content obtained by Enterotest were submitted between December 1994 and January 1996, by HIV (+) patients with gastrointestinal symptoms.

Unconcentrated and concentrated fecal samples (by Sheater, Ritchie and Spontaneous Sedimentation) and intestinal content obtained by Enterotest, all stained by modificated Z¡ehl-Nielsen method, were compared (multiatributive compar¡son) based on the following parameters: yield, each test cost, morphology and the number of parasites per slide, in order to diagnose Cryptosporidium spp. e Isospora belli.

Intestinal content obtained by Enterotest on the diagnosis of Cryptosporidium spp. e Isospora belli was not better than the fecal samples but it is more expensive. However, it reached a good diagnostic yield with adequate morphology, and a number of parasites per slide. Furthermore, it can be used as a second line diagnostic method (first line = fecal samples) and as an alternative in places where the use of endoscopy is not available.

Key words: Cryptosporidium, Isospora bell¡, Enterotest, Duodenal content, Chronic diarrhea.


Rev. Perú Gastroenterol. 1998; 18 (2): 106-15


INTRODUCCIÓN

En nuestro país cerca de un 50% de pacientes VIH (+) acuden a la consulta por molestias gastrointestinales, especialmente diarrea crónica(1).

Dentro de los patógenos específicos causantes de dicho tipo de diarrea, Criptosporidium spp. e Isospora belli (parásitos intestinales) son los más frecuentemente identificados(1-6).

El diagnóstico de estos parásitos en la mayoría de los laboratorios de nuestro país se basa en su hallazgo en muestras de heces frescas no concentradas y concentradas teñidas con la coloración de ácido resistencia modificada de Z¡ehl-Nielsen.

Existe sin embargo, otras técnicas diagnósticas que se han ensayado en diferentes partes del mundo, que se aplican tanto a muestras de heces concentradas y no concentradas: Fluorescencia (anticuerpos monoclonales, auramina-fenol), ensayos inmunoenzimáticos, detección de antígenos en heces, etc. algunas de las cuales han mostrado mayor sensibilidad que el análisis de heces actualmente empleado en nuestro país (7-15).

Pero en una realidad como la nuestra, la falta de recursos económicos, tecnología adecuada y capacitación del personal limitan el acceso a estas técnicas. Es por ello que la búsqueda de nuevas técnicas efectivas, sencillas y económicas que puedan suplir la falta de las ya existentes deben ser llevadas a cabo.

El tracto gastrointestinal es el habitat de Criptosporidium spp. Este parásito se adhiere a las microvellosidades del borde en cepillo de la mucosa intestinal y lleva a cabo su ciclo de vida, principalmente en la porción alta del intestino delgado donde también ha sido hallada Isospora belli(1,6,16-20); de ahí que, la obtención del líquido de esta porción intestinal nos ofrece la posibilidad de conseguir una muestra potencialmente infectada por estos parásitos, a parte de la clásicamente obtenida muestra de heces, la que teñida con la coloración de ácido resistencia modificada de Z¡ehl-Nielsen se convertiría en una buena alternativa diagnóstica.

En efecto, informes previos señalan que aspirados duodenales, obtenidos a través de endoscopía han sido positivos para la presencia de Criptosporidium spp. incluso en pacientes con examen de heces negativo(21).

Desafortunadamente la posibilidad del uso de endoscopía en nuestro país en pacientes VIH (+) está restringida, limitaciones económicas y de bioseguridad son los principales inconvenientes en realizar este procedimiento.

La cuerda encapsulada (Enterotest) descrita inicialmente por Beal(22) y utilizada en nuestro país desde 1980 para el diagnóstico de Giardia lamblia(22-24). Surge como alternativa. Esta es una técnica sencilla y económica que permite obtener muestras adecuadas de contenido duodenal y/o yeyunal.

Es por ello que en el presente trabajo realizamos una comparación multiatributiva entre la muestra intestinal recuperada por Enterotest y la muestra de heces no concentradas y concentradas por 3 diferentes métodos (Ritchie, Sheater y Sedimentación espontánea; métodos de concentración ampliamente utilizadas en nuestro país) en el diagnóstico de Criptosporidium spp. e Isospora belli en pacientes VIH (+) con síntomas gastrointestinales.


MATERIALES Y MÉTODOS

MUESTRAS

Los especímenes usados en este estudio fueron suministrados por 120 pacientes VIH (+) que acudieron al laboratorio de parasitología del Instituto de Medicina Tropical (IMT) Alexander von Humboldt - Hospital Nacional Cayetano Heredia provenientes de la consulta externa del IMT y de la Asociación de Lucha Contra el SIDA VIA LIBRE en el periodo comprendido entre diciembre 1994 - enero 1996.

Los pacientes fueron admitidos cumpliendo los siguientes criterios de inclusión:

a)-Elisa (+)y Westem Blot (+) b)-con historia de deposiciones líquidas o heces "más sueltas" (que lo normal) c)-con una frecuencia mínima de 3 veces al día d)-con cámaras continuas o altemantes (diarrea intercalada con estreñimiento) durante más de 21 días, sola, o asociada a otras molestias gastrointestinales (anorexia, dolor abdominal, náuseas o vómitos).

Cada uno de ellos cumplió la siguiente rutina:

En el 1er. día de consulta, en horas de la noche, un técnico de laboratorio colocó la cuerda encapsulada al paciente. Al siguiente día, en la mañana (2do. día) el paciente acudió al laboratorio de parasitología, llevando una 1ra. muestra de heces y un operador procedió a extraerle la cuerda encapsulada y a completar una encuesta de tolerancia al procedimiento (Anexo 1). Una 2da. muestra de heces (4to. día posterior a la consulta) y una 3ra. (5to. 6to. día posterior a la consulta) fueron llevadas consecutivamente por el paciente al laboratorio de parasitología; obteniéndose de esta manera una muestra de contenido intestinal y 3 muestras de heces por paciente.

Todas las muestras fueron procesadas inmediatamente por 3 diferentes operadores: Operador 1: realizó los métodos de concentración de heces. Operador 2: por cada muestra de heces concentradas y no concentradas y por cada muestra de contenido intestinal realizó 3 extendidos en láminas las que tiño con la coloración de ácido resistencia modificada de Z¡ehl Nielsen. Además asignó a cada lámina un número en forma randomizada para asegurarse que el microscopista no conozca el tipo de muestra utilizada.

Operador 3: Revisó al microscopio los extendidos de cada muestra en el mismo día de recibida ésta llenando una ficha por cada paciente (anexo 2). Evaluó el número de parásitos por campo con 400 aumentos (microscopia de luz). Según el mayor número de parásitos que encontrase en cualquier campo siguió la siguiente escala: 1+= < 4 parásitos 2+= 5-9; 3+= 10-14 4+= > 15 parásitos por campo; escala usualmente utilizada por el laboratorio de parasitología del IMT y semejante a otras utilizadas por laboratorios extranjeros(13).

También evaluó la morfología y tinción del parásito en forma subjetiva, basado en tamaño, forma, color y habilidad de distinguirlo de otros artefactos. Evaluó según la siguiente escala Bueno = 3, Regular = 2, Malo = 1 y emitió su criterio basado en todos los parásitos vistos o en su defecto del campo donde encontró el mayor número de ellos. Finalmente también determinó el tiempo de lectura de la lámina para cada muestra.


PROCEDIMIENTOS

Todos los procedimientos fueron realizados con las normas de bioseguridad correspondientes(25) y como han sido reportados previamente: La coloración de ácido resistencia modificada de Z¡ehl-Nielsen fue hecha como es descrita por Rusnack(7).

El método de concentración de Ritchie utilizado fue el de formol éter, tal y como fue descrito originalmente por Ritchie(26). El método de flotación de Sheater fue hecho según Scott(27) con algunas modificaciones hechas por Tello(28). Este último describe en 1988 la técnica de sedimentación espontánea(29) la cual se aplicó también en el presente estudio.

La "cuerda encapsulada" de fabricación local (Servicios Universitarios de Apoyo, Universidad Peruana Cayetano Heredia), consta como su nombre indica, de un cordel de poliester trenzado de 1.40 mt. de largo, enrrollado dentro de una cápsula de gelatina dotada de un peso de plomo revestido de resina acrílica para apresurar el descenso. La cuerda sale del interior de la cápsula a través de un agujero en el extremo opuesto al ubicado por el lastre. Las cápsulas son esterilizadas con óxido de etileno.

El paciente en ayunas (tres horas por lo menos) acudió en la noche a la consulta donde deglutió la cápsula con agua. El extremo de la cuerda fue fijado a la mejilla del paciente con cinta adhesiva. Se le indicó que regresase a casa pudiendo tomar sólo líquidos claros mas no otros líquidos o sólidos.

El operador al día siguiente usando guantes estériles retiró la cuerda por la boca mediante una tracción rápida pero suave, manteniendo el paciente el cuello hiperextendido.

Usualmente; 60 a 90 cmts. distales de la cuerda estuvieron impregnados de bilis y mucus, material que se utilizó para la respectiva tinción con Z¡ehl-Nielsen.


PARÁMETROS DE COMPARACIÓN

Las diferentes métodos de diagnóstico (representadas por cada diferente tipo de muestra) se compararon en base a los siguientes parámetros:

 

Rendimiento.-

De todos los pacientes diagnosticados como positivos para la presencia del parásito (al menos por un método diagnóstico) cuantos son positivos para cada una de las técnicas al final de la 3ra. muestra (para heces) o al final de 1ra. muestra (para contenido intestinal).


Costo en realizar cada procedimiento
.-

Se evaluó el costo de materiales y el costo del tiempo del operador para cada uno de las métodos diagnósticos.


Costo de materiales
.-

Analizadas 100 muestras, se cuantificó los reactivos gastados en cada técnica diagnóstica y se calculó el costo en soles (basado en el valor de venta en el mercado). Luego se dividió el costo total entre 100, obteniéndose el costo unitario para cada tipo de muestra o técnica diagnóstica (esto es debido a que por cada procedimiento se utiliza una cantidad fija de reactivos).


Costo del tiempo del olperador
.-

Se cuantificó el tiempo utilizado por el operador luego de analizadas 100 muestras, obteniéndose la media aritmética en minutos por cada tipo de muestra.

Este tiempo se convirtió a soles, conociendo que el honorario promedio de un operador de laboratorio era 1.8 soles la hora o 0.03 soles por minuto.

No se tomó en cuenta el tiempo de reposo de la muestra. No se tomó en cuenta el costo de la centrífuga.


Morfología del Parásito
.-

Evaluado subjetivamente por el microscopista como ya se describió previamente.


Número de parásitos por campo
.-

También ya anteriormente descrito.


Análisis Estadístico
.-

Para el análisis de rendimiento (proporciones) se evaluó inicialmente con un test discriminativo, la prueba Q de Cochran para muestras pareadas. De observarse diferencia significativa se utilizó el X2 de Mac Nemar para ver si existía alguna diferencia entre la muestra intestinal y la muestra de heces (concentradas y no c000oncentradas).

Para el análisis de morfología del parásito y número de parásitos por campo, se utilizó inicialmente un test discriminativo ANOVA de 2 vías de Friedman. De observarse diferencia significativa se utilizó la prueba de Wilcoxon para comparación por grupos entre muestra intestinal y muestra de heces (concentradas y no concentradas).

El valor usado para, fue de 0.05 para comparaciones simples y de 0.01 para las múltiples(level downward).


RESULTADOS

CRIPTOSPORIDIUM

De 120 pacientes, 15 (12.5%) fueron diagnosticados con infección por Criptosporidium spp. por alguna de las técnicas. El cuadro N°1 muestra para cada una de ellas el número de resultados positivos por muestra analizada; puede verse que heces concentradas por sedimentación espontánea tuvo el más alto rendimiento (15/15=100%); seguido de heces no concentradas (14/15=93%), Ritchie (14/15=93%), Enter0otest (13/15=87%) y finalmente Sheater (8/15=53%).

CUADRO Nº 1

PACIENTES CON CRIPTOSPORIDIUM SPP POR TIPO DE MUESTRA

Tipo de Muestra Nº de Muestra Total de pacientes con diagnóstico positivo por tipo de muestra Rendimiento
1ra 2da 3ra
Heces no Concentradas 13 14 13 14 93%
Heces concentradas por Met. Sed. Espontánea 14 15 15 15 100%
Heces concentradas por Met. Sheater 8 7 8 8 53%
Heces concentradas por Met. Ritchie 14 13 14 14 93%
Contenido Intestinal Recuperado por Met. Enterotest 13 -- -- 13 87%
Total de pacientes positivos por alguna técnica 15 100%
Q Cochcran : p = 0,0087
Mc Nemar :
Enterotest "vs" Sheater x2 = 3.2 p < 0,05

Contenido intestinal recu0perado por Enterotest demostró ser superior que la muestra de heces concentradas por el método de Sheater (p<0.05); pero no demostró ser superior que muestras de heces no concentradas o concentradas por los método de Ritchie y sedimentación espontánea.

Se analizó el número de parásitos por campo de la 1ra. muestra de heces y del contenido intestinal (ver cuadro N°2); a pesar de verse la tendencia a un mayor número de parásitos en la lectura por los métodos de concentración de heces, no hubo diferencia estadísticamente significativa cuando se les comparó con el material intestinal. Puede deberse además que el paciente N°2 tuvo diagnóstico de infección por Criptosporidium spp por contenido intestinal recuperado por Enterotest siendo negativo para la primera muestra de heces (necesitó de una 2da y 3ra muestras de heces para tener diagnóstico positivo).

CUADRO Nº 2

Nº DE PARASITOS POR CAMPO DE LA 1RA MUESTRA POR CADA TÉCNICA DIAGNÓSTICA PARA CADA PACIENTE CON CRIPTOSPORIDIUM SPP

Nº de Pacientes Sedimt. Espontanea Heces no Concentradas Enterotest Sheater Ritchie
1 2 + 1+ - - 2+
2 - - 1+ - -
3 4 + 3+ 3+ 1+ 4+
4 2 + 3+ 1+ - 1+
5 2 + 2+ 2+ - 2+
6 2 + 1+ 1+ 1+ 2+
7 4 + 3+ 2+ - 4+
8 4 + 4+ 3+ 1+ 4+
9 1 + - - - 2+
10 3 + 2+ 1+ 1+ 3+
11 3 + 3+ 4+ 3+ 2+
12 2 + 2+ 2+ 2+ 2+
13 2 + 1+ 3+ - 3+
14 3 + 2+ 2+ 2+ 3+
15 3 + 2+ 2+ 3+ 3+
ANOVA rangos de Friedman: p = 0,047 (Excluyendo al método de Sheater)

 

CUADRO Nº 3

EVALUACIÓN SUBJETIVA DE MORFOLOGÍA Y TINCIÓN DEL PARÁSITO DE LA 1RA. MUESTRA POR CADA TÉCNICA DIAGNÓSTICA PARA CADA PACIENTE CON CRIPTOSPORIDIUM SPP.

Nº de Paciente Sedimt. Espontánea Heces no Concentradas Enterotest Sheater Ritchie
1 2+ 1+ - - 2+
1 3 2 - - 2
2 - - 2 - -
3 2 2 2 2 2
4 3 3 2 - 2
5 3 3 2 - 2
6 2 3 3 2 3
7 3 2 2 - 3
8 3 3 2 2 3
9 2 - - - 2
10 3 2 3 2 2
11 2 2 2 2 2
12 1 2 2 1 2
13 3 3 2 - 3
14 3 2 3 2 2
15 2 3 2 2 2
ANOVA rangos de Friedman: p = 0,0875 (Excluyendo al método de Sheater)

 

CUADRO Nº 4

PACIENTES CON ISOSPORA BELLI POR TIPO DE MUESTRA

Tipo de Muestra Nº de Muestra Total de Pacientes con diagnóstico positivo por tipo de muestra Rendimiento
1ra 2da 3ra
Heces no concentradas 9 10 9 10 100%
Heces concentradas Por Sed. Espontánea 9 10 10 10 100%
Heces concentradas por Sheater 5 4 5 5 50%
Heces concentradas por Ritchie 8 8 8 8 80%
Contenido Intestinal *Enterotest 9 - - 9 90%

Total de pacientes positivos por alguna técnica

10 100%
Q Cochcran : p = 0,00925

El cuadro N°3 muestra la evaluación subjetiva de morfología y tinción del parásito, no hubo diferencia estadísticamente significativa entre material intestinal y heces concentradas o no concentradas.


ISOSPORA BELLI

El cuadro 4 muestra el rendimiento para cada tipo de muestra; 10 (8.33%) fueron los pacientes diagnosticados con infección por Isospora belli. Heces concentradas por sedimentación espontánea y heces no concentradas alcanzaron al 100% de rendimiento (10/10=100%) con 2 muestras como mínimo, siguió el contenido intestinal recuperado con Enterotest con un 90% de rendimiento 0/10=90%) y finalmente heces concentradas por los métodos de Ritchie y Sheater alcanzaron (8/10=80%) y (5/10=50%) respectivamente. No hubo diferencia estadísticamente significativa entre material intestinal y material fecal.

CUADRO Nº 5

Nº DE PARASITOS POR CAMPO DE LA 1RA. MUESTRA ANALIZADA POR CADA TEDNICA DIAGNOSTICA PARA CADA PACIENTE CON ISOSPORA BELLI

Nº de Pacientes Sedimt. Espont. Heces no concentradas Enterotest Sheater Ritchie
1 2+ 2+ 1+ - -
2 1+ - 2+ - -
3 2+ 1+ 1+ 2+ 2+
4 2+ 1+ 2+ 2+ 2+
5 3+ 1+ 1+ - 3+
6 2+ 1+ 2+ 2+ 2+
7 1+ 3+ 3+ - 2+
8 4+ 1+ 3+ 1+ 2+
9 1+ 2+ 1+ 2+ 2+
10 - 1+ - - 1+
ANOVA de rangos de Friedman : p = 0,3555 (Excluyendo al método de Sheater)

En cuanto al número de parásitos, a pesar de existir una tendencia en proveer preparados con cargas parasitarias más altas por los métodos de concentración, no se encontró diferencias estadísticamente significativa cuando se les comparó contra material intestinal. (Cuadro N°5). Tampoco hubo diferencia en cuanto a morfología y tinción (Cuadro N°6).

CUADRO Nº 6

EVALUACIÓN SUBJETIVA DE MORFOLOGÍA Y TINCIÓN DEL PARASITO DE LA 1RA. MUESTRA POR CADA TÉCNICA DIAGNOSTICA PARA CADA PACIENTE CON ISOSPORA BELLI

Nº de Paciente Sedimt. Espont. Heces no Concentradas Enterotest Sheater Ritchie
1 2 3 3 - -
2 3 - 3 - -
3 2 3 2 2 3
4 3 3 3 2 3
5 3 3 2 - 3
6 3 3 3 2 2
7 2 2 2 - 2
8 3 2 3 2 3
9 2 2 3 3 2
10 - 3 - - 3
ANOVA de rangos de Friedman : p = 0,3456 (Excluyendo al método de Sheater)

 

CUADRO Nº 7

COSTO TOTAL DE CADA TECNICA DIAGNOSTICA (POR UNA MUESTRA)

Técnica Empleada Costo por reactivo (S/.) Costo del tiempo efectivo del operador (S/. minutos) Costo de Ziehl-Nielsen Costo Total
Ritchie 3,50 0,30/10 1,5 5,3
Sheater 2,20 0,36/12 1,5 4,06
Sedimentación Espontánea 0,10 0,30/10 1,5 1,90
Enterotest 5,00 0,12/4 1,5 6,62
Heces no concentradas -- -- 1,5 1,5
Nota : El tiempo de lectura de la lámina fue similar para todas las técnicas no habiendo mayor diferencia en sus promedios

 

COSTO EN REALIZAR CADA PROCEDIMIENTO

El Cuadro N°7 muestra el costo total para cada técnica diagnóstica (para solo una muestra) observándose que Enterotest es el método más caro (S/. 6.62) y el de heces no concentradas el más barato (S/. 1.5).


TEST DE TOLERANCIA AL USO DE LA CUERDA ENCAPSULADA

La molestia principal fue la sensación de cuerpo extraño, 120 pacientes (100%) durante el uso y 100 (83%) durante la colocación de la cuerda la experimentaron.

18 pacientes (15%) tuvieron náuseas durante la colocación de la cuerda y 4 (3.3%) durante el uso de la cuerda. La principal molestia durante la extracción de la cuerda fue ardor 86 (71%). El promedio del tiempo de uso de la cuerda fue 12.3 horas. (ver cuadro N°8).

 

CUADRO Nº 8

TEST DE TOLERANCIA A LA CUERDA ENCAPSULADA

Molestias que aparecieron o aumentaron durante la colocacion Molestias que aparecieron o aumentaron durante el uso de la cuerda Molestias durante la extracción
Náuseas 18 4 2
Vómitos 1 0 0
Sensación cuerpo extraño 120 100 0
Dolor 2 0 1
Ardor 0 5 86
Ninguna 0 20 34
Nº Total de pacientes = 120
Nota : hubo pacientes con más de una molestia
No hubo alteraciones durante el sueño
Promedio de tiempo de uso de cuerda encapsulada = 12.3 hrs.

 


DISCUSIÓN

Material intestinal recuperado por Enterotest a pesar de no demostrar ser superior al examen de heces no concentradas o concentradas (excepto a las heces concentradas por el método de Sheater) demuestra ser efectivo; provee muestras con un alto rendimiento diagnóstico (diagnóstico positivo con una sola muestra solicitada mientras se necesitaba de dos muestras fecales), provee extendidos con cargas parasitarias adecuadas e incluso altas, muestra una morfología y tinción del parásito aceptable y demuestra ser un método tolerable en un alto porcentaje de pacientes. Además ofrece la ventaja de proveer material intestinal, que como se sabe es útil en el diagnóstico de hongos y otras parasitosis(30) como Giardia lamblia, Strongyloides stercolaris y Fasciola hepática; y en la evaluación de sobrecrecimiento bacteriano(31,32).

Anexo 01

Anexo 02

El Enterotest se convierte entonces en un método alternativo a la endoscopía para la obtención de material infectado por Criptosporidium spp o Isospora belli en pacientes VIH (+) con síntomas gastrointestinales, exhibiendo incluso algunas ventajas frente a ella: más barato, menos invasivo, no se necesita de un especialista para su realización y no emplea sedantes; características ya reconocidas en el diágnostico de giardiasis en niños(33).

Por todo ello, para el diagnóstico de infecciones oportunistas productoras de enfermedad gastrointestinal en pacientes VIH (+) como lo son Criptosporidium spp e Isospora belli, el Enterotest puede utilizarse como una prueba diagnóstica adicional al examen de heces (el cual por su bajo costo y gran rendimiento deberá realizarse de primera intención en todos estos pacientes) y como método alternativo a la endoscopía.

Dr. Luis Fernando Venegos Tresierra

CMP. 31402

Los Robles # 487 Urb. Jardines Virú, Bellavista, Callao

Teléfonos: 933-35081/451-3032

 

Agradecimientos:

A las Sras. Carmen, Matilde, Teresa; Señoritas Giuliana, Lady y Personal del IMT Alexander Von Humbolt.

El presente trabajo se realizó con apoyo del CONCYTEC.

 

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