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Método: Se estudió los monocitos de 260 pacientes con tuberculosis pulmonar, de 54 con tuberculosis pleural, de 24 con tuberculosis miliar y de 253 controles sanos. Se separó los leucocitos por centrifugación con Histopaque, se les incubó con suero AB para hacer que se adhieran los monocitos, a los que se les sometió a inducción con LPS por 18 horas, determinando por bioensayos la producción de
TNF-a. Se extrajo el DNA de los monocitos, al que se sometió a PCR con primers específicos para el locus TNF-a(-308), y se tipificaron genéticamente mediante polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) los polimorfismos genéticos de TNF-a(-308) con la enzima de restricción Ncol.
Resultados: Los monocitos in vitro espontáneamente produjeron 49.6±48.6, 110.2±95.7, 26.6±1.8 y 74.9±54.3 pg de
TNF-a en controles sanos, pacientes con TB pulmonar, pleural y miliar respectivamente. (p<0.05) Cuando se les estimuló con LPS a las 18 horas la producción por los monocitos fue de 3380.5±882.7, 5854.1±3941. 1566.9±470.5, 2218.1 ±789.2 pg de
TNF-a en controles sanos, pacientes con TB pulmonar, pleural y miliar respectivamente. (p<0.01) No se presentó asociación alguna entre susceptibilidad a tuberculosis y polimorfismo en la región-308 de
TNF-a, siendo el genotipo AA raro en la población peruana y la frecuencia de los alelos 1 y 2 para el polimorfismo
-308 de TNF-a de 0.94 y 0,06 respectivamente. La distribución de los genotipos de
-308 de TNF-a se ajustó a la ley de Hardy-Weinberg. (p>0.05)
Conclusiones: Se ha encontrado una expresión diferenciada de TNF-a según el tipo clínico de TB, siendo más alta en TB pulmonar, que se incrementa significativamente por LPS y que no estuvo mediada por la presencia de la mutación en la posición
-308 del promotor del gen TNF-a.
Incidencia y prevalencia de tuberculosis
La tuberculosis es aún la enfermedad infecciosa que causa mayor número de muertes. Un tercio de la población mundial (1,722 millones de personas) ya ha sido infectada y estará en riesgo de enfermar durante el resto de su vida. Este riesgo se incrementa varias veces si además tiene una infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). (1) Para el decenio
1990-1999 se estimó una incidencia acumulada de 88 millones de nuevos casos de tuberculosis y 30 millones de muertes, de los cuales respectivamente 8 millones y 2.9 millones fueron atribuidos a la coinfección con VIH.(2) En 1997 hubo 16.2 millones de personas con enfermedad tuberculosa, de las cuales 7.96 millones fueron casos nuevos, 3.52 millones casos pulmonares BK (+), y 1.87 millones murieron por la enfermedad. La prevalencia mundial de infección por M. tuberculosis se estimó en 32%.(3)
Para 1999 en el Perú la tasa anual de morbilidad por tuberculosis fue de 165.4/100,000 habitantes y la de incidencia de 141.4/100 000 habitantes.(4) La distribución de los tipos de tuberculosis en 4 483 pacientes atendidos entre
1980- 1990 por el Programa de Control de Tuberculosis del Hospital Nacional Cayetano Heredia (HNCH) y algunos de sus Centros Periféricos fue: tuberculosis pulmonar 90%, tuberculosis no pulmonar 7,9%, y tuberculosis de ambas localizaciones 2,1%. La distribución de la tuberculosis no pulmonar fue la siguiente: tuberculosis pleural 49,4%, tuberculosis ganglionar 18,8%, tuberculosis miliar 13,2%, y tuberculosis génito-urinaria, meníngea, digestiva, peritoneal y otras en menor porcentaje.(5)
Factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a)
La capacidad de activación del macrófago es un evento crucial en la inmunidad antimicrobiana. El estímulo microbiano desencadena una cascada de eventos geninductores. El macrófago actúa en la inflamación, en la eliminación del agente agresor y en la inducción de células T de memoria contra la reinvasión.
TNF-a participa en esta vía de activación.(6)
Takashima(7) demostró que in vitro los monocitos de pacientes tuberculosos liberaban mayor cantidad de
TNF-a en respuesta a LPS que los de los controles sanos. Sin embargo, los monocitos de pacientes con tuberculosis refractaria crónica producían, en comparación con los pacientes con tuberculosis de diagnóstico reciente, bajas cantidades de esta citoquina. Law(8) observó que hay una mayor liberación espontánea por macrófagos alveolares de esta citoquina en pacientes con TB activa que en controles sano PPD+, y que los macrófagos de pacientes con TB miliar liberaban menos
TNF-a que los controles. Este último hallazgo en particular, explicaría por qué en la TB diseminada se presentan granulomas diminutos con limitada actividad micobactericida. La formación de granulomas es un evento crítico en la inmunidad antimicobacteriana, en el cual el
TNF-a producido por los macrófagos cumple roles claes. Esto ha sido demostrado recientemente por Wallis y Ellner,(9) quienes al administrar anticuerpos neutralizantes de
TNF-a a ratones resistentes a BCG encontraron que se inhibía la formación de granulomas micobactericidas, resultando una infección invasiva y letal por BCG. Por otro lado, Roach(10) observó, al tratar a ratones infectados con M. bovis (BCG) con
TNF-a o un péptido derivado de esta citoquina, que se alteraba el número y la composición de los granulomas, asociándose este cambio con una disminución de la carga bacteriana.
TNF-a desempeña un rol importante en la enfermedad micobacteriana como la citoquina proinflamatoria involucrada en la preparación y activación de los macrófagos. El locus de
TNF-a parece influenciar la susceptibilidad a lepra.(11, 12) Sin embargo, en un conjunto de pedigríes de 37 multicasos de TB, los estudios de ligamiento y asociación fallaron en demostrar un efecto de
TNF-a en la susceptibilidad a TB.(13, 14)
Law encontró relación entre cuadros clínicos de enfermedad tuberculosa y la cantidad de
TNF-a producida. Observó una menor producción de TNF-a en enfermedad miliar comparada con otras formas clínicas de la enfermedad. Asimismo, los pacientes con mayor compromiso pulmonar presentaron mayores niveles de esta citoquina.(15)
TNF-a es producido principalmente por los macrófagos y es un mediador crítico de la defensa del hospedero contra infecciones. M. tuberculosis estimula en macrófagos la producción de
TNF-a tanto a nivel de transcripción como al de la síntesis de proteínas.(16)
Este hallazgo indica que hay variación en la respuesta inmune entre las formas clínicas diseminadas y localizadas, además sugiere que los factores del huésped intervienen en la expresión del fenotipo de la enfermedad.
TNF-a es el evento clave para la activación de los macrófagos. Un estímulo como el lipoarabinomanan (LAM), actuando sólo o en conjunto con las células asesinas naturales (NK) o con el
lFN-y, puede desencadenar una cascada de eventos gene-inductores, que incluyen la activación del
NF-kB, la regulación de la síntesis de mRNA/proteína de KC (un agente quimiotáctico de leucocitos polimorfonucleares),
TNF-X, lL-1p, ¡NOS y el complejo mayor de histocompatibilidad clase II (MHC).(6) Una compleja serie de interacciones entre linfocitos T, macrófagos y el microorganismo, modulado por factores exógenos (coinfección, estado nutricional, medicamentos) y factores genéticos, parecen determinar si un paciente presentara un cuadro de tuberculosis localizada o de diseminación miliar. (17) La sincronización de la producción de
IL-4 y IFN-y es crítica en el desarrollo de la respuesta inmune celular hacia las vías Thl ó Th2, donde una respuesta celular de tipo Thl está asociada con la resolución de la infección. El grupo (cluster) de genes Th2 en el cromosoma 5 contiene los genes:
IL4-103-1L5-IRF1--CSF2-1L3-10-CD14-CSFIR. La región está implicada en el desarrollo de la lesión tardía para Leishmanía major en ratones(18) y fue la única región identificada en el primer escaneo del genoma para una enfermedad parasitaria: Schistosoma mansoni.(19) Muchos estudios han mostrado que esta región controla la producción de IgE total. (17) Aunque, a la fecha, esta región no ha mostrado ligamiento o asociación con TB pulmonar, parece tener algún control sobre respuestas inmunes contra antígenos mico bacteria nos. (20, 21)
El gen TNF-a se encuentra dentro del MHC entre el HILA-DIR y HI-A-A
(Figura 1) y por hibridación in situ fue asignado a la posición 6p21.3. El gen consta de
-3 Kbp y presenta 4 exones. En la región promotora presenta secuencias consenso para factores de transcripción como Ap-1, Ap-2, CRE, Egr-1, Ets, kp1, kp2, kp3, LITAF, Sp-1.(52)
En este gen se han encontrado varios sitios polimárficos.(23)
(Figura 2) Las mutaciones de tipo transición en las posiciones
-308 y -376 (cambio de G por A) alteran la tasa de expresión del gen. En ensayos in vítro se ha demostrado que el gen coin el alelo A presenta una mayor tasa de expresión. (24.25)
El gen codifica una proteína de 230 aminoácidos, que es clivada proteolíticamente para dar un producto maduro de 157 aminoácidos. Esta citoquina es excretada por todos los tipos d e macrófagos cuando son expuestos a micoorganismos o a sus productos.(26) Estos agentes extraños se unen a los recepteores TLR2 de los macrófagos y esta interacción genera una señal intracelular que involucra la modificación covalente reversible por fosforilación o defosforilación de varias proteínas que finalmente activan el factor de transcripción
NF-kp, que es transiocado al núcleo donde al interactuar con sus secuencias consenso aumentan la tasa de transcripción M gen.(27) Esto permite que haya más ARNm disponible para ser utilizado en el proceso de traducción y en consecuencia una mayor cantidad de la proteína que será excretada. Todos los eventos ocurren rápidamente. Por ejemplo, se ha encontrado que hay un incremento en la concentración de ARNm a los pocos minutos que las células son expuestas a LPS y entre los 20 y 30 minutos ya se puede detectar la proteína excretada.(26)
Esta citoquina tiene efectos pleiotrápicos, porque virtualmente todas las células de los tejidos somáticos, excepto los eritrocitos, poseen receptores para esta citoquina.(26) la interacción con sus receptores genera una serie de señales intracelulares que resultan en la expresión dé genes que codifican para ¡NOS que genera óxido nítrico, la formación de 0 2 y H 202
IL-8 y 11-1 B que son factores quimiotácticos que atraen células inflamatorias al tracto respiratorio inferior. También estimula la expresión de moléculas de adhesión como
ICAM-1 sobre los macrófagos, contribuyendo a la adhesión homotípica o heterotípica de las células, la diferenciación de los macrófagos y a un incremento en la fagocitosis. También contribuye a la activación de los macrófagos e inhibición del crecimiento de micobacterias, a la estimulación de procesos globales tales como apoptosis y la formación de granulomas micobactericidas. Sin embargo,
TNF-a puede contribuir a la necrosis tisular y la formación de cavitaciones y la caquexia frecuentemente observada en los pacientes con TB.
Objetivo general
- Conocer si existen diferencias en la producción in vitro de TNF-a entre los macrófagos de pacientes con diversas formas clínicas de TB (tuberculosis pulmonar, tuberculosis pleural y tuberculosis miliar) y los de controles sanos.
- Ver si luego de ser estimulados los macrófagos con LPS la producción in vitro de
TNF-a por los macrófagos varía.
Determinar si existe asociación de la susceptibilidad genética a tuberculosis con el polimorfismo
-308 de TNF-a en la población de estudio, si es que previamente existe expresión diferencial de la misma.
Objetivos específicos
- Determinar las frecuencias de los alelos y genotipos de -308 de TNF-a
- Determinar si la distribución de los genotipos de -308 de TNF-u. se ajustan a la Ley de Hardy-Weinberg.
- Determinar si la susceptibilidad genética a tuberculosis está asociada con los polimorfismos en
-308 de TNF-a.
Reactivos y soluciones utilizadas
- Solución de lisis de eritrocitos
NH 4 CI al 0.05%, NaHCO 31 0.1 M pH 8.0
- PBS (Buffer Fosfato Salino)
137 mM NaCI; 2.7 mM KCI; 4.3 mM Na 2 HPO 4; 1.4 mm KH 2 PO 4' pH 7.3
- TE (Buffer Tris-EDTA)
10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8.0
- Buffer de muestra
0.5 X TBE, 0.002% azul bromoenol, 70% sucrosa
- 0.5 X TBE (Buffer Tris-Bórico-EDTA)
89 mM Tris, 89 mM ácido bórico, 2 mM EDTA, pH 8.0
Pacientes y controles
Los casos incluidos en el estudio fueron pacientes mayores de 15 años diagnosticados de tuberculosis pulmonar, pleural o miliar en el Servicio de Neumología del Hospital Nacional Cayetano Heredia (HNCH) y en sus centros periféricos (Sub-Región de Salud
III-Lima Norte), que aceptaran voluntariamente participar del estudio. Todos debían dar su consentimiento informado firmando el mismo antes de ingresar al estudio. Se elaboró una ficha clínica precodificada para la recolección de la información.
Las definiciones de casos de tuberculosis fueron las siguientes:
Tuberculosis pulmonar:
- Baciloscopía positiva (BK(+": Es el paciente con al menos una baciloscopía de esputo positiva.
- Cultivo positivo (+): Es el paciente con baciloscopías negativas y sólo cultivo positivo para M. tuberculosis.
Tuberculosis pleural: Paciente que presenta enfermedad tuberculosa en la pleura caracterizada en la biopsia como una pleuritis crónica granulomatosa con o sin necrosis caseosa, con o sin baciloscopía, cultivo de tejido o de líquido pleural positivos.
Tuberculosis miliar: Es el paciente que presenta enfermedad tuberculosa diseminada caracterizada por compromiso pulmonar micronodular, en quien el diagnóstico es clínico-radiológicoepidemiológico.
Tuberculosis extrapulmonar: Para el presente trabajo se consideró a los casos de tuberculosis que pudiendo tenerla en el pulmón se observó que existía el mismo fuera de él. La suma de los pacientes con tuberculosis pleural y miliar.
Se excluyeron a los casos que presentaron alguna de las siguientes condiciones:
Tuberculosis multidrogo-resistente.
Infección VIH.
Infección por el Virus de la Hepatitis B (VHB).
Corticoterapia crónica.
Presencia de alguna condición clínica que produzca inmunodeficiencia (diabetes mellitus, enfermedades mieloproliferativas, desnutrición severa, etc.).
Los controles fueron varones saludables mayores de 15 años, de similar condición socioeconómica y área geográfica que los casos, que se presentaron como donantes de sangre al Hospital Nacional Cayetano Heredia (HNCH). Fueron escogidos en forma secuencial y no relacionada.
Se excluyeron a los controles que presentaron alguna de las siguientes condiciones:
Historia previa de enfermedad tuberculosa
VIH (+)
VHB (+)
Para determinar la producción diferencial de TNF-a se seleccionó en total a 12 personas: 3 controles, 3 con TB pulmonar, 3 con TB pleural y 3 con TB miliar.
Para esta parte del estudio sólo se incluyó a personas que habían completado con éxito el tratamiento antituberculoso por lo menos un año atrás y que estaban totalmente sanos. En ellos se tuvo la precaución de verificar la ausencia de enfermedad activa por un nuemólogo.
Procesamiento de la muestra para el estudio de TNF-a
Varias etapas de procesamiento de la muestra fueron realizadas en una cabina de flujo laminar clase 11 tipo B SC4TXSB SterilchemGARD.
- Obtención de las muestras de sangre, separación de leucocitos y adherencia de monocitos Se obtuvo 10 mi de sangre por punción venosa en las 12 personas seleccionadas. Los tubos con sangre anticoaquiada fueron llevados al laboratorio en un termo a 4 OC, donde fueron procesados.
Los leucocitos fueron separados de la sangre total por centrifugación con Histopaque y lavados con solución salina balanceada de Hanks atemperado a 370C por 2 veces. Luego los monocitos fueron adheridos en placas de cultivos siguiendo las instrucciones de Biddison.(28)
- Inducción de los monocitos con LIPS para la producción de TNF-a
Los monocitos adheridos fueron incubados con 2 mi de medio RPMI 1640 a 37 OC y 5% de CO 2 por 30 minutos. Cumplido el tiempo se tomó y almacenó a
-20 OC en alícuotas de 200 W de medio de cultivo. En las tres últimas placas se añadió LPS a una concentración final de 10ug/ml. Al cabo de 2h, 6h, 12h y 18h se colectó 200 ul de medio de las placas control e inducidas con LPS. Las alícuotas colectadas fueron guardadas a
-20 ºC, las que posteriormente fueron usadas para cuantificar el TNF-a en cada caso.
- Dosaje de TNF-a
La cuantificación M TNF-a presente en los medios de cultivo obtenidos de las placas control e inducidas con LPS, fueron determinados en base a las fórmulas de la curva estándar realizada con concentraciones conocidas de TNF-(x en cada bioensayo. El bioensayo se hizo con fibroblastos de
ratón de la línea celular L929 de acuerdo a las instrucciones de Evans.(29)
(Figura 3)
Procesamiento de la muestra para el estudio de los polimorfismos genéticos
Al observar una producción diferencial de TNF-u. según el tipo de TB se decidió realizar un estudio de asociación mediante la aproximación de genes candidatos. Para ello, se estudió en total a 337 pacientes con una edad promedio de 29.49
+/- 10.58 años. 260 tuvieron diagnóstico de tuberculosis pulmonar BK positivo, 54 de tuberculosis pleural y 23 de tuberculosis miliar. La edad promedio de cada grupo fue 29.4
+/- 1113, 28.9 +/- 11.1 y 31.6 +/- 11.7 años respectivamente. El 100% de los casos pulmonares, el 98.15% de los pleurales y el 67% de los miliares fueron de sexo masculino. Se excluyó a 7 pacientes por ser reactivos a Hepatitis B y/o VIH: tres fueron positivos a VIH (T13 pulmonar), tres a
V1-113 (T13 pulmonar) y uno positivo a ambos (T13 pleural).
Los controles fueron varones saludables mayores de 15 años, de similar condición socioeconómica y área geográfica que los casos, que se presentaron como donantes de sangre al Hospital Nacional Cayetano Heredia (HNCH). Fueron escogidos en forma secuencia¡ y no relacionada. Se incorporaron al estudio un total de 253
controles varones, siendo la edad promedio 31.52
+/- 8.92 años. (Figura 4)
- Obtención de la muestra.
Fueron extraídos 7 mi de sangre venosa tanto a los pacientes como a los controles, siendo colocados de inmediato dentro de un tubo con 0.5% ElDTA como anticoaquiante, el que fue mantenido a 40C para su transporte.
- Obtención de leucocitos y purificación del ADN
La obtención de los leucocitos y la purificación del ADN se realizó de la siguiente manera:
- Los tubos con muestras de sangre se centrifugaron a 6 000 rpm por 5 minutos. (Se separó 1.5 ml de plasma para los análisis serológicos).
- Utilizando una micropipeta de punta roma se retiró 400 pd de leucocitos sedimentados sobre los eritrocitos y se colocaron en un microtubo de 1.5 ml.
- Se agregó 1 ml de solución de lisis de eritrocitos, incubándose a 37 I>C por 15 minutos.
- Posteriormente se centrifugaron a 6000 rpm por 2 minutos, repitiéndose este procedimiento hasta obtener solamente leucocitos en el sedimento.
- Finalmente los leucocitos se resuspendieron en PBS en un volumen final de 200 pti.
- Mediante el kit de preparación de ADN QIAGEN se purificó el ADN, de acuerdo a las instrucciones del fabricante, obteniéndose ADN en buffer TE en dos eluciones de 200 pd cada uno que fueron colocadas en microtubos de 1.5 ml.
Se almacenó el ADN a 4 ºC.
Cuantificación del ADN
1ul de muestra de ADN mezclada con 2 ul de buffer de muestra utilizando como marcador de peso molecular 5 ul ADN de fago Lambda (50 ul) digerido con Hind III fueron sembrados sobre pocillos de 0.8% agarosa en 0.5X TBE. Luego fueron corridas a 50 V por 45 minutos. Finalizada la electroforesis, los geles fueron teñidos con bromuro de etidio (0.5 ug/ml) durante 10 min, y visualizados en un transiluminador de luz LIV (Transilluminator UVP, Modelo
TM-20, U.S.A.) para cuantificar las bandas de ADN de las muestras por comparación en intensidad con las bandas del marcador de peso molecular.
- Primers de -308 de TNF-a
Para el polimorfismo de -308 de TNF-a los primers utilizados fueron Forward Primer 5'AGG CAA TAG GTT TTG AGG GCC AT Y y Reverse Primer 5'TCC TCC CTG CTC CGA TTCCG Y.
- Amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de
-308 de TNF-a
La región -308 de TNF-a fue amplificada por PCR utilizando los Forward Primer S' AGG CAA TAG GTT TTG AGG GCC AT 3'y Reverse Primer 5'TCC TCC CTG CTC CGA VCCG Y. 1 U de Taq polimerasa fue añadida después de una denaturalización inicial a 95ºC por 4 minutos, seguida por 35 ciclos a 95ºC por 1 minuto, 60ºC por 1 minuto, 73ºC por 1 minuto, seguida de un ciclo de extensión final a 73ºC durante 10 minutos. Un producto de 107 pb fue obtenido, resuelto en gel de 2.5% agarosa y visualizado mediante tinción con bromuro de etidio.
Genotipificación del polimorfismo en el gen del factor de necrosis tumoral a mediante RFLP El fragmento de ADN obtenido correspondiente a la mutación en la región
-308 TNF-a fue incubado con 2 U de la enzima de restricción Ncol (GIBCOBRIL) a 37ºC por 12 h. Los genotipos fueron identificados por el patrón de bandas observado luego de separar los productos digeridos por electroforesis a 70 V por 4 h en geles de agarasa al 3.5% y visualizados con UV después de tratar el gel con bromuro de etidio.
Para determinar si hubo diferencias en la producción de TNF-a entre los pacientes con TB pulmonar, extrapulmonar y los controles se empleó la prueba t de Student utilizando el programa SPSS v 9.0.
Para el estudio de asociación entre el gen candidato de susceptibilidad a tuberculosis humana se diseño un estudio analítico y observacional de tipo casos y controles. Los resultados fueron procesados mediante el uso del programa estadístico Epi INFO 2000 haciendo un análisis bivariante mediante la prueba del
chi-cuadrado con un grado de libertad (df).
Los cálculos de las frecuencias alélicas y genotípicas de los polimorfismos analizados se realizaron con el programa EH.
Las pruebas de equilibrio de Hardy-Weinberg y de desequilibrio de ligamiento se hicieron con el programa GENEPOP v 3.1.(30)
RESULTADOS
Inducción de la expresión del gen TNF-a en monocitos
Hallamos que la producción espontánea de
TNF-a fue mayor en los monocitos de los pacientes con TB pulmonar que en los de los controles y los de TB pleural. Además, los monocitos de los pacientes con TB pleural
producían espontáneamente menos
TNF-a que los controles. (Tabla 1
y Figura 5)
Al cabo de 18 horas de inducción de los monocitos con LPS la producción de
TNF-a se elevó significativamente en todos los tipos de pacientes estudiados. (p<0.0001) Pero el porcentaje de incremento, que estuvo entre el 531.2 y el 681.6%, para los monocitos de los pacientes con tuberculosis pulmonar y los controles respectivamente, fue significativa mente menor, de un 296.1 %, en los pacientes con tuberculosis miliar. (p<0.05)
(Tabla 1 y
Figura 7)
Hubo marcadas diferencias entre la producción de
TNF-a luego de 18 horas de estimulación con LPS, siendo al igual que en el momento cero más alta en monocitos de los pacientes con TB pulmonar que en los controles y en los de TB miliar y pleural, siendo los niveles de este último grupo menores a los
controles. (Tabla 1 y Figura
6)
Estos resultados nos llevaron a realizar la segunda parte del presente trabajo.
Pruebas de equilibrio de Hardy-Weinberg
En la población estudiada la distribución de los genotipos observados para los polimorfismos
-308 de TNF-a. se ajustó a la Ley de Hardy-Weinberg. En la
Tabla 2 se aprecia que la distribución de los genotiposs observados en la población total (controles + casos), en los controles y en los casos (TB pulmonar + TB pleural + TB miliar) no es diferente a la esperada, indicándonos que los genotipos analizados siguen el equilibrio de
Hardy-Weinberg.
Frecuencias alélicas y genotípicas de -308 de TNF-a
En la Tabla 3 se
observan las frecuencias alélicas y genotípicas del polimorfismo analizado de
TNF-a. Se aprecia que la distribución de alelos y genotipos entre los controles y casos es similar. La frecuencia de alelo 1 fue de 0.963 (T13 pleural) a 0.978 (TB miliar). En toda la población la frecuencia de ese alelo es 0.965. Los genotipos homocigotos para G presentaron frecuencias de 0.926 (TB pleural) a 0.975 (TB miliar), los heterocigotos de 0.045 (TB,miliar) a 0.074 (T13 pleural) y los genotipos homocigotos para el Alelo 2 tuvieron de 0.00 a 0.004.
En la Tabla 4
se observan los diferentes polimorfismos en MF-ce (-308) según formas clínicas de tuberculosis. Se aprecia que no hay diferencia entre la distribución de los polimorfismos entre tuberculosis y los controles, separando los casos de tuberculosis por sus formas clínicas y considerándolos como un único grupo.
El presente es el primer trabajo realizado en el Perú en que se determina la producción in vitro de
TNF-a de monocitos de pacientes con diferentes formas clínicas de enfermedad tuberculosa (pulmonar, miliar y pleural). (Tabla 1 y Figura 5) Los resultados obtenidos nos demuestran que en los pacientes con tuberculosis pulmonar sus monocitos espontáneamente producen más
TNF-a que los de TB pleural y los de controles sanos. Pero, cuando analizamos la producción de
TNF-a por monocitos inducida con LPS en los pacientes con TB pulmonar se encuentra la respuesta más alta, siendo significativamente mayor que en los de pacientes con TB pleural y miliar, o que en los de controles sanos. (Tabla 1 y Figura 6) Los monocitos de los pacientes con TB miliar son los que menos responden al estímulo con LPS, lo que explica en parte el hecho que ellos tengan una forma diseminada de la enfermedad. (Tabla 1 y Figura 6)
Nuestros resultados son similares a los obtenidos por otros investigadores. Takashima(7) demostró que los monocitos de tuberculosos liberaban mayor cantidad de
TNF-a in vitro en respuesta a LPS que los de los controles sanos. Sin embargo, los monocitos de pacientes con tuberculosis refractaria crónica producían bajas cantidades de esta citoquina en comparación a los pacientes con tuberculosis de diagnóstico reciente. Law(8) observó que había una mayor liberación espontánea de esta citoquina por macrófagos alveolares de pacientes con TB activa que en controles PPD-1 y a la vez que los de pacientes con TB miliar liberaban menos
TNF-a que los de los controles. Este último hallazgo, explicaría por qué en la forma diseminada de la enfermedad se presentan granulomas diminutos con limitada actividad micobactericida. La formación de granulomas es un evento crítico en la inmunidad antimicobacteriana, en la cual el
TNF-a producido por los macrófagos cumple roles claves. Esto ha sido demostrado por Wallis y Eliner(9) quienes administraron anticuerpos neutralizantes de TNF-a a ratones resistentes a BCG y encontraron que se inhibía la formación de granulomas micobactericidas, resultando en una infección invasiva y letal por BCG. Por otro lado, Roach(1 0) observó que al tratar con
TNF-a o un péptido derivado de esta citoquina a ratones infectados con M. bovis (BCG) se alteraba el número y la composición de los granulomas y que este cambio se asociaba con una disminución de la carga bacteriana. Estas evidencias sugieren que la producción de
TNF-a por monocitos o macrófagos está controlada genéticamente.
Según Haldane(39) las enfermedades infecciosas fueron la principal fuerza selectiva para la evolución humana durante los pasados 5000 años. En este contexto, la tuberculosis ha ejercido y sigue ejerciendo una fuerte presión de selección en las poblaciones humanas, y es de esperar que esta presión se oriente exclusivamente a regiones del genoma que contienen genes involucrados en la interacción con el agente causal de la tuberculosis, es decir, aquellos que participan en la respuesta inmune innata y adquirida.
Una de las aproximaciones utilizadas actualmente para identificar estos genes es mediante los estudios de asociación basados en genes candidatos en poblaciones humanas. En base a la diferenciada producción de
TNF-a por los monocitos de los pacientes con variadas formas clínicas de tuberculosis y controles sanos, el gen candidato elegido para este estudio fue el
TNF-a. Es también la primera vez que en el Perú se estudia polimorfismos en este gen para determinar su influencia en la susceptibilidad a tuberculosis. Este es un gen que tiene funciones pleiotrópicas claves en la respuesta inmune a micobacterias.
Con respecto al polimorfismo en el locus -308 del gen TNF-a analizado en la población, no se encontró que esté asociado con susceptibilidad al desarrollo de tuberculosis en la población peruana estudiada. (Tablas 3 y 4) Estos hallazgos coinciden con los reportes de estudios de asociación para tuberculosis, realizados en poblaciones de Camboya(36) e India(40). De igual modo, Blackweil, al analizar un total de 98 familias brasileñas mediante un método de ligación, observó que
TNF-a no está involucrado con la susceptibilidad a tuberculosis.(41)
Asimismo, un estudio realizado en una población de la India no ha encontrado asociación de
TNF-a por sí sólo, pero sí cuando está combinado con un haplotipo del sistema HLA.(40) Este hallazgo sugiere que
TNF-a estaría también cumpliendo un rol, pero éste es bastante moderado, por lo que no se puede detectar fácilmente.
Se ha encontrado que el polimorfismo -308 de TNF-a está asociado con cuadros clínicos severos de otras enfermedades infecciosas: La susceptibilidad a leishmaniasis mucocutánea y leishmaniasis cutánea americana,(42) el riesgo de muerte debido a malaria cerebral(37) o por infección con meningococos,(43) y la lepra lepromatosa.(44)
Estas observaciones sugieren que la susceptibilidad genética a tuberculosis es muy compleja y controlada por múltiples genes. Jepson (45) estudió en gemelos monocigotos la respuesta inmune a antígenos micobacterianos. Sus resultados mostraron que los genes del MHC invluyen en la respuesta inmune, pero el mayor efecto genético global para las respuestas celular y humoral se deben a genes que no pertenecen al MHC. Se asume que estos genes estarían contribuyendo al componente genético global de susceptibilidad a tuberculosis. Se ha observado, que este gen, en la población peruana y en otras poblaciones estudiadas contribuye moderadamente a la susceptibilidad genética a la tuberculosis, esto se manifiesta, por los valores bajos de odds ratio que van de 1.34 a 1.92 entre todas las poblaciones analizadas hasta la fecha.
Se sabe que la tuberculosis se estableció como una entidad epidémica provocando altas tasas de mortalidad en poblaciones expuestas al inicio de la Revolución Industrial y alcanzó su máximo en Europa Occidental y Estados Unidos al final del siglo XVIII y al inicio del XIX.(46, 47, 48, 49) Por tanto, en estas poblaciones la epidemia de tuberculosis ha completado su ciclo antes de la aparición de los agentes antituberculosos. En cambio, la epidemia de tuberculosis fue introducida más recientemente en poblaciones de Europa Oriental, Asia, África y Sudamérica(46), y estas poblaciones aún no han completado el ciclo epidemiológico. Adicionalmente, en estas poblaciones las tasas de mortalidad causada por M. Tuberculosis disminuyeron drásticamente, no porque hayan surgido individuos con resistencia genética a la enfermedad, sino debido al uso difundido de agentes antituberculosos desde 1944.(47, 49).
Por tanto, podemos deducir que en el caso de las poblaciones que han completado su ciclo epidemiológico M. tuberculosis ha ejercido una fuerte presión de selección, mientras que en las poblaciones expuestas más recientemente hubo una relajación de la presión de selección, debido a la disminución de las tasas de mortalidad por los antibióticos que combatieron a M. tuberculosis, agente causante de la presión de selección. En consecuencia, es de esperar que entre estas poblaciones el efecto ejercido por M. Tuberculosis sobre el mantenimiento de polimorfismos genéticos y las frecuencias de los mismos en el genoma pueda ser diferente.
En general, la presión de selección es la fuerza principal que afecta la frecuencia genética. Cualquier variante de un gen que aumente la probabilidad de sobrevivir aumentará su frecuencia en cada generación, o disminuirá si es que esta variante no permite la supervivencia de los individuos de tal población.(38) Como mencionamos en líneas anteriores, M. tuberculosis ha ejercido y sigue ejerciendo una gran presión de selección en las poblaciones humanas, quizá en unas más que en otras. Pero también resulta evidente, que nuestro organismo siempre ha tratado de mantener al margen la infección y el desarrollo de la enfermedad en caso que se haya establecido la infección, por medio del sistema inmune innato y adquirido. En consecuencia, deducimos, que el sistema inmune también ha ejercido y ejerce una fuerte presión de selección en el genoma de M. tuberculosis y probablemente las cepas actuales son aquellas que han logrado evolucionar a través de mutaciones en sus genes que participan en la interacción con el humano. Sabemos, que la interacción entre los humanos y M. tuberculosis se remonta a varios miles de años, y es notorio que el humano ha evolucionado para responder a los ataques y eso se evidencia por la presencia de muchos genes polimórficos en los genes que codifican moléculas que participan en la respuesta inmune. Sin embargo, los genes de M. tuberculosis que codifican moléculas que suelen ser el blanco de nuestro sistema inmune no presentan polimorfismos y por lo contrario suelen ser bastante conservados. (50, 51) Sin embargo, presentan más del 95% de mutaciones que causan cambios de aminoácidos en genes que codifican proteínas o polipéptidos que son el blanco de antibióticos.
Es cierto que los antibióticos también representan una fuerte presión de selección para M. tuberculosis, pero esta presión de selección esta afectando a este patógeno hace menos de 60 años. En consecuencia, estos hallazgos sugieren que la cepa que ingresa en un paciente va evolucionando ante la presión de selección que el sistema inmune ejerce y sobreviven las bacterias que presentan las combinaciones adecuadas de estas secuencias de inserción a lo largo de su genoma. Esto es posible ya que en un ser humano pueden haber varios millones de M. tuberculosis(53) y sólo basta que uno de ellos tanga la capacidad de eludir el sistema de control inmune para que tenga éxito y entonces ocurrirá la tuberculosis. Nuestros resultados muestran que las frecuencias de los genotipos de
-308 de TNF-a se ajustan a la Ley de Hardy-Weinberg. (Tabla 2) Al estudiar otros genes como NRAMP1 para conocer su asociación con TB en Gambia(31), Corea(32) y Japón(j3), con tripanosomiasis en Perú(34) y con
VIH-SIDA en Colombia(35) se encontró que todas estas poblaciones siguen el equilibrio de
Hardy-Weinberg. También, en otras poblaciones de Camboya(36), Venezuela(35), y Gambia(37), la distribución de genotipos de
-308 TNF-a están en equilibrio de Hardy-Weinberg.
En teoría, una población que se ajusta a la Ley de Hardy-Weinberg no evoluciona, debido a que presenta en forma simultánea las siguientes condiciones: la población es infinitamente grande, todos los miembros de la población se reproducen, los apareos totalmente ocurren al azar y la población está libre de fuerzas evolutivas externas, tales como mutación, flujo de genes debido a migración o emigración y selección natural.(38)
Entonces, si los polimorfismos estudiados están en equilibrio de Hardy-Weinberg, nosotros podemos esperar que las frecuencias alélicas y genotípicas permanezcan constantes en las futuras generaciones. Pero este aparente equilibrio en la estructura genética de la población no necesariamente implica que la población no está evolucionando, sino sólo indicaría que estos loci no están cambiando. Aun si la frecuencia de alelos de un solo locus se modifica en las generaciones futuras, la población está evolucionando. Además, en la naturaleza no existen poblaciones que cumplen en forma simultánea todas las condiciones mencionadas y por ende están en evolución permanente.
Para confirmar que los polimorfismos analizados están en equilibrio de
Hardy-Weinberg, es decir, sus frecuencias son estables en el tiempo, se debería compararlos entre poblaciones de generaciones diferentes.
Como nuestros controles sanos y nuestros pacientes con tuberculosis presentan el mismo genotipo del locus-308 de gen TNF-a, y hemos observado que hay diferencias marcadas entre los monocitos de los grupos estudiados en la producción de esta citoquina, probablemente el polimorfismo que hemos analizado no esté asociado con estas variaciones en la producción de TNF-a y de existir esta asociación podría quizá evidenciarse si analizáramos un mayor número de personas. Otros polimorfismos en el gen
TNF-a podrían estar involucrados. Herramann(23) analizó mediante PCR-SSCP toda la región codante y 1053
pb de la región promotora de este gen. Encontró cuatro polimorfismos en posiciones
-857, -851, -308, y -238 y uno en la región 5 UTR en posición +691.
También Knight(24) ha encontrado polimorfismos en la posición -376. De estos polimorfismos identificados hasta la fecha, se ha demostrado que los polimorfismos
-308 y -376 muestran una incrementada expresión del gen en ensayos in vitro.(24, 25) Particularmente, la mutación en la posición
-376 (cambio de G por A) provoca que el factor de trascripción hélice-giro-hélice OCT1 se una a una nueva región de interacciones complejas de DNA proteínas y altera la expresión del gen en monocitos humanos. Este polimorfismo se ha visto que está asociado en poblaciones africanas con susceptibilidad a malaria celebral. (24)
Probablemente esta expresión diferencial de TNF-a sea mediada en otras posiciones del gen de
TNF-a, en el gen del receptor del TNF-a, a nivel de la expresión del mRNA del
TNF-a, de otras proteínas que intervienen en la vía del TNF-a o a nivel de otros genes que intervienen en la respuesta inmune efectiva contra la infección por M. tuberculosis.
En la mayoría de enfermedades infecciosas únicamente una proporción de individuos expuestos al patógeno llegará a infectarse y desarrollará enfermedad clínica evidente. Al menos en parte, esta variabilidad entre individuos está determinada por el efecto combinado de proteínas hospederas codificadas por una serie de genes que controlan la cantidad y calidad de la interacción huésped-patógeno y la respuesta inmune del huésped. La identificación de importantes genes de susceptibilidad/resistencia del huésped permitirá un mejor entendimiento de la patogénesis de las enfermedades infecciosas y probablemente facilitará el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas.
Podemos concluir entonces que existe una expresión diferencial de la citoquina
TNF-a en los monocitos de pacientes con diferentes formas clínicas de la enfermedad tuberculosa comparada con controles sanos, y que se incrementa significativamente por LPS, siendo esta elevación menor en los pacientes con TB miliar. Al parecer esa diferencia no es mediada por la presencia de mutaciones en la posición
-308 del promotor del gen TNF-a, ya que en el estudio de asociación realizado en el presente trabajo no se encontró diferencias. En la población estudiada la frecuencia de los alelos 1 y 2 para el polimorfismo
-308 de TNF-a, fue 0.94 y 0.06 respectivamente. La distribución de los genotipos de
-308 de TNF-a se ajusta a la ley de Hardy-Weinberg.
AGRADECIMIENTOS
El presente trabajo ha sido financiado por: a) Facultad de Medicina "Alberto Hurtado" de la Universidad Peruana Cayetano Heredia, b) Fundación Instituto Hipólito Unanue, c) Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONCYTEC), d) Proyecto Vigía, Convenio
MINSA-USAID, e) Fondos Francisco Tejada y Semiramis Reátegui 2001, Universidad Peruana Cayetano Heredia, y f) Laboratorios de investigación y Desarrollo de Ciencia y Tecnología (LID), Facultad de Ciencias y Filosofía, Universidad Peruana Cayetano Heredia, Asimismo, agradecemos a la Dra. MarieAnne Shaw de la Universidad de Leeds, Inglaterra, al personal del Programa Nacional de Tuberculosis de la
Sub-Región de Salud Lima Norte, al personal del Banco de Sangre del Hospital Nacional Cayetano Heredia.
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1. Unidad de Biotecnología
Molecular(UBM), Laboratorios de investigación y desarrollo de Ciencia y
Tecnología(LID), Universidad Peruana Cayetano Heredia.
2. Laboratorio de Respiración, Instituto de Investigaciones de Altura, Universidad Peruana Cayetano Heredia.
Tabla de contenido
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