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En 1981 se identifica el oncogen "neu" en las células del neuroblastoma de la rata en experiencias de transfección con fibroblastos 3T3. Este oncogen codifica una proteína con un peso molecular de 185 kd., homóloga del receptor del factor de crecimiento humano.
En 1985 se encontró que un cultivo de células de carcinoma mamario humano amplificaba el "neu gene". El equivalente humano del "neu gene" de la rata ha sido clonado de una librería de ADN complementario y se le denomina HER-2 (de "Human Epidermal Growth Factor Receptor - 2"). Al complementario se le denomina c-erb B2. En el genoma humano el HER-2 se encuentra ubicado en el brazo largo del cromosoma 17 (1 - 7).
A partir de 1989, se ha venido observando que algunos cánceres mamarios humanos muestran sobreexpresión del c-erb B2 (8).
En 1999, una recopilación de 52 estudios, que comprendían más de 16 mil pacientes, encontró sobreexpresión de la proteína HER-2 en el 10 al 34% de cánceres de mama (9).
La sobreexpresión del HER-2 puede detectarse por inmunohistoquímica, que reconoce la proteína depositada en la membrana celular, o por detección de amplificación génica, a través de la "hibridización in situ" (FISH) (10, 11).
Si bien los informes iniciales parecieron indicar que la positividad del HER-2 estaba asociada a un pronóstico desfavorable (12), esta relación, parecería no ser tan firme en las pacientes con ganglios linfáticos negativos (13).
De otro lado, el Colegio Americano de Patólogos en su análisis sobre los factores pronósticos en el cáncer de mama, subraya que la sobreexpresión del HER-2/neu se asocia a una respuesta disminuida a los tratamientos con methotrexate y tamoxifeno, y con una mejor respuesta al tratamiento con doxorubicin (14).
Más recientemente, la demostración de la efectividad del anticuerpo monoclonal contra el HER-2 (Herceptin o Trastuzumab) en el cáncer mamario humano, sea como tratamiento singular o como tratamiento asociado y con efectos favorables aun en pacientes con enfermedad metastásica, le ha concedido, una significativa trascendencia a la determinación de la presencia o no de sobreexpresión de HER-2/neu. El efecto benéfico de este novel tratamiento se hace presente sólo en las pacientes que muestran esa sobreexpresión (15, 16).
Lo anterior nos ha estimulado a investigar la frecuencia de la sobreexpresión de c-erb B2 en una serie consecutiva de casos de carcinoma mamario estudiados en nuestro laboratorio. Paralelamente, se ha intentado una correlación entre la positividad al c-erb B2 y los resultados obtenidos, en los mismos casos, para la presencia de receptores de estrógenos y de progesterona, las reacciones para el Ki67 y p53 y el índice Pronóstico de Nottingham (17).
La presente investigación está basada en el estudio de muestras anátomo patológicas (biopsias y/o piezas operatorias) del Instituto de Patología y Biología Molecular "Arias Stella" (IPBMAS), diagnosticadas como cáncer de mama por dos patólogos, en el periodo comprendido entre Setiembre de 1998 y Octubre del 2002, en las cuales se hizo la reacción inmunohistoquímica para c-erb B2. En total se estudiaron 160 casos. De estos, en 158 se determinó, también, la presencia de receptores de estrógenos, en 157 de receptores de progesterona, en 98 la proteína Ki67, en 94 la presencia de p53 y en 74 se obtuvo el registro del índice de Nottingham.
Los tejidos fueron fijados en formol e incluidos en parafina, cortados en secciones de 4 a 5 micras y coloreados con H-E.
Para el estudio del c-erb B2 se utilizó el "Kit DAKO TM Rabbit Antihuman c-erb B2 Oncoprotein", siguiendo las instrucciones contenidas en el manual de procedimientos del fabricante:
Buffer citrato a ph 6.0, microondas por 4 minutos (3 veces), incubación con peróxido de hidrógeno al 3% durante 15 minutos, aplicación del anticuerpo primario "c-erb B2 Rabbit Anti-human Immunoglobulin (DAKOTM)" , enjuague con solución buffer Tris Salino (ph 7.6, 0.05M tris y 0,145NI NaCl), aplicación de "Biotinylated Anti-rabbit and Antimouse Immunoglobulins (DAKOTM)", durante 25 a 30 minutos, incubación en Streptavidin Peroxidasa (StreptavidinHRI`DAKOTI) durante 25 a 30 minutos y aplicación de la solución cromógeno de Diaminobencidina (DAB DAKOTI). Como tinción de contraste se utilizó la Hematoxilina.
Para demostrar la presencia de receptores estrogénicos, receptores de progesterona, Ki67 y p53 utilizamos los reactivos DAKO y se siguió el sistema estándar de procesamiento para inmunohistoquímica.
La lectura microscópica de la reacción para evaluar la sobreexpresión de c-erb B2 se hizo siguiendo los criterios de interpretación establecidos en el manual del fabricante (18). Debemos subrayar que frecuentemente hubo dificultad para definir una categoría entre dos observadores. En estos casos, luego de un cambio de ideas se adoptó por consenso la categoría diagnóstica del caso.
Para la evaluación histológica seguimos las normas recomendadas por el "Standardized Reportin- of Surgical Pathology Diagnoses"(19).
La sobreexpresión de c-erb B2 se consideró positiva en aquellos casos que presentaba un "score" de 2 y 3 cruces según los criterios establecidos en el manual de interpretación de DAKO (18):
-
0, negativo; no se observa tinción o se observa tinción de la membrana en menos del 10% de las células
tumorales (Fig. 1, A y
B).
-
1+, negativo; se observa una tinción de la membrana apenas o ligeramente perceptible en más del 10% de las células tumorales. Las células están teñidas sólo en parte de la
membrana (Fig. 2, A y
B).
-
2+, positivo; se observa una tinción de la membrana débil a moderada y completa en más del 10% de las células
tumorales (Fig. 3, A y
B).
-
3+, positivo; se observa una tinción de la membrana fuerte y completa en más del 10% de las células
tumorales (Fig. 4, A y
B).
Las figuras
1, 2 ,
3 y 4 ilustran los aspectos histológicos de los distintos grados de marcación.
Se diseñó una base de datos para el registro de los casos y para el análisis estadístico se utilizó el paquete SPSS 9.0 para Windows.
Se consideró como variable dependiente la presencia de la proteína c-erb B2 y como variables independientes: el índice Pronóstico de Nottingham, presencia de receptores de estrógenos, progesterona, Ki67 y p53. Mediante análisis bivariado, a través de pruebas no paramétricas (Chi-cuadrado o Kruskar Wallis) según el caso, se evaluó la existencia de una asociación entre las variables dependientes y las variables independientes. Para una asociación estadísticamente significativa se consideró el valor de p menor de 0.05.
La
tabla 1
indica los tipos histológicos de los casos estudiados y el rango de edades. Como puede verse el número mayor de casos correspondió al carcinoma mamario infiltrante ductal, ordinario.
De los 160 casos estudiados, 87 fueron positivos para la reacción de c-erb B2 es decir dieron una marcación positiva de 2 ó 3 cruces, lo que hace un porcentaje de positividad del orden de 54.37%.
La tabla 2
nos indica que de 87 casos positivos para c-erb B2, 59 (67.8 1 %) fueron positivos para receptores estrogénicos; y de 71 casos negativos para c-erb B 2, 50 (70.42%) fueron también positivos para receptores estrogénicos.
En la Tabla 3 se
aprecia que de 86 casos positivos para c-erb B2, 64 (74,41%) fueron positivos para receptores de progesterona; y de 71 casos negativos para cerbB2, 52 (73.23%) fueron también positivos para receptores de progesterona.
Puede observarse entonces que nuestros resultados no arrojan ninguna relación entre las reacciones positivas a los receptores estrogénicos y progesterónicos y la presencia o no de reacción positiva para el c-erb B2.
La tabla 4
muestra la relación con el Ki67 y nos indica que de 58 casos positivos para c-erb B2, 48 (82.75%) fueron positivos para Ki67; y de 40 casos negativos para c-erb B2, 25 (62.5%) fueron también positivos para Ki67.
La tabla 5 ilustra
los resultados la relación con el p53 y nos indica que de 55 casos positivos para c-erb B2, 28 (50.90%) fueron positivos para p53; y de 39 casos negativos para c-erb B2, 11 (28.20%) fueron también positivos para p53.
Los resultados muestran que no hay correlación con el índice de proliferación (Ki67) pero en cambio se observa una evidente tendencia de mayor presencia de oncomutación (p53) en los casos de c-erb B2 positivos, sin embargo, el análisis estadístico indicó un valor de p mayor al 0.05 y, por lo tanto, esa. tendencia no tiene significación estadística.
La comparación entre los grupos de acuerdo al índice pronóstico de Nottingham
(tabla 6)
tampoco encontró ninguna correlación con la reacción al c--erb B2.
Las dificultades de interpretación a las que nos hemos referido en la sección de materiales y métodos para definir las categorías de positividad al ec-erb B2 nos llevó a buscar un sistema diagnóstico que fuera mas fácilmente reproducible y que es motivo de otra publicación (20).
El resultado mas saliente del presente estudio ha sido encontrar un porcentaje de reacciones positivas a c-erb B2 por encima de lo señalado en la literatura. Como mencionáramos anteriormente la mayoría de los estudios reportan reacciones positivas al c-erb B2 en alrededor del 30% de los casos de carcinoma mamario (12, 21 y 22). Sin embargo, conviene señalar que hay observaciones con porcentaje por encima de este rango, así, por ejemplo, en Egipto se ha reportado una incidencia del 40% (23), en Irán del 41% (24) y en Alemania del 42% (25). Es difícil explicar estas diferencias. Lo primero que hay que considerar es la falta de homogeneidad en el sistema de lecturas, variaciones en la técnica empleada y en algún grado de selectividad en los casos estudiados por cada grupo de investigación.
Nuestro material, sin duda, tiene el sesgo de pertenecer, exclusivamente, al sector privado y ello subraya alguna forma de selección. Los médicos que solicitan los exámenes pueden estar mejor informados y pertenecer a escuelas con protocolos definidos para el manejo de sus pacientes. No hay suficiente evidencia hasta ahora, que factores étnicos influyan en la ocurrencia de mayor o menor susceptibilidad a determinadas modificaciones a nivel del genoma o de sus expresiones moleculares, pero esta es una variable que, en algún momento, habrá que analizar en profundidad *.
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(*)En el 93rd Annual Meeting United States an Canadian Academy of Pathology, March 6-12, 2004, Vancouver, B.C., Canada, C. Yarin y col. reportan en un estudio controlado en dos laboratorios, uno en Thailandia y otro en Toronto, en una serie de 125 pacientes con cáncer mamario, una positividad al c-erb B2 de 59% en mujeres tailandesas, una incidencia más alta que todas las hasta ahora publicadas. Los autores consideran que estas pacientes constituyen un grupo biológico distinto en términos de la patobiología del cáncer mamario y genética en comparación con las poblaciones del Oeste.
Nuestros resultados tampoco armonizan con la reportada inversa relación con los receptores de estrógeno y de progesterona (26 y 27), ni con la relación positiva encontrada con el Ki67 por Ioachini y col. (28).
En cambio, si hemos encontrado una tendencia a correlacionar con la presencia de oncomutación, expresada por la sobreexpresión de la proteína p53 tal como lo ha demostrado Korkolis y col. (29). Este hallazgo armoniza con el significado del pronóstico grave que se adjudica al c-erb B2 como a la sobreexpresión del p53.
El escaso periodo de seguimiento individual y el limitado número de observaciones inhibe cualquier intento de establecer algún tipo de correlato con el Indice de Nottingham.
* Instituto de Patología y Biología Molecular “Arias Stella”.
** Universidad Peruana "Cayetano Heredia".
Tabla de contenido
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