|
La criptococosis es la infección oportunista más común del SNC en pacientes con SIDA en los Estados Unidos1,2. El agente etiológico Cryptococcus
neoforman, presenta dos variedades C. neoformans var. Neoformans (serotipos A y D), aislada principalmente de excretas de palomas, y C. neoformans var. gattii
(serotipos B y C) a partir de diferentes especies de Eucalyptus3-9.
Salkin y Hurd10 reportaron el uso del agar glicina cicloheximida rojo de fenol
(GCP) para la diferenciación de los cultivos de cepas de C. neoformans en sus dos variedades.
Kwon-Chung y col.11 desarrollaron el medio canavanina glicina azul de bromotimol sódico
(CGB) y un total de 213 cepas de C. neoformans fueron probadas en los agares
CGB, GCP y CDB (creatinina dextrosa azul de bromotimol). Ellos concluyeron que el medio CGB fue superior al GCP y CDB en el quinto día de incubación y el 100,0% de C. neoformans var. neoformans pudo diferenciarse de la variedad
gattii.
El medio CGB emplea Glicina como única fuente de carbono y nitrógeno; la droga que ayuda a la tipificación de ambas variedades es el Sulfato de
L-Canavanina y el indicador es el Azul de Bromotimol Sódico.
La diferenciación bioquímica de C. Neoformans por variedades mediante el uso del medio CGB se debe a que 28,0 a 33,0% del serotipo A es sensible a £5mg/L de canavanina y 100,0% del serotipo D es sensible a esta concentración de la droga. De los aislamientos del serotipo A resistentes a
canavanina, 10,0 a 20,0% son capaces de asimilar la glicina; sin embargo, éstos no crecen cuando son cultivados sobre el medio que contiene ambos compuestos. Solamente 11,0% de los aislamientos serotipo D utilizan la glicina, pero todos son sensibles a la
canavanina; en cambio, 100,0% de las cepas de C. neoformans var. gattii
(serotipos B y C) resisten la canavanina hasta o excediendo los 960 mg/L y asimilan la glicina (Concentración de canavanina en el medio
CGB: 30mg/L). Luego del metabolismo de este componente se forma amonio, el cual alcaliniza el medio haciendo virar el indicador hacia un color azul cobalto11-14.
El estudio de las diferencias epidemiológicas de ambas variedades en 725 cepas de origen clínico obtenidas de diferentes partes del mundo antes de la epidemia del SIDA confirman la superioridad del medio CGB sobre otros medios para la diferenciación de las dos variedades15. La variedad neoformans fue encontrada en todos los años (entre 1972 y 1992) que se hicieron aislamientos, mientras que la variedad gattii fue observada solamente a partir de 198616. En un estudio de 68 cepas aisladas de pacientes peruanos
inmunocompetentes, la determinación de la variedad fue realizada en el Instituto de Medicina Tropical
"Prince Leopold" (Bélgica) identificándose en 66/68 la var. neoformans y en 2/68 la var. gattii fue identificada mediante su habilidad de asimilar la D-Prolina17.
La determinación de las variedades de Cryptococcus neoformans usando el agar CGB no ha sido realizada ni estandarizada en nuestro país. Por lo tanto, este estudio permitirá utilizar una metodología sencilla para la tipificación de las cepas de C. Neoformans en sus dos variedades, siendo los objetivos del trabajo:
- Determinar la variedad en cepas de C. Neoformans provenientes de pacientes inmunosuprimidos que se encuentran conservadas en la micoteca del
INS.
- Estandarizar las técnicas para determinar las actividades de las enzimas nitrato reductasa y fenoloxidasa en cepas de C.
neoformans.
- Evaluar el comportamiento cultural de las cepas de Cryptococcus sobre el agar CGB para establecer la diferenciación entre la var. neoformans y
gattii.
MATERIAL
BIOLÓGICO
Se evaluaron 18 cepas de Cryptococcus neoformans aisladas de muestras de LCR que fueron remitidas al Laboratorio de Micosis Oportunista del INS desde abril de 1997 hasta diciembre de 1998. Todas las cepas procedían de pacientes con SIDA. Sólo se señala la edad en 12 pacientes cuyo promedio fue de 35,4 años (18-72-72 años). En 16 pacientes se registró el sexo, hallándose 12 varones y 4 mujeres. Como controles se emplearon las cepas H-0058- 620 de Cryptococcus neoformans var. Neoformans serotipo A y la H-0058-628 de Cryptococcus neoformans var. gattii serotipo B, procedentes del Grupo de Microbiología del Instituto Nacional de Salud de Colombia. Además, se utilizó un aislamiento autóctono de Candida
albicans, dentificado en el Instituto Nacional de Salud.
IDENTIFICACIÓN DE
LA ESPECIE DE C. NEOFORMANS
Se realizaron las siguientes pruebas recomendadas: tinción negativa con Tinta China, prueba del tubo germinal18, formación de hifas,
pseudohifas, clamidosporas y blastoconidias19, formación de película en caldo sabouraud dextrosa20, tolerancia a la temperatura de
37ºC21, prueba de la ureasa, asimilación de carbohidratos: glucosa, lactosa, sacarosa, galactosa, maltosa y rafinosa18, reducción rápida del nitrato 22 y presencia de la enzima fenoloxidasa (Canelo C, Casquero J. Comunicación personal).
DETERMINACIÓN DE
LA VARIEDAD DE CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS
Se tomó una asada de cada cepa y se inoculó en tubos que contenían el agar
CGB, se incubaron a 28ºC por cinco días, realizando lecturas diarias. Una prueba positiva fue indicada por un cambio del color inicial amarillo oro
(pH = 5,8 ± 0,1) hacia un color azul cobalto (pH =7,0) del medio. Si éste permaneció con su color inicial, se trató de una prueba negativa11.
En 100,0% de las cepas se observó levaduras redondas poco encapsuladas mediante la tinción negativa con tinta china; desarrollo a
37ºC, incapacidad para formar tubo germinativo en suero humano, no formaron hifas o seudohifas ni clamidosporas en agar Corn
Meal- Tween 80 y tampoco formaron película en caldo sabouraud dextrosa. Todas las cepas fueron ureasa positivas y carecieron de la enzima nitrato
reductasa. El 100% de los aislamientos asimiló la glucosa, galactosa, maltosa y sacarosa, pero no asimilaron la lactosa y sólo 38,8% (7/18) de los aislamientos asimiló la
rafinosa.
Las 18 cepas de C. neoformans fueron tipificadas como var. neoformans sobre el medio
CGB, después de 5 días de incubación a 28ºC. La tipificación de la variedad de las cepas control de C. neoformans se realizó satisfactoriamente y se comprobó que la cepa control serotipo A y todas las cepas de origen clínico de C. neoformans fueron incapaces de crecer y modificar el color inicial (amarillo oro) del agar CGB clasificándolas como var.
neoformans; en cambio, la cepa control serotipo B creció e hizo virar levemente el color (1+) del medio en el segundo día de incubación, en el tercer día cambió el medio hacia un color azul verdoso (2+), y en el cuarto día el agar se tornó azul cobalto con un fondo azul verdoso (3+), y que se mantuvo sin ninguna
variación hasta por lo menos 2 semanas de incubación a
28ºC comprobándose que esta cepa fue var. gattii (Figura
1).
|
Figura
1.-
Diferencia bioquímica de C. neoformans var. gattii (izquierda), C.
neoformans var neoformans (derecha), mediante el uso de agar
canavanina glicina azul de bromotimol (CGB).
|
|
|
|
|
El valor del pH = 5,8 ± 0,1 del medio es crítico, por lo que se debe ser preciso en su determinación. Un pH menor que lo indicado puede darnos resultados indeterminados (2+) para la variedad
gattii.
El tamaño del inóculo y la edad del cultivo no fueron factores críticos en la determinación de la variedad. No se halló ningún resultado indeterminado (2+) en los 18 aislamientos de C. neoformans var.
neoformans.
El 100,0% de las cepas de origen clínico provino de pacientes con SIDA, ya que este síndrome ha llegado a ser el principal factor predisponente para la
criptococosis. Esta última es la cuarta causa de infección en pacientes con SIDA y se manifiesta en cerca de un tercio de estos pacientes1,23. La incidencia de infección criptocócica en ellos ha sido estimada en 6,0 a 15,0% en los Estados Unidos, Europa Occidental y Australia; sin embargo en África meridional el cuadro meníngeo ocurre en 15,0 a 30,0%12.
Las edades de los pacientes de los cuales se aisló C. neoformans refleja que la mayoría de los casos ocurren entre los 20 a 39 años tal como lo observado en estudios realizados en Colombia y Argentina16,24. El predominio masculino sobre el femenino encontrado en 16 pacientes, estuvo en una proporción de 3:1, coincidiendo con lo observado en los Estados Unidos de América antes de la era del SIDA. En aquella década la criptococosis ocurrió 2 ó 3 veces más en varones que en mujeres. Actualmente en los Estados Unidos aproximadamente igual porcentaje de cada sexo es infectado con C. neoformans6.
El tamaño de la cápsula está determinada por características genotípicas de cada cepa y por las condiciones de crecimiento. Las células encapsuladas de C. neoformans no son fagocitadas12. Los estudios sobre el rol de la cápsula en la virulencia de este hongo no han explicado aún porque C. neoformans es el único patógeno verdadero en el género Cryptococcus en el cual todos los miembros de su especie son normalmente encapsulados25.
El 38,8% de las cepas asimiló la rafinosa. Esto verificó que la asimilación de este azúcar es variable en cada cepa.
La ausencia de la enzima nitrato reductasa fue verificada mediante una prueba rápida de reducción del nitrato, en la que se optimiza el pH entre 5,8 a 6,5; se usa una mayor concentración del sustrato (nitrato de potasio) para evitar resultados falsos negativos; una temperatura de
45ºC y aumento de la permeabilidad celular producido por el cloruro de benzalkonio (22).
En América del Sur, se ha informado el aislamiento de la variedad gattii en pacientes no-SIDA16,17,23,24. En el mundo sólo se ha informado de cuatro casos de SIDA asociados a criptococcosis causada por la var.
gattii: en Zaire27, Canadá28, Estados Unidos de América29 y Brasil30. Por lo que se plantea la posibilidad que los pacientes con SIDA no están expuestos a esta variedad porque no están en contacto con árboles del género Eucalyptus5.
Estos antecedentes plantean la búsqueda de reservorios para la var. gattii en nuestro país, así como también estudios de tipo epidemiológico para conocer la distribución de ambas variedades.
No obstante que los casos de criptococosis causados por la var. gattii son infrecuentes, debemos estar en capacidad para su correcta identificación, logrando aprovechar los datos clínico-epidemiológicos de cada caso esporádico. La tipificación inmediata de algún aislamiento de esta variedad, permitirá un cuidadoso seguimiento de la enfermedad producida por este hongo, ayudando a conocer más las diferencias de la expresión clínica entre ambas variedades. Se ha establecido que la var. gattii se encuentra en huéspedes aparentemente sanos y que 90,0% de las infecciones por C. neoformans var. neoformans ocurren en huéspedes
inmunosuprimidos; además, la mortalidad entre los pacientes con la variedad neoformans fue alta, mientras ninguno con la variedad gattii falleció, pero frecuentemente tuvieron secuelas neurológicas que requirieron cirugía y terapia prolongada31.
Las diferencias en la incidencia y expresión de la enfermedad clínica sugieren potenciales diferencias importantes en la patogénesis y en las interacciones huésped-hongo causadas por ambas variedades de C. neoformans26.
La incidencia de criptococosis en las Américas no es conocida, pero si tenemos en cuenta que en los Estados Unidos este valor fluctúa entre 5,0-10,0%, y en Argentina sería 4,6%24, el número de casos acumulados de criptococosis en nuestro país debe ser considerable y debe empezar a conocerse.
* El 100,0% de las cepas conservadas (18) en la micoteca del INS fueron Cryptococcus neoformans var.
neoformans.
* La prueba de la reducción rápida del nitrato, en 10 minutos y a 45ºC, demostró la ausencia de la enzima nitrato reductasa en todas las cepas de
C.neoformans, siendo recomendable su empleo.
* Se comprobó la especificidad del agar CGB para la diferenciación bioquímica de las variedades de C.
neoformans.
AGRADECIMIENTOS
Al Instituto Nacional de Salud de Colombia por habernos proporcionado las cepas controles de C. neoformans var. neoformans y var.
gattii.
| ________________________ |
|
|
1 Facultad de Ciencias Biológicas - Universidad Nacional Mayor de San Marcos.
2 División de Micología, Centro Nacional de Laboratorios en Salud Pública, Instituto Nacional de Salud.
Correspondencia:
Carlos Canelo. Instituto Nacional de Salud.
Calle Cápac Yupanqui 1400, Lima 11, Perú. Apartado Postal 471.
Telf.: (0511) 4719920 - Fax: (0511) 4710179.
Email: micolog@ins.sld.pe
Tabla de contenido
|
