ADN DEL PVH DETECTADO EN CELULAS ESCAMOSAS ATIPICAS DE SIGNIFICADO INDETERMINADO (ASCUS) EMPLEANDO LA PCR : REPORTE DE DOS CASOS.

*Guerrero Alva Ivonne, "Campoverde Avila Gloria,
*Velazco Pena Rodolfo, *Mejia F arro Roberto.

RESUMEN

La infección por papilomavirus humano (PVH) tiene un rol carcinogénico decisivo en el desarrollo de cáncer cervical, como consecuencia su identificación tiene mayor importancia 
en lesiones de bajo grado o de citología no determinada.

Objetivo : Detectar el ADN del papilomavirus humano en células escamosas atípicas de significado indeterminado (ASCUS).

Material y métodos : El estudio del ADN/PVH se realizó extrayendo el ácido nucleico del material biológico procedente de extendidos de células exfoliadas coloreada con Papanicolaou (PAP), provenientes de dos pacientes con diagnóstico citológico de ASCUS, de acuerdo con el sistema Bethesda. Se empleó la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), aplicando cebadores genéricos y tipo específicos para siete genotipos de papilomavirus (PVH-6, 11, 16, 18, 31, 33 y 35). En ambos casos se determinó la presencia del gen de la beta-globina huamana.

Resultados : Fueron detectados oncogenes E6-E7 del ADN/PVH en las dos muestras de ASCUS, caracterizándose al tipo 6 de bajo riesgo en una de ellas y al tipo 18 de alto riesgo en la otra. Ambos genotipos identificados fueron corroborados mediante mapeo de restricción

Conclusión : Aún cuando este reporte refiere el hallazgo viral en una muestra pequeña y el manejo de las mujeres con diagnóstico de ASCUS / PVH+ está todavía en estudio, la detección molecular del tipo viral identificado en estas lesiones ASCUS con una metodología molecular altamente sensible como la PCR, debe ser considerado como un biomarcador para favorecer el seguimiento adecuado de las pacientes, especialmente cuando se trata de aquellas 
rtadoras de los tipos de PVH de alto riesgo.

ABSTRACT

The infection by human papillomavirus (HPV) has a carcinogenic decisive role in the development of cervical cancer, as consequence your identification have high importance in low grade lesions or in undeterminated citology.

Objective: to detect human papillomavirus DNA in atipics squamous cells of undeterminated significance (ASCUS).

Materials and methods: the study of HPV/DNA was performance extracting the nucleic acid of biologic material proceeding of exfoliated cells smears stained with papanicolaou (PAP), proceeding of two patient with citologic diagnostic of ASCUS, according to Bethesda System. Was applyedl the polimerase chain reation (PCR) using generic and specific primers for seven genotypes of papilomaviruses (HPV-6, 11, 16, 18, 31, 33 and 35). Was determinated the presence of human beta globin gen.

Result: were detected HPV/DNA E6-E7 oncogenes in both ASCUS samples, being characterize in one of them the type six of low risk and the type 18 of hight risk in the other. Both identificated genotypes were corroborated through restriction clivage.

Conclution: although this report refer the viral finding in a small sample and the handling of these women with HPV+/ASCUS diagnostic is still in study, the molecular detection of the viral type identified in this ASCUS lesion with a molecular methodology highly sensitivity as PCR, must be considere as an biomarker for the following adequate of the patients, specially those carrying of high risk HPV types.




INTRODUCCIÓN 
Los papilomavirus humano son virus transmitidos sexualmente, asociados con el carcinoma cervical y lesiones precursoras. Estudiados en un inicio en el contexto de su rol como un factor de riesgo para cáncer cervical y como un agente biológico capaz de modificar los programas de crecimiento y diferenciación de células epiteliales, usualmente detectado integrado al cromosoma huésped sin producción viral en carcinomas (10), cuyas infecciones crónicas se asocian a los cambios neoplásicos del cérvix, encontrándose prevalente en poblaciones generales, las cuales incluyen un número bastante representativo de mujeres citológicamente normales. Aunque la detección del PVH en estas pacientes es frecuentemente transitoria, aún no se conoce si el virus es verdaderamente eliminado, y si permanece en estado latente, cuáles son los mecanismos para vencerlas barreras biocelulares. Las dos proteínas virales, E6 y E7 expresadas consistentemente en los carcinomas cervicales funcional-mente abrogan el camino regulador del ciclo celular, incluyendo aquellos que son gobernados por la proteína supresora de tumores p53 y el producto del gen de la susceptibilidad al retinoblastoma, pRb (16). La alteración de estas vías por las proteínas virales causan inestabilidad genómica, resultando en la acumulación de anormalidades cromosomales seguidas por la expansión clonal de las células malignas, estos resultados demuestran la gran utilidad clínica de la caracterización del PVH con el análisis de las proteínas transformantes en la valoración del proceso de progresión tumoral en el cérvix uterino (17).

Estudios epidemiológicos e in vitro han demostrado que algunos de los tipos de PVH, los llamados de alto riesgo por su capacidad transformante, como los tipos 16, 18, 31 etc.

Codifican las oncoproteínas E6 / E7 influenciando el ciclo celular e inestabilidad genómica la cual se manifiesta en la expresión del fenotipo y progresión de la displasia leve a severa, y el cáncer invasivo está asociado con un incremento en la expresión de esos oncogenes virales como fue reportado por Milde-Langosch (14) quien sugiere el valor diagnóstico y pronóstico de la detección de PVH para los casos de citología no determinada - ASCUS- y de displasia leve.

La nueva terminología del Sistema Bethesda ha abierto una serie de problemas acerca de las categorías de células escamosas atípicas / anormales de significado no determinado (ASCUS) definidas como anormalidades celulares mínimas atribuibles a cambios reactivos, en los cuales se observan evidentes signos de infección por papilomavirus, que no presentan criterios suficientes para el diagnóstico de lesión escamosa intraepitelial de bajo grado pero tampoco criterios suficientes para definirlos como cambios benignos (1,2,21.) y de la lesión escamosa intraepitelial de bajo grado (L-SIL) bien definida, particularmente sobre su tratamiento y seguimiento, además es importante mencionar que una parte no despreciable de esas lesiones progresan a lesiones de alto grado, considerandose por lo tanto a estas categorías como las de mayor riesgo (6,8,13). Las anormalidades citológicas del cérvix como ASCUS son comúnmente más frecuentes que las lesiones intraepiteliales escamosas de alto grado o que el cáncer invasor, las guías de la corriente actual para el manejo de ASCUS incluyen repeticiones de un extendido para Papanicolaou a intervalos determinados, refiriéndolos a todos los pacientes para colposcopía o solicitando un test molecular para detectar PVH, pruebas que complementan las limitaciones de la citología. Varias metodologías se han desarrollado para la identificación del PVH, desde una simple serología e inmunohistoquímica hasta aquellas que han surgido a partir de la tecnología del ADN recombinante, como dot blot, hibridacion in situ, southern blot, captura del híbrido y la reacción en cadena de la polimerasa (3,4) Siendo hasta el momento la PCR, la metodología molecular más altamente sensible de fécil aplicación y con una tendencia cada vez mayor a costos accesibles.

El objetivo del estudio fue investigar la presencia del PVH, agente causal de la neoplasia cervical, en dos pacientes con citología de ASCUS utilizando la PCR para su caracterización molecular, y definir si corresponden al grupo de pacientes en riesgo para desarrollar lesión escamosa intraepitelial en relación al potencial oncogénico del genotipo viral que alberguen.

Material y Métodos 
El material estudiado correspondió a dos pacientes diagnosticadas en el servicío de citología del Hospital National "Guillermo Almenara lrigoyen" como células escamosas atípicas de significado no determinado (ASCUS). El análisis e interpretación molecular de los resultados se desarrolló en la Unidad de Biología Molecular del Centro de Investigación en Cáncer Maes-Heller del lnstituto de Enfermedades Neoplásicas.

Extracción de ADN
El material biológico para la detección del genotipo de los PVH, estuvo constituído por dos extendidos antiguos de células cervicales, fijados y coloreados con el método estándar de Papanicolaou. Ambos extendidos fueron hidratados durante 5 minutos, posteriormente con la ayuda de un bisturí se extrajo la muestra del porta lámina, la cual se depositó en un tubo estéril para ser sometida a digestión enzimática con una proteasa y un detergente, el ADN fue purificado con fenol cloroformo: alcohol isoamílico y precipitado con etanol. El ADN fue resuspendido en 50u1 de TE y cuantificado.

Reacción en cadena de la polimerasa
La mezcla de reacción para la amplificación enzimática se preparó en un volumen de 50u1 de solución con las siguientes condiciones: buffer PCR 1X, 100 pmol de cada cebador tipo específico (7 tipos virales), 400 mM dntp, 3 mM MgC12, 2.5 U amplitaq DNApol, y 5ul de ADN. La mezcla fue sometida a 40 ciclos de amplificación constituidos por 95°C durante 1 minuto, 55°C por 1 minuto y 72°C por 1 minuto. Los productos de amplificación fueron corridos sobre geles de agarosa al 4%, teniendo como patrón un marcador de peso molecular conocido, visualizado con bromuro de etidio. Se emplearon controles virales conocidos en el estudio. Las tallas de los productos amplificados considerados para los PVH fueron de 230, 89, 134, 119, 97, 132, y 186 pares de bases respectivamente para cada uno de los siete genotipos virales tipados.

Análisis de restricción
Los productos de reamplificación del control y de los casos en los cuales se observó una banda en el corrido electroforético fueron sometidos a clivaje de restricción, y el correspondiente análisis de los subproductos en geles de agarosa.

Resultados

Hemos analizado el ADN de siete tipos de papilomavirus humano en extendidos citológicos coloreados, con seis meses de antiguedad, provenientes del cérvix uterino de dos pacientes con diagnóstico de ASCUS, Ilamando la atención en ambas la diferencia de reacción de los núcleos celulares supuestamente para el mismo tipo de agresión, en el primer caso se observó un extendido celular con evidentes signos de infección viral que podían corresponder a PVH, con células superficiales e intermedias comprometidas mostrando cambios nucleares de forma y tendencia a romper la membrana y adoptar una forma geométrica, además se evidenció reactividad marcada y mayor hipercromasia que en otros cuadros comprometidos por infección con PVH (Fig 1 y Fig 2), en el segundo caso la paciente presentó una citología con compromiso de las células intermedias altas y evidentes signos de infección viral. núcleos edematizados con una mayo tendencia a adoptar formas geométricas, se observó además la cromatina intensamente coloreada. Ambas mujeres naturales de Cerro de Pasco, de 53 y 57 años de edad respectivamente, con inicio de actividad sexual a los 18 años, una de ellas con 5 gestaciones - 0 abortos y la otra con 6 gestaciones - 1 aborto, ambas negaron el uso de anticonceptivos hormonales y reportaron haber tenido sólo un compañero sexual. El ADN viral pudo ser aislado e identificado empleando la PCR en ambos casos (100%) pose a las condiciones previas del procesamiento del material biológico. La caracterización molecular del tipaje viral correspondió en el primer caso al papilomavirus humano de bajo potencial oncogénico tipo-6, y en el segundo caso se identificó al PVH tipo-18 de alto potencial oncogénico, en ambas muestras se observó claramente en el corrido electroforético una banda de 230 pb y 119 pb correspondiente al peso de cada uno de ellos respectivamente (Fig 3).

Ambos productos de amplificación fueron corroborados por el polimorfismo en la medida de los subproductos obténidos rnediante mapeo de restricción clivando con Ndel y Ddel respectivamente para los genotipos 6 y 18 detectados.

Discusión y conclusión
Durante las últimas décadas un gran número de estudios experimentales, clínicos, y epidemiológicos han coincidido en la conclusión de que hay una fuerte asociación entre la presencia de tipos específicos de PVH y el desarrollo de cáncer genital poniendo en claro el rol causal de algunos de estos tipos en la patogénesis de esta neoplasía (18). La detección del ADN de los PVH está fuertemente asociada con la presencia de un precursor del carcinoma cervical, la lesión escamosa intraepitelial, incluyéndose también en este grupo de riesgo a las citologías con diagnóstico de ASCUS como los dos casos que hemos estudiado. La utilización del extendido de Papanicolaou si bien es cierto es el test de ruta universalmente empleado para diagnósticar lesiones endocervicales, también es considerada por muchos como una prueba con grandes limitaciones por su considerable proporción de falsos negativos, y cuando son detectadas anormalidades menores como células escamosas atipicas de significado no determinado o ASCUS, generalmente las normas sugieren repeticiones de extendidos (6) para papanicolaou a intervalos específicos en los cuales puedan determinar espacios perinucleares claros y atipia nuclear moderada sobre citologias con ASCUS, considerados como predictores de la neoplasia intraepitelial cervical I (NIC-I), parametros reportados por Morin (15). Muy por el contrario la colposcopía es considerada como un procedimiento altamente sensible, pero es necesario mencionar que muchas pacientes con diagnóstico citológico de ASCUS pueden presentar hallazgos colposcópicos normales.

Se conoce que entre el 75 y 83 % de las mujeres con lesión intraepitelial de bajo grado se acompañan de algún tipo de ADN de los PVH de alto riesgo (9,11), denominados así por la capacidad de iniciar el proceso de carcinogénesis del epitelio escamoso que infectan. Mas aún aproximadamente el 55% de las pacientes con citología de ASCUS se asocian tambien a estos tipos oncogénicos, como el tipo 18 caracterizado en uno de nuestros casos, y en ellas el riesgo para desarrollar lesión escamosa intraepitelial o cáncer es mayor que en las lesiones ASCUS PVH negativo, de ahí la importancia que tiene el identificar el tipo viral en estas lesiones de citología no determinada. Es necesario recordar que los PVH pueden permanecer en el epitelio que parasitan entre cinco y treinta años o mas sin dar evidencia de alteración clínica ni citológica, evento qlue guarda una estrecha relación con la edad temprana en el inicio de la actividad sexual.

Como es el caso de las dos pacientes que reportamos, quienes permanecieron probablemente durante muchos años como portadoras asintomáticas del estado físico episomal de latencia viral. Si bien es cierto los PVH de alto riesgo son agentes causales iniciadores y/o promotores de la neoplasia genital, durante los múltiples eventos del proceso de carcinogénesis su activación puede relacionarse a factores genéticos que faciliten su integración al genoma celular y por ende provocar inestabilidad genómica del huesped manifestada por la activación o inactivación de genes celulares (19), o puede estar relacionada a otros cofactores como el nutritional, inmunológico, o el número de embarazos, siendo en este caso la progesterona responsable del efecto activador de los promotores de los oncogenes virales E6-E7 ubicados en la región reguladora no codificante del genoma viral, efecto acumulativo que puede haber influenciado en el tiempo en nuestras pacientes.

Los papilomavirus en general presentan diferentes patrones de distribución con respecto a su relación con las neoplasias cervicales intraepiteliales y los carcinomas, generalmente los tipos de PVH muestran una mayor prevalencia en lesiones intraepiteliales escamosas de alto grado qlue en lesiones intraepiteliales escamosas de bajo grado, sin embargo Hwang (7) reportó como excepción al PVH-18 de alto riesgo detectado con mayor frecuencia en lesiones de bajo grado, sin embargo, con una tendencia a tener posteriomente un peor estadío clínico. La identificación del PVH-18 en una de nuestras pacientes con ASCUS determina posiblemente un significado clínico-patológico diferente, y una seropositividad IgA e IgG no significativa a diferencia de la que caracteriza a las portadoras del tipo 16 (20). En esta paciente podemos sugerir el estudio molecular del gen E2 PVH-18 y de sus transcriptos ARNm E2 PVH-18 los que son constantemente expresados en la presencia del genoma viral intacto en casos de encontrarse en estado físico episomal (en ASCUS), la ruptura de este gen nos indicaría integración al genoma celular e inicio del proceso carcinogénico, como consecuencia activación de sus oncogenes, pudiendo la proteína E6 estimular la degradación de Bak un miembro pro-apoptótico de la familia Bcl-2, como demostró Thomas (22) ligando in vitro la proteina E6 PVH18 a Bak y estimulando su degradación in vivo, reduciendo la apoptésis inducida por Bak lo cual contribuiría al potential oncogénico del PVH-18 .

El papilomavirus humano tipo 6 considerado de bajo riesgo por su incapacidad de transformar células in vitro, caracterizado en una de las pacientes ASCUS estudiada, se relaciona con el desarrollo de lesiones benignas condilomatosas (12), esto no descarta de ninguna manera en esta mujer la posibilidad de una posterior reinfección con algún tipo de PVH de alto riesgo, aunque por la edad de la paciente las condiciones biocelulares del epitelio cervical no serán las adecuadas produciendose posiblemente infección abortiva.

Observando nuestros resultados, los cuales nos han permitido seleccionar a una de las pacientes para ser considerada en el grupo de alto riesgo, es importante mencionar las expresiones claras de Cox (5) sobre la subjetividad de los métodos citológicos los cuales muchas veces pueden contribuir a un enpantanamiento de la colposcopía, sobre diagnóstico y como consecuencia sobretratamiento, a todo esto las pruebas de ADN, especialmente la PCR altamente sensible y específica, ofrecen por el contrario la objetividad requerida para clarificar dificultades en el manejo y seguimiento de las pacientes con diagnóstico citológico de ASCUS (y lesion intraepitelial de bajo grado) asociado a PVH de alto riesgo, el cual debería ser potencialmente considerado en los programas de screening de cancer cervical para disminuir la incidencia de cancer de cuello uterino. El estudio molecular del ADN del PVH constituye ahora el trío de marcadores "Prueba de ADN/PVH, AgSCCTA4 y Microangiogénesis" que integran las nuevas posibilidades de diagnóstico y selección de lesiones precancerosas como ASCUS.

Nuestro hallazgo nos permite afirmar además la posibilidad de recuperar material de células ectoendocendocervicales procesadas, sometidas a coloración previa de papanicolaou, para obtener ADN viral de calidad que permita como en los casos estudiados la caracterización viral e identificación de la mujer en alto riesgo de desarrollar lesiones cervicales precancerosa y cancerosa, detectando el tipo viral mediante la PCR como herramienta de diagnóstico, sin embargo es necesario realizar un estudio molecular de correlación en un grupo mayor de pacientes con ASCUS en material fresco y en el extendido coloreado de la misma mujer para determinar según los resultados la pérdida o conservación de la carga viral post manipulación como son el tiempo inicial de exposición al ambiente y al fijador, calidad de marca y preparación del fijador y de los colorantes, ph. etc. factores que pueden influir negativamente en el material biológico para la extracción de ADN y que definitivarnente varian en cada laboratorio.

En conclusión la identificación del tipo viral de alto riesgo en mujeres con diagnóstico citológico de ASCUS puede ser considerado como un biomarcador molecular que contribuya con la identificación de una de las llaves de la oncogénesis para la selección temprana de una displasía cervical y el seguimiento adecuado de aquellas mujeres quienes tienen una lesión escamosa intraepitelial implicita dada por el potencial oncogénico de la carga viral que albergan.

  ver referencia bibliográfica

Correspondencia:
Dra.lvonne Guerrero Alva,
Centro de Investigación en Cáncer Maes-Heller,
Instituto de Enfermedades Neoplásicas "Eduardo Cáceres Graziani". Av.Angamos Este N°2520
Telefax:51 I-4483162
Teléfonos: 511-4483162 , 511-4499137 Anexo: 302 
e-mail: iguerrero@inen.sld.pc 

*Unidad de Biología Molecular- Centro de Investigación en Cancer Maes-Heller del  Instituto de Enfermedades Neoplasicas "Dr.Eduardo Caceres Graziani".

°Servicio de Citopatología y Citogenética del Hospital Nacional "Guillermo Almenara Irigoyen".

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