CARACTERIZACIÓN DE LAS MUTACIONES EN EL GEN rpoB ASOCIADAS A LA RESISTENCIA A RIFAMPICINA Y TIPIFICACIÓN MOLECULAR MEDIANTE
RFLP (IS6110) EN CEPAS DE M. TUBERCULOSIS DE PACIENTES
CON TUBERCULOSIS PULMONAR

Dr. Juan Agapito^1,2, Víctor Neyra¹, Christian Baldeviano⁴, José R. Espinoza¹,
Roberto Accinelli³.

. RESUMEN
. INTRODUCCIÓN
. MATERIALES Y MÉTODOS
. RESULTADOS
. DISCUSIÓN

Hoy en día, las enfermedades producidas por micobacterias siguen siendo de gran importancia en la medicina y salud pública a nivel mundial. El reciente resurgimiento de la tuberculosis en países desarrollados ha sido acompañado por un incremento en la prevalencia de la resistencia a drogas. De acuerdo a estimados de la Organización Mundial de la Salud (OMS), un tercio de la población mundial está infectada por Mycobacterium tuberculosis. En América latina, la Organización Panamericana de la Salud (OPS) estima que la tuberculosis ocasionó la muerte de más de 75,000 personas en 1995 y que 400,000 personas contrajeron la enfermedad. Este importante reservorio de infectados está originando que se produzcan más de 8 millones de nuevos casos cada año en todo el mundo, lo que sumados a los que no se curan y a los que recaen de años previos, hacen estimar una prevalencia actual de 16 millones de enfermos, convirtiendo a M. tuberculosis en un patógeno altamente infectivo y de gran importancia en el ámbito mundial. La aparición de epidemias de tuberculosis con cepas multidrogorresistentes en los países desarrollados es sin duda, uno de los principales riesgos para la salud pública en todo el mundo. Asociándose este problema con la epidemia del VIH/SIDA; quienes en la mayoría de casos fueron pacientes que presentaban la coexistencia de ambas enfermedades (8).

En Nueva York, se han presentado más del 80 % de nuevos casos de tuberculosis, asociado con resistencia por lo menos a isonizida y rifampicina, con la consiguiente alta mortalidad y diseminación de estas cepas (8).

A partir del año 1972, Rifampicina (Rif) ha sido utilizada como una droga para el tratamiento de cepas sensibles, así como también para aquellos pacientes que tienen resistencia por lo menos a isoniazida o estreptomicina (30). Su capacidad bactericida ha hecho posible su utilización en los tratamientos de corta duración para cepas sensibles; sin embargo su uso es más prolongado en el tratamiento para los pacientes que tienen aislamientos resistente a isoniazida (30). La eficacia de este régimen de tratamiento está cambiando en regiones donde la resistencia inicial a rifampicina (Rif) es alta. En estas regiones, la rápida detección de resistencia a rifampicina (Rif r ) es una necesidad urgente. De particular importancia la resistencia a rifampicina ha sido considerado como un marcador de cepas de tuberculosis multidrogoresistentes (MDR-TB), ya que ha sido asociado con brotes de enfermedad en hospitales, prisiones y otras instituciones a nivel mundial (9).

La resistencia a rifampicina ha sido atribuida a mutaciones puntuales, inserciones y deleciones en una región limitada del gen rpoB que codifica a la subunidad B de la ARN polimerasa (24, 29). Por lo menos el 95% de los aislamientos para resistencia a rifampicina tienen mutaciones en este gen (31, 42). Estas mutaciones asociadas con resistencia fenotípica a rifampicina son generalmente localizadas en una región de 81 pb. con mutaciones frecuentemente en los codones: Ser-531, His-526 y Asp-516 (24, 42, 53). Diferentes variaciones alélicas han sido detectadas en esta región y genotipos específicos del gen rpoB son conocidos por estar asociados con altos índices de resistencia a rifampicina en cepas de M. tuberculosis aisladas de diferentes partes del mundo (24).

La aplicación de métodos genéticos para un test rápido de susceptibilidad a rifampicina tiene importancia para la eficacia del tratamiento y control de tuberculosis drogo-resistente. En el presente estudio se evaluó las mutaciones del gen rpoB de cepas resistentes a rifampicina (Rif r) y en cepas susceptibles a M. tuberculosis aisladas de pacientes diagnosticados con tuberculosis pulmonar. El primer objetivo de este trabajo fue el de identificar las mutaciones del gen rpoB, asociadas con resistencia a rifampicina en cepas de M. tuberculosis aisladas de la Sub- Región de salud Lima Norte.

El desarrollo de métodos de genotipaje dirigido a diferenciar los polimorfismos entre una cepa y otra, mediante la presencia de elementos repetitivos en el cromosoma de M. tuberculosis, son utilizados como marcadores genéticos que facilitan enormemente su tipificación , sí como su estudio epidemiológico (11, 50, 53).

El método más usado es el Polimorfismo en la Longitud de los Fragmentos de Restricción (RFLP), con el cual se analiza el número y localización de elementos de inserción dentro del cromosoma de M. tuberculosis (6, 15, 25).IS6110 es una secuencia de 1,361 pb específica para M. tuberculosis, el cual es utilizado para la identificación de patrones específicos de transmisión, pues es el fragmento de DNA que más veces se repite en el cromosoma de M. tuberculosis (11, 15, 27, 51). Otra aplicación está dirigida al entendimiento de la dinámica epidemiológica y al estudio de la transmisión de la tuberculosis en grandes poblaciones (5, 7, 57). La combinación del número de fragmentos y el tamaño de los mismos proporciona un patrón de bandas específico para cada aislamiento, donde el número de bandas corresponde al número de elementos IS6110 y la distancia de las bandas en el blot nos permite determinar el peso molecular del fragmento conteniendo a la secuencia IS6110 (25). El segundo objetivo de este trabajo fue tipificar las cepas resistentes mediante la producción de una huella dactilar (fingerprint) en el ADN producido por la hibridación de una sonda de 245 pb obtenida de la secuencia de inserción IS6110 del cromosoma de M. tuberculosis que es utilizado como un marcador genético específico.

Se cultivó en medio de Lowestein Jensen 73 muestras de esputo de pacientes diagnosticados de tuberculosis pulmonar provenientes de la Sub-Región de salud Lima Norte. Sólo 62 de estas muestras fueron sometidas a la prueba de susceptibilidad a drogas de primera línea: isoniazida, strepromicina, rifampicina y etambutol, pues las 11 restantes no pudieron ser incluidas al haber crecido menos de 10 colonias (2 a 4), número mínimo para realizar estudios de sensibilidad por el método de las proporciones. En 52 (83.9%) muestras la cepa aislada fue resistente a rifampicina (Rif r) y 10 (16.1 %) fue sensible (Rif s ).

Baciloscopía, Cultivos.

Todas las muestras respiratorias fueron examinadas mediante la técnica del examen directo (Baciloscopía) y teñidas con la coloración de Ziehel-Nelseen. Los esputos fueron descontaminados con NaOH al 4% (w/v), de acuerdo al método de Petroff (24) y cultivadas por duplicado sobre el medio de Lowenstein Jensen e incubadas a 37°C. Los cultivos fueron examinados a las 48 y 72 hrs. de haber sido sembrados para verificar posibles contaminantes por flora secundaria. Revisiones posteriores se realizaron a los 30, 45 y 60 días, hasta obtener cultivos positivos.

Susceptibilidad a Drogas.

Los aislamientos de M. tuberculosis fueron evaluados para susceptibilidad a rifampicina (Rif), isoniazida (INH), streptomicina (SM) y etambutol (EMB) (Tablas N° 1, 2 y 3).

La resistencia a rifampicina fue determinada sobre el medio de Lowestein-Jensen por el método de las proporciones. Para las cepas resistentes a rifampicina la mínima concentración inhibitoria (MIC) fue de 40 mg/ml (12). Fueron consideradas como resistente, en el medio conteniendo rifampicina, las muestras cuyo crecimiento fue mayor del 1% , comparado con un control sin antibiótico.

Extracción del ADN genómico de cultivos Mycobacterianos.

En las 62 muestras se hizo la extracción de ADN en una cabina de Bioseguridad Tipo II, (Labconco Purifier Class II) de acuerdo a lo descrito por Van Soolingen et. al (49). Las colonias fueron transferidas con una asa de siembra a un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml, conteniendo 400 ml de solución de lísis (10 mM de TE pH 8.0, 10mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA pH 8.0) y calentadas a 80°C por 20 min, luego fueron enfriadas a temperatura ambiente, posteriormente se le agregó 50 ml de lysozyma (10mg/ml) incubándose a 37°C por 16 h. Finalmente el lisado celular fue incubado por 10 min a 65°C con 75 ml de una solución de SDS al 10% conteniendo 50 mg de proteinasa K. Al contenido celular se le agregó 100 ml de NaCl 5M y 100 ml de la solución CTAB/NaCI, incubándose por 10 min. a 65°C .

El ADN fue extraído en dos pasos: la primera con una mezcla de fenol-cloroformo-alcoholisoamílico (25:24:1) y la segunda con cloroformo-alcoholisoamílico (24:1). Luego el ADN fue precipitado con dos volúmenes de etanol absoluto y acetato de sodio 3 M (pH 5.2), a -70°C durante 30 min, y centrifugación a 12000 x g por 5 min. El pellet de ADN fue lavado dos veces con etanol al 70% (v/v), secado a temperatura ambiente, resuspendido en 50 ml de buffer TE e incubados a 37°C por 30 min. para disolver el pellet. El ADN purificado fue guardado a 4°C para su posterior uso.

Diseño de Cebadores (Primer')

Los primers para el PCR fueron diseñados basándose en la secuencia del gen rpoB que codifica a la sub unidad b de la ARN polimerasa (Figura N°1) (Número de acceso a la base de datos en el Gen Bank N° U12205). Los primers fueron diseñados con la ayuda de los programas OLIGOTM versión 4.0 y OLIGO calculator. Se comprobó la especificidad de los oligonucléotidos mediante el uso de los programas BLAST, de acceso libre en Internet, con el fin de encontrar posibles secuencias homólogas con otros organismos.

PCR y cuantificación de los productos amplificados.

Los primers Forward F1 (5'-CAGACGTTGATCAACATCCGC-3') y Reverse F2 (5'-CAGGTACACGATCTCGTCGCTAA-3') fueron sintetizados por Applied Biosystems, Foster City California.

Un producto de amplificación de 350 pb del gen rpoB fue obtenido por PCR utilizando los primer descritos anteriormente (Figura N° 2). Para la reacción se utilizó 50 ng de ADN genómico de M. tuberculosis, las condiciones estandarizadas del ensayo de PCR fueron: 0.5 mM de cada primer F1/F2, buffer de PCR (50 mM KCL, 100 mM Tris-HCI (pH 8.3), 0.1 % gelatina), 2.5 mM de MgCl2, 50 mM de cada dNTP y 0.5 U de Amplitaq ADN polimerasa (Perkin Elmer). La reacción se llevó a cabo en un termociclador GenAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer, USA), bajo las siguientes condiciones de temperatura: denaturación inicial 94°C por 3 min., seguido de 35 ciclos de amplificación (94°C por 1 min, 65°C por 1 min, y 72°C por 1 min.) y finalmente un ciclo de 72°C por 10 minutos. Los productos de amplificación obtenidos mediante la reacción de PCR fueron visualizados por electroforesis en geles de agarosa al 1 % en buffer de corrida TBE (tris-acetato 0.089 M, ácido bórico 0.089 M y EDTA 0.002 M). La electroforesis fue realizada en una cámara de electroforesis horizontal (Modelo H5, GIBCO BRL) a 60 V por 45 min, en presencia de un marcador estándar de peso molecular (lHind III). Los geles fueron teñidos con bromuro de etidio (0.5 mg/ml.) durante 3 min. y visualizados en un transluminador de luz UV (UVP, Modelo TM-20 San Gabriel USA.). Los resultados fueron fotografiados en una cámara digital Kodak Digital Science ID (Instituto de Medicina Tropical "Alexander Von Humboldt", UPCH). Todas las fotos obtenidas son mostradas en negativo para un mejor contraste de las bandas.

Ligación de los productos de PCR en el vector de clonación pGEMâ -T.

Los productos de amplificación (350pb) del gen rpoB de cada una de las 62 cepas fueron ligados en un vector de clonación pGEMâ-T (PROMEGA).

La reacción de ligación fue realizada en proporción de vector: inserto (1:6), en un volumen final de 10 ml (2 ml de buffer de ligación, 2 ml de vector (5ng/ml), 2.5 ml de producto de amplificación (5ng/ml) y 0.5 ml de la enzima ADN ligasa) e incubados a 4°C por 16 h, luego fueron almacenados a -20°C hasta su posterior uso.

Preparación de células competentes.

Se usó la cepa de E. coli DH5a. Estas bacterias se hicieron crecer en una placa conteniendo LB-agar (medio Luria-Bertani) por 16 h a 37°C, luego se tomó una colonia y se hizo crecer en 3ml de solución LB en agitación por 16 h. a 37°C. Se tomó 1 ml del preinóculo y se colocó en 100 ml de caldo de cultivo LB, incubándose a 37°C por 3-4 h, en agitación constante hasta que el cultivo alcance una DO600nm. entre 0.5 y 0.7. Luego el medio de cultivo fue transferido asépticamente a tubos de centrífuga estéril y centrifugados a 3,500 x g durante 20 min a 4°C, el pellet celular fue resuspendido en 10 ml. de CaCl2 0.1M y luego centrifugado a 4000 x g durante 10 min. a 4°C. Se eliminó el sobrenadante y se resuspendió el pellet en 2 ml de glicerol al 15% en CaCl2 0.1M, las bacterias competentes fueron alicuotadas (300 ml) y criopreservadas a -70°C hasta su uso (todo el procedimiento se realizó en frío).

Las bacterias competentes fueron sometidas a evaluación para medir su eficiencia de transformación utilizando el plásmido pUC (19).

Proceso de transformación de E. coli por el método de CaCl₂.

Se transfirió 150 ml de células competentes en un tubo de 1.5 ml. y se mezcló con el producto de ligación, incubándose en hielo por 30 min. Luego fueron sometidos a un choque térmico por 90 s. a 42°C y colocados rápidamente sobre hielo por 2 min. El tubo de reacción fue centrifugado a 13,000 rpm por 20 s. Luego se adicionó 800 ml de medio SOC ( Bacto tryptona 2%, extracto de levadura 0.5%, NaCl 10 mM y KCI 2.5 mM), conteniendo 3.5 ml de una solución estéril de MgCl2 2M y 14ml de una solución estéril de glucosa 1M. e incubado a 37°C en agitación constante por 1 h.

Luego las bacterias fueron recuperadas por centrifugación a 13,000 rpm por 30 s, se eliminó el sobrenadante y el pellet fue resuspendido en 100 ml de medio LB conteniendo: 35 ml de solución IPTG (100 mM isopropyIthio-B-D- galactoside) y 25 ml de la solución X-gal (20 mg/ml en dimetilformamida), las bacterias fueron resuspendidas suavemente y sembradas por diseminación en placas LB-agar con ampicilina (50, mg/ml) incubándose a 37°C por 16 h.

Selección de clonas recombinantes.

Las clonas recombinantes (plásmido-inserto) fueron seleccionadas teniendo como agente selectivo a la ampicilina y al sustrato cromogénico IPTG.

Las colonias blancas fueron seleccionadas para el análisis de transformantes. Las colonias seleccionadas fueron replicadas en 3 ml de LB/ampicilina (50 mg/ml) incubándose a 37°C por 16 h. en agitación constante. Para su posterior verificación del inserto (350 pb del gen rpoB)

Ensayo de PCR para verificar las clonas recombinantes.

Una vez crecidas las clonas recombinantes, fueron lisadas por calor (500ml de agua ultrafiltrada y 20ml de medio conteniendo las bacterias). Se incubó por 15 min a 100°C, a fin de liberar el contenido citoplasmático. Una vez lisadas las bacterias, se procedió a verificar el inserto mediante una reacción de PCR, para ello se utilizaron los siguientes primers T7 (5'-TAATACGACTCACTATAG- 3') y SP6 (5'-AGCTATTTAGGTGACACTATAG- 3'). Estos primers flanquean el sitio de clonación del vector pGEMâ -T.

Las condiciones de PCR fueron: 0.5 mM de cada primer T7/SP6, buffer de PCR (50 mM KCL, 100 mM Tris-HCI (pH 8.3), 0.1% gelatina), 2.5 mM de MgCl2, 50 mM de cada dNTP y 0.5 U de Amplitaq ADN polimerasa (Perkin Elmer). La reacción se llevó a cabo en un termociclador GenAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer, USA), bajo las siguientes condiciones de temperatura: denaturación inicial 94°C por 3 min., seguido de 30 ciclos de amplificación (94°C por 30 s, 55°C por 45 s, y 72°C por 30 s) y finalmente un ciclo de 72°C por 10 minutos.
Los productos de amplificación obtenidos mediante la reacción de PCR fueron visualizados por electroforesis en geles de agarosa al 1%, en presencia de un marcador estándar de peso molecular conocido (Figura N° 03). Un control de autoligamiento del vector fue incluido en el experimento. Una vez verificado las clonas recombinantes, las bacterias fueron criopreservadas (glicerol 15%) y colocadas a -70°C.

Purificación del ADN plasmídico.

Las bacterias recombinantes fueron descriopreservadas, crecidas en placas de agar LB/ampicilina a 37°C por 16 h. Una vez crecidas se tomó una colonia y se hizo crecer hasta su saturación en 100 ml de caldo de LB/ampicilina (50 mg/ml), a 37°C por 16 h. en agitación constante.

Para purificar los plásmidos se utilizó el Kit Wizardâ Plus Midipreps DNA purification system (Promega). Las bacterias recombinantes crecidas en medio LB/ amp fueron centrifugadas a 10,000 x g por 10 min. a 4°C, el pellet obtenido fue resuspendido en 3ml de una solución de resuspensión celular, luego las bacterias fueron lisadas con 3ml de una solución de lisis mezclándose por inversión durante 10 min, hasta obtener una solución viscosa, luego se le agregó 3 ml de una solución neutralizante, mezclándose suavemente por inversión durante 10 min, hasta obtener una masa floculosa que fue separada por centrifugación a 10,000 x g durante 15 min. a 4°C. al sobrenadante obtenido se le agregó 10 ml de resina, mezclándola suavemente. Toda la mezcla de ADN/ resina fue transferida a una columna, y aplicando vacío fue retenido el ADN en un filtro provisto por la columna, este fue lavado con 30 ml. de una solución de lavado conteniendo etanol. La columna fue separada y transferida a un tubo de 1.5 ml y centrifugada a 10,000 x g por 2 min. para remover cualquier residuo de la solución de lavado. Se transfirió la columna a un nuevo tubo y se agregó 300 ml de agua libre de nucleasas. El ADN plasmídico fue eluido por centrifugación a 10,000 x g por 20 s. y almacenado a -20°C, hasta su uso.

Secuenciamiento del ADN plasmídico.

El secuenciamiento de los plásmidos purificados fueron realizados en el secuenciador automático ALF express (Amershan Pharmacía Biotech) de la División de Biología Molecular del Instituto Nacional de Salud.

La reacción de secuenciamiento se realizó con el kit Cys Autocycl TM (Amersham Pharmacia - Biotech), se utilizó 1 mg de ADN plasmídico. La reacción se llevó a cabo en un termociclador GenAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer, USA), bajo las siguientes condiciones de temperatura: denaturación inicial 94°C por 120 s., seguido de 30 ciclos de amplificación (94°C por 40 s, 51°C por 50 s, y 72°C por 80 s) y finalmente 72°C por 10 minutos. Las reacciones fueron mantenidas a 4°C, hasta la adición de la solución de parada (100% de formamida desionizada, azul de dextrano 5mg/ml).Las reacciones fueron calentadas a 80°C por 2 min. y colocadas en hielo antes de ser colocadas en gel de secuenciamiento.

Los fragmentos de ADN de diferente tamaño formado por las reacciones, fueron separados por electroforesis en gel denaturante de poliacrilamida al 6% con 7M de urea en buffer TBE 0.6X (Tris 0.6M, ácido bórico 49.8 mM, EDTA 0.6 mM), a 58°C durante 12 horas a 1500 v, 60 mA y 25 w.

Análisis de RFLP-IS6110.

Digestión con endonucleasa de restricción

4.5 mg de ADN cromosomal de Mycobacterium tuberculosis resistente, fue digerido con 1 ml de la enzima de restricción Pvu II Promega (10 U/,ml) a 37°C por 4 horas en un volumen final de reacción de 20 ml. Así mismo 4.5 mg de ADN de la cepa estándar referencial de M. tuberculosis Mt. 14323, también fue digerida.

El proceso de digestión fue resuelto mediante electroforesis en geles de agarosa al 0.8 % en un buffer de corrida TAE y posteriormente teñidos con bromuro de etidio (0.5 mg/ml), para verificar la digestión.

Preparación de la sonda de ADN por PCR

IS6110 es una secuencia de inserción específica en el ADN cromosomal de M. tuberculosis de 1.3 Kb aproximadamente. Se utilizaron los oligonucleótidos: INS-1(5'CGT GAG GGC ATC GAG GTG GC 3') e INS-2(5'GCG TAG GCG GTC GGT GAC AAA 3')(Hermans et al 1990) para amplificar un segmento de 245 pb el cual fue purificado mediante electroforesis en agarosa de bajo punto de fusión y mediante el uso del Kit Wizardâ DNA purification system (Promega) y marcado con peroxidasa siguiendo las recomendaciones del kit ECL TM Direct nucleic acid labelling and detection system (Amersham Pharmacia Biotech).

Transferencia de ácidos nucleicos.

El gel de agarosa conteniendo los fragmentos de ADN separados electroforéticamente fue tratado con una solución depurinadora conteniendo HCI 0.25 M, pH 1.2 por 15 min. luego fue lavado con agua destilada y tratado con una solución denaturante (NaCI 1.5 M, NaOH 0.5 M), mediante agitación constante por 20 min. Seguidamente fue lavado con agua destilada y neutralizado con una solución de NaCI 1.5 M y Tris-HCI 0.5 M, a pH 7.5. Después del tratamiento previo, el gel fue montado en un sistema de transferencia y los fragmentos de ADN transferidos a una membrana de Nylon Hyboond N (Amersham), mediante capilaridad por 4 horas a temperatura ambiente.

Hibridación y detección

Luego de la transferencia la membrana de Nylon(+) conteniendo los fragmentos de ADN, fue lavado con una buffer salino 5x SSC (20x SSC contiene NaCl 3M y citrato de sodio 0.3 M pH 7) y secada a 42 °C por 30 min. El ADN fue fijado mediante exposición a UV por 5 min. Luego fue colocado en una solución de pre-hibridación el cual contenía ADN de esperma de salmón como agente bloqueador. Para el proceso de hibridación se utilizó la soda (IS6110 de 245 pb) marcada con peroxidasa y para la detección se usó las recomendaciones del kit de ECL TM (Amersham, RPN 3001).

62 cepas de M. tuberculosis fueron utilizadas para este estudio. Con respecto a la rifampicina 52 (84%) fueron cepas resistentes y 10 (16%) cepas sensibles (Tabla N°1). Resistencia primaria tuvo 27 (52%) de las cepas resistentes a rifampicina y adquirida 25 (48%) (Tabla N° 2). Se encontró que las cepas con resistencia primaria 1 tuvo resistencia sólo a una droga, 3 a dos, 11 a tres y 12 a cuatro. Mientras que para la resistencia adquirida 1 cepa fue para una droga, 5 para dos, 8 para tres y 11 para cuatro drogas. La resistencia simultánea por lo menos a rifampicina e isoniacida (multidrogoresistencia) fue de 41.93% entre las cepas con resistencia primaria y 37.09% entre las de secundaria. (Tabla N° 3 y 4).

Todos los productos de amplificación obtenidos por PCR mostraron un mismo tamaño (350pb) para la región del gen rpoB en todas las cepas aisladas (Figura N°2). En el secuenciamiento de los productos de amplificación de 62 cepas de M. tuberculosis (52 Rif r 10 Rif s) (Tabla N°5), se halló varias mutaciones en una región corta de 81 pb del gen rpoB. El 62.7% de las mutaciones ocurrió en el codón 531(58.8% cambió Ser-Leu y 3.9% de Ser-Trp). El 15.72% de las mutaciones ocurrió en el codón 526 (7.86% cambió His-Leu, 5.9% de His-Tyr y 1.96% cambió His-Asp). El 11 .78% de las mutaciones ocurrió en el codón 516 (5.9% cambió Asp-Val, 1.96% Asp-Tyr, 1.96% Asp-His y 1.96% cambió Asp-Ala). El 5.88% de las mutaciones ocurrió en el codón 513(1.96% cambió Gln-Pro, el 1.96% Gln-Lys y 1.96% cambió Gln-Leu). Para los codones 522, 527, 533, 520, 511, 512 la frecuencia de mutación fue de 1.96% respectivamente. (Figura 4). De las 52 cepas resistentes a rifampicina, 46 aislamientos tuvieron una mutación puntual en un solo codón y 5 cepas presentaron doble mutación en codones separados: (511-Leu y 516-Asp), (516-Asp y 526-His), (516-Asp y 527-Lys), (520-Pro y 526-His) y (511-Leu y 512-Ser).Hubo una cepa resistente a las 4 drogas probadas (cepa 62 del HNCH) en la que no se encontró ninguna mutación en la región corta de 81 pb del gen rpoB. la ausencia de mutación en una cepa resistente no fue observada. No se encontró ninguna mutación en las diez cepas susceptibles (Rif s) estudiadas (Tabla N°5)

Mediante análisis de RFLP basado en la secuencia de inserción IS6110 se determinó la relación clonal entre 27 de los 52 aislamientos resistentes a rifampicina. El número de copias de IS6110 en las cepas estudiadas osciló entre 2 y 17 (promedio: 9 ± 4). Sólo 3 cepas tuvieron menos de seis copias, dos de ellas con únicamente 2 copias de IS6110. Hubo cuatro cepas con 13 copias de IS6110, siendo este grupo el de mayor frecuencia de presentación. Se observaron 25 patrones diferentes de RFLP-IS6110 en las 27 cepas analizadas. Cuatro de ellas presentaron dos patrones idénticos, designados como patrón A y B, con dos cepas cada uno. Un total de 23 cepas tuvieron patrones diferentes entre sí. (Figuras I, 1, 2, 3 ,4 y 5)

Bibliografía

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1. Unidad de Biotecnología Molecular (UBM), Laboratorios de Investigación y Desarrollo de Ciencia y Tecnología (LID), Universidad Peruana Cayetano Heredia.
2. Laboratorio de Mycobacterias, Hospital Nacional Cayetano Heredia
3. Laboratorio de Respiración, Instituto de Investigaciones de Altura, Universidad Peruana Cayetano Heredia
4. División de Biología Molecular, Instituto Nacional de Salud (INS).

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