RESUMEN

El cáncer de páncreas continúa estando en el quinto lugar como causal de muerte debido a cáncer en los Estados Unidos. Es un tipo de cáncer que no responde al clásico tratamiento de quimioterapia. El 90 % de los tumores de páncreas son adenocarcinomas.

Hasta la fecha, los hallazgos citogenéticos de sólo un pequeño número de tumores primarios, efusiones y líneas celulares de páncreas han sido reportados.

Los estudios en citogenética de esta neoplasia se han visto truncados por el 

hecho de que es un tumor bastante difícil de cultivar ni vitro. Sin embargo, los hallazgos citogenéticos reportados hasta la fecha mencionan variaciones numéricas y complejos arreglos estructurales que involucran a los cromosomas 1,3.5,7,9,11,12,20 X, Y así como la presencia de cromosomas marcadores.

La Citogenética convencional enfrenta además el problema de identificación de rearreglos cromosómicos bastante complejos. La técnica de MULTICOLOR FISH, la misma que es una técnica de hibridización in situ con fluorescencia, ofrece la posibilidad de identificar el componente cromosómico en cromosomas derivados así como en cromosomas marcadores.

En el presente trabajo, presentamos el uso de MULTICOLOR - FISH en dos líneas celulares pancreáticas Panc - 1 y CAPAN - 1, estudiadas previamente con citogenética convencional (1), y gracias a ella, pudimos reconocer y resolver algunos de las interrogantes que surgieron con el bandeo G, en nuestros primeros intentos de investigación en líneas celulares de adenocarcinoma de páncreas.


ABSTRACT

Pancreatic cancer continues in the fifth place as a cause of death due to cancer in the westem society This type of cancer does not respond to classical chemotherapy. 90% of the tumors of pancreas are adenocarcinomas.

Today, cytogenetic findings of only afew pancreatic primary tumors, efflisions and cell lines have been reported. The c),togenetic studies in this tumor have been frustrated due to the fact that this is a very difficult tumor to grow in vitro. However the few cytogenetic reportsfound in the literature up to date report numeric abnornialities and coniplex chromosomal rearrangements involving chromosomes 1,3,5,7,9,11,12,20 X, and Y as well as the presence of marker chromosomes (1).

Conventional cytogeneticsfaces the problem of being unable tojully identify complex chromosomal rearrangements. MULTICOLOR FISH (M-FISH), which is a derived teclinique from FISH, offers the possibility to identify the material involved in derivative chromosomes and in those marker chromosomes.

In the current study, we present the use of M-DISH in two pancreatic cell lines: Panc - land CAPAN - 1, which have been previolisly studied with conventional cytogenetics. And we were able to identify and resolve some of the questions that arose in our attempt to study these pancreatic cell lines.

    El cáncer de páncreas es uno de los tipos más agresivos de neoplasia, cuyas causas se mantienen en incógnita. Se especula que los factores etiológicos que provocan este tipo de cáncer, sea el uso indiscriminado de cigarrillo, una dieta rica en grasas saturadas y carne roja, el uso de cafeína, así como el componente genético.

Desgraciadamente es un tipo de tumor bastante difícil de cultivar in vitro, lo cual imposibilita conocer que cromosomas están involucrados en este tipo de neoplasia, hallazgo que sería de gran utilidad en el pronóstico de esta enfermedad.

Técnicas como la hibridización comparada de genomas (GGH), la cual no necesita de un cultivo del tumor, sino únicamente, la obtención de ADN del mismo, ha sido un paso que ha revolucionado el conocimiento en este tipo de carcinogénesis. Así, conocemos por el momento, que regiones en el genoma aparecen amplificadas o deleccionadas en cáncer de páncreas (9).

Existen algunas líneas celulares derivadas de adenocarcinoma de panaceas, que son excelentes modelos a estudiar para comprender los rearreglos estructurales secundarios que se pueden dar en este tipo de cáncer.

La citogenética convencional si bien es cierto ha jugado un papel muy importante en la clasificación de las malignidades hematólogicas FAB y WHO encuentra tropiezos en la identificación de cromosomas marcadores, cromosomas derivados y complejos rearreglos estructurales, los mismos que son bastante comunes en los cariotipos encontrados en adenocarcinomas de páncreas. Sin embargo, la técnica de MULTICOLOR -FISH, que es una técnica derivada de FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDAZATION (FISH), y en donde se usa un cocktail de 24 sondas, se esta convirtiendo en una gran herramienta para reconocer cromosomas marcadores así como otros rearreglos estructurales, como los que se dan en cáncer pancreático.

Esta técnica fue introducida en 1996, para analizar los 24 cromosomas en diferentes colores fluorescentes, mediante el uso de un set de filtros y un programa de software computarizado. Todas las sondas para identificar los 24 cromosomas están marcadas con un set de 5 fluorocromos diferentes: verde (green), rojo, oro (gold), aqua y far red. A cada cromosoma se le asigna una combinación de fluorocromos única y por tanto un espectro de emisión altamente característico, el mismo que es usado para definir el reconocimiento de cada uno de los 23 pares de cromosomas. Sin embargo, la utilidad clínica del M- FISH se ha visto limitada debido a la falta de disponibilidad de los reactivos y al alto costo del programa de software, convirtiéndola en una técnica bastante costosa.

En el presente estudio, comparamos los resultados citogenéticos previamente identificados con bandeo G, de dos líneas celulares de cáncer de páncreas: CAPAN - 1 y Panc -1 y el nuevo diagnóstico de los mismos gracias a la técnica de MULTICOLOR FISH (5) (6).

Bandeo G

Las líneas celulares Pone – 1 y CAPAN-1 fueron obtenidas del Centro de Tejidos de Duke University, las mismas que provenían de la American Type Culture Collection (USA). Se estableció cultivos usando medio RPMI 1640 (Libro, 11875 - 093, Lile Technologies, Long Island, New Stork), enriquecido con glutamina 0.01 % (L-glutamine, 1 Ex, 29.2 mg/ml, Libro 25038-081), antibióticos (Pen Strep 1%, 10,000 U/ml, Gibeo) y suero fetal bovino, 15% (Cabra).

Se procedió a la cosecha de las líneas celulares siguiendo los métodos estancaras en citogenética. Los cultivos recibieron 10ul de coleemid (10 ptg/ml, Libro) por cada 5 ml de medio, por espacio de una hora con treinta minutos; seguido por un shock hipotónico (KCI, 0.075M) por treinta minutos y una fijación en solución carnoy (3 partes de methanol: 1 parte de ácido acético glacial).

El proceso de fijación se repitió por dos veces, hasta obtener un pellet consistente que se utilizó para gotear las laminas.

Las láminas fueron preparadas siguiendo el metido de goteo y tenidas con colorante Wright 4%, previa tripsinización (tripsina, 2.5 %, 10x solution, Irvine Scientific) por 25 segundos.

Se analizaron 20 metafases. Las células fueron capturadas y los cariotipos preparados. Las anomalías cromosomicas fueron reportadas de acuerdo a la nomenclatura internacional INCN (1995) (2).

MULTICOLOR FISH

M-FISH fue aplicada usando efectivos Spectra Vysion de Vysis, Iras. (Downers Grove, IL) y el programa Software Quips Spectra Vysion TM-24 color FISH Imaging de Applied Imaging Corporation.

Las láminas fueron incubadas en 2xSSC a 37° C for 30 minutos, luego deshidratadas a través de una batería de alcoholes (70%, 85%, 100%). No se les practicó ningún otro pretratamiento.

Dichas láminas fueron denaturadas en una solución conteniendo formamida 70% en 2xSSC a 72° C por cinco minutos y nuevamente hidratadas en una bacteria similar de alcoholes. La sonda usada fue preparada de acuerdo a las instrucciones en el catálogo de manufactura. La incubación fue realizada por 48 horas a 37° C en una cámara húmeda.

La detección se realizó usando DAPI III (42 ng DAPI/nil in antifade mounting solution, VYSIS) como medio contrastante. DAPI III es la forma diluida de medio contratante, que se usa para resultados óptimos en ensayos de multicolor - FISH y de ensayos Spectra Vysion.

Bandeo G

Los hallazgos citogenéticos en ambas líneas celulares revelaron cariotipos bastante complejos.

El cariotipo de CAPAN-1 y Panc -1 se resumen en la Figura 1 y Figura 2, respectivamente. El número modal cromosimoco en CAPAN 1 fue de 57 cromosomas y el de Panc-I fue de 63 cromosomas.

M-FISH

En el caso de CAPAN-1, el cromosoma derivado der(1) t (1;?) (q11;?) correspondió a una translocación entro los cromosomas 1 y 15, como puede verse en la Figura 3.

Asimismo, el hallazgo, add(3q) correspondía a una translocación entre los cromosomas 2 y 3.

Y en el caso del cromosoma derivado 17: der(170t(17;?)(p11.1;?) se trataba de una translocación entre los cromosomas 13 y 17.

Para. Panc-1, el rearreglo add(3q), el cual era una copia extra, MFISH determinó que se trataba de una t(3;10) (q10;ql0).

En esta misma línea celular, el rearreglo, der(1)t(1;?)(q11;?), se trataba de una translocación entre los cromosomas 1 el 5: t(1;5)(p12;q11.2).

Y la copia extra del cromosoma 8 contenía material translocado del cromosoma 21:t(8;21)(q10;q10).
En esta misma línea celular, Panc-I, se encontró además un cromosoma derivado probablemente conteniendo material del cromosoma 6 y 17 (Figura 4).

La hibridación in situ multicolor (M-FISM), parece ser una gran herramienta para complementar los estudios citogenéticos usando bandeo convencional G en el caso de complejos cariotipos como los encontrados en estas dos líneas celulares.

Estudios de hibridización in situ con fluorescencia usados anteriormente, permitieron corroborar los hallazgos citogenéticos en nuestro laboratorio, como es el caso de trisomía 7, 11, 9, 12 Y (1). Asimismo las técnicas de pintado de todo el cromosoma, usando sondas que cubrían a todo el cromosoma permitieron diferenciar el material contenido en ciertos marcadores y fue realizado también en nuestro laboratorio y reportado anteriormente (2). Pero el uso de MULTICOLOR FISH ha permitido tener una visión panorámica de todos los componentes involucrados en los complejos rearreglos cromosómicos encontrados en las líneas celulares de nuestro estudio.

Estudios similares con otras líneas celulares pancreáticas, así como con tumores primarios de páncreas nos permitirán emitir un enunciado preliminar de cuales son los cromosomas y rearreglos cromosómicos que se dan particularmente en este tipo de neoplasia. Johansset et (7) and Griffin (8) han reportado también cariotipos normales en tumores de páncreas. La posible explicación a este hecho es de que los cariotipos normales corresponden quizás a células del estroma de división que no pertenecen al parénquima del tumor. Es por ello que tecnologías como CGH y otras técnicas de FISH ofrecen una solución y una promesa en los estudios de citogenética en este tipo de neoplasia.

Esperemos también, que la tecnología moderna como el uso de MICROARRAYS, permita en un futuro identificar mutaciones en los principales genes que juegan un papel orquestal en este tipo de carcinogenesis, y que algún día contemos con un patrón de genes, al igual que en el caso del cáncer de colon, en donde el papel y la participación de un gran número de genes ya ha sido detectados.

* Laboratory of Cytogeneties. Department of Pathology. Duke University Medical Center. Durham, NC 27710 - USA.

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