UNA ALTERNATIVA PARA LA DETECCIÓN DE Vibrío cholerae EN AGUAS Talledo M*, Gutiérrez S*, Merino F*
RESUMEN: Se ha, desarrollado un método que podría ser usado como alternativa en la detección indirecta de Vibrio cholarae en aguas, mediante la utilización de vibriófagos aislados de aguas marinas someras, relacionadas con desembocaduras de dos ríos y un colector de aguas servidas. Para el efecto, se han tenido en cuenta las características de crecimiento de este microorganismo, así como la especificidad de sus fagos. Se ha conseguido calificar y cuantificar la presencia del vibrión colérico en otros lugares muestreados. Palabras Clave: vibriófagos, aguas. SUMMARY: We have developed a method that could be used as an alternative for indirect detection Vibrio cholerae from water through the use of vibriophages isolated from shallow marine water relating to two river mouths and to a sewage pipe. For this, we have considered the growing chacteristics of this microorganism as well as its phage specificity.We have qualified and quantified the presence of the choleric vibrion in the sampled places. Key Words: víbriophaces. water.
Introducción A raíz de la epidemia de cólera que afectó al Perú en1991, y que con gran rapidez alcanzó a otros países de la región, como Ecuador, Colombia, Chile y Brasil, se iniciaron una serie de estudios en nuestro país sobre el microorganismo causante de esta enfermedad. El vibrión colérico fue aislado de diversas fuentes, entre las que se incluyen el río Rímac y el colector de La Chira, en muy altas concentraciones (1). La detección de esta bacteria ha seguido en todos los casos la metodología convencional (2), que presenta como prin-cipal inconveniente el largo tiempo de procesamiento. Vibrio cholerae no tiene al agua de mar como el medio más adecuado para su supervivencia debido a las condiciones fisicoquímicas allí existentes; no obstante, puede permanecer viable durante cierto tiempo en tales condiciones (3,4). Por otro lado, existe evidencia que indica que los fagos presentan también persisten-cia en ambientes acuáticos (5). En nuestro medio no se ha tomado en cuenta el uso de bacteriófagos para evidenciar la presencia del vibrión. A pesar que su empleo como agente terapéutico fue desechado hace mucho por su ineficacia (6), actualmente son emplea-dos como una herramienta sumamente útil en el estu-dio de la fisiología, genética y ecología de muchos microorganismos (7,8,9), algunos de ellos de importancia industrial (10). De este modo, es válido suponer que en sectores mari-nos relacionados a desembocaduras de ríos, por la inevitable contribución humana, es posible hallar a la bacteria del cólera y también a los fagos que la afectan, así como en aguas que reciben descarga de colectores. Este trabajo ha buscado desarrollar una metodología que permita la detección indirecta de Vibrio cholerae a través de sus bacteriófagos en los ambientes antes mencionados, como un primer paso al estudio de estos virus y su utilidad como indicadores de contamina-ción colérica.
Materiales y Métodos La cepa utilizada fue Vibriocholerae PACINI 1854,411 Serotipo Inaba. Para determinar el tiempo de incubación necesario para que el vibrión alcance la fase exponencial de crecimiento se estudió su cinética de crecimiento. Las muestras de agua de mar fueron obtenidas de zonas someras de tres puntos de la costa de Lima: playa La Chira, en el sector adyacente al colector de aguas servidas que existe en el lugar; desembocadura del río Chillón y desembocadura del río Rímac. En cada una de estas zonas se tomaron cinco muestras equidistantes de 1000 ml cada una. Estas muestras fueron centrifugadas y filtradas en membrana de nitrocelulosa de porosidad 0.45u. Se llevaron a cabo dos tipos de análisis de las muestras: análisis cualitativo o lisis en medio líquido (agua peptonada alcalina pH=8.6) y análisis cuantitativo o lisis en medio sólido (agar tripticasa soya), conocido también como método de la bicapa de agar, según la técnica de Adams (1959). Se tomó en cuenta la multiplicidad de infección me-diante la aplicación de volúmenes. iguales de inóculo (0.1 ml y 1 ml). Asimismo, se emplearon tiempos de incubación de 2,4 y 6 horas.
Resultados Los resultados de la evaluación de la cinética de cre-cimiento de Víbrio cholerae fueron: para la velocidad específica de crecimiento (f) se obtuvo un valor de 3.45h-l, mientras que el tiempo de duplicación (Td) se encontró en 12 min. Se ha graficado la cinética e crecimiento teniendo en cuenta el número de células. De los tiempos de incubación empleados, sólo en la incubación por 2 horas se obtuvieron resultados ópti-mos, como era de esperar según el análisis de la cinética de crecimiento. El uso de dos volúmenes de inóculo de muestra ayudó a determinar aquél en que la lectura de la placas de lisis se ve facilitada. Las placas de lisis obtenidas se observaron como zonas circulares, claras y limpias de diámetros distintos. Se pudieron apreciar placas de lisis confluentes, aunque la mayoría aparecieron perfectamente individualizadas (Fotografía l). En las placas de mayor diámetro se pudo apreciar que en dirección al centro de la placa, va disminuyendo el cultivo bacteriano hasta desaparecer por completo (Fotografía 2). En cuanto al análisis cualitativo, de tres muestreos llevados a cabo en playa La Chira, sólo uno, el tercero, dio resultado positivo. Mientras tanto, fueron positi-vas las muestras de la desembocadura del río Chillón y las de la desembocadura del río Rímac. El análisis cuantitativo arrojó negativo sólo en las muestras de playa La Chira, llegando a determinar la concentración de fagos en las demás zonas muestreadas (Tabla l). Al comparar los resultados del análisis cuantitativo de las muestras de las desembocaduras del río Chillón y río Rímac (1.6 x 10'y 3.64 x 101 ufp/ 100 ml)., se observó una concentración de fagos menor en la primera de ellas, como se puede comprobar en el Gráfico 2
Discusión Debido a que el método empleado enfrenta a un culti-vo bacteriano con una población inicialmente desco-nocida de fagos, es necesario tomar en cuenta que la población bacteriana debe hallarse en plena fase exponencial de crecimiento para evidenciar satisfacto-riamente la lisis; por ello se estudió la cinética de crecimiento del vibrión colérico, empleando la técnica usual (11,12). En este aspecto, hay que indicar que a la vista de los resultados obtenidos, no se puede tomar sólo la densidad óptica como una medida confiable al momento de evaluar el crecimiento de este microorganismo. La posibilidad del hallazgo de fagos en aguas estuarinas se deduce del hecho de que el vibrión ha llegado allí a través de aguas residuales (13) y su utilización corno índice de contaminación fecal ha sido propuesto por Aguilar para el caso de E. coli (14). La supervivencia relativa de los mismos en este medio es una caracterís-tica de los virus comprobada con anterioridad (4), así como en el caso de la bacteria del cólera. El tratamiento previo de las muestras, es decir su centrifugación y filtración en membrana de nitro-celulosa, son pasos obligados para la eliminación de partículas extrañas que conduzcan a resultados erró-neos, puesto que no hay que perder de vista que estas muestras provienen de zonas muy contaminadas, principalmente por influencia humana. La sola determinación de la calidad de las aguas en relación a la presencia de vibriófagos mediante el análisis cualitativo representa ya de por sí un impor-tante paso en la detección indirecta de este micro-organismo; sin embargo, su cuantificación es igual-mente importante, sobre todo desde un punto de vista epidenúológico. Este análisis cuantitativo, conocido como bicapa de agar (15), no sólo abre la posibilidad del estudio de los fagos en sí, sino que también permite un acercamiento al estudio de la ecología de sus hospe-deros (9,16). Hay otros elementos que hay que considerar en cuanto la detección en medio sólido. El hecho de que se hayan obtenido mejores resultados con un inóculo de 0.1 ml. se debe probablemente a que un volumen mayor de inóculo genere un exceso de unidades formadoras de placas, que tendrían incidencia directa en la desorganización de la membrana del vibrión y conducirían a una lectura errónea o dificultosa. Del mismo modo, las diferencias en el diámetro de las lacas de lisis abrirían la posibilidad de que los fagos presentes en las muestras colectadas no sean todos iguales, aunque sí específicos al microorganismo en cuestión. Los resultados obtenidos han arrojado una presencia mucho mayor de fagos en la desembocadura del río Rímac que en el río Chillón, lo que se ve explicado por la presencia en la zona adyacente a aquél lugar de un colector de aguas servidas que arroja su descarga al mar y que contribuye a su mayor polución. El presente trabajo abre la posibilidad de contar con un método alternativo de detección indirecta de Vibrio cholerae que es de fácil manejo, con una alta especificidad bajo costo.
Referencias 1. World Health Organization. Cholera in Peru. Weekly epid. record 1991, 66:141-148. 2. Delgado A. El cólera. Unidad de Epidemiología Hospital Dos de Mayo. Departamento de Medici-na de la UNMSM. Lima, 1991. 3. Barua D. Supervivencia del vibrión colérico en los alimentos, el agua y los fomites. En Principios y Práctica de la Lucha contra el Cólera. O.M.S. Ginebra.1970, pp. 29-31. 4. Pérez-Rosas N. y Hazen T. Insitu survival of Vibrio cholerae and Escherichia coli in a tropical rain forest watershed. App. and Environm. Microbiol. 1989, 55:495-499. 5. Yates, M., C. Gerba y L.M. Kelley. Lirus persistence in groundwater. App. and Environm. Microbiol. 1985,49:778-781. 6. Mukeqee S. Bacteriófagos. En Principios y Práctica de la Lucha contra el Cólera. O.M.S. Ginebra.1970 pp. 39-45. 7. Guidolin A. Genetics of Vibrio choleme and its bacteriophages. Microbiol. Reviews. 1987,51:285--298.8. 8. Ogg J. T. Timme, y M. Alemohammad. A General transduction of Vibrio cholerae. Infect. and Immunity. 1981,31:737-741. 9. Primrose S, Seeley N, K. Logan y Nicolson J. Methods for studying aquatic bacteriophages ecology. App. and Environm. Microbiol. 1982, 43:694-701. 10. Ward T,E, FF, Rowland, ML. Bruhn, DF Watkins CS, Roberto. Studies on a bacteriophage which infects members of the genus Acidiphilium. Biohydrometallurgy. 1989, pp. 159-170. 11. Sharp MS. Laboratory instructions in biology of miroorganisms. C.V. Mosby, Co., NewYork, 1969. 12. Sokach J,R. Bacterial physiology and metabolism. Academic Press, New York, 1969. 13. Wood P,C. Manual de higiene de los mariscos. Ed. Acribia, Zaragoza, 1977. 14. Aguilar M, y López C. Determinación del colifago en agua de mar como un indicador de contamina-ción fecal. VIII Congreso Peruano de Microbiología y Parasitología. Lima, 1990. 15. Adams M. Bacteriophages. Interscience Publishers, Inc. New York, 1959. 16. Wiggins B, Alexander M. Minimum bacterial density for bacteriophage replication: implications for significance of bacteriophages in natural ecosystems. App. and Environm. Microbiol. 1988, 49:19-23 |
