IDENTIFICACIÓN DE UNA NUEVA PROTEÍNA EN Leishmania (Viannia) peruviana
De los Santos, Maxy1 y Montoya, Ysabel1
Introducción Las leishmantasis son un grupo de infecciones de la piel. membranas mucosas y vísceras que afectan entre 12 a 14 millones de personas en el mundo con una incidencia de dos millones de nuevos casos anuales y 368 millones de personas en riesgo de infección en el mundo1. En el Perú la enfermedad presenta dos formas clínicas asociadas a parásitos del complejo braziliensis: la leishmaniasis cutánea andina (LCA) conocida como "uta" causada por L. (V) periviana y la. leishmaniasis selvática (LS), conocida en su forma mucocutánea corno "espundia" la cual es causada por L. (V) braziliensis. La "uta" causa lesiones cutáneas benignas. responde al tratamiento clínico o autocura Y se presenta en los valles interandinos, mientras que la "espundia" causa lesiones mucocutáneas metastásicas desfigurantes y se distribuye en la selva2. El interés y factibilidad de conocer nuevos genes relacionados con la respuesta humoral llevó a la construcción de una biblioteca de expresión en fago lgt11, a partir de promastigotes en fase logarítmica temprana de L. (V) peruviana cepa MHOM/PE/84/LC26 lo que permitió clonar, aislar y caracterizar algunos genes aún no identificados en el parásito3. Uno de los clones de la biblioteca de
cDNA denominado T26-U3, parcialmente secuenciado a nivel de nucleótidos, presentó
homología parcial con las secuencias que codifican las proteínas acídicas ribosomales
de tipo P2 de L. (L.) infantum y con las de tipo P1 de Mus musculus y Homo sapiens.
Nuestro propósito fué realizar el análisis de la secuencia nucleotídica completa y
deducir la secuencia aminoacídica Para poder establecer el tipo de proteína P
codificada. Material y métodos MATERIAL BIOLÓGICO Se utilizó el clon T26-U3 que porta el inserto de ADN de Leishmania el cual ha sido clonado en el fago l gt11. La propagación de los fagos fue realizada usando la bacteria E. coli Y 1090 mientras que para el mantenimiento y crecimiento de los plásmidos, se utilizó la cepa JM 109. Se usaron los plásmidos pUC18EcoRI/BAP(Pharmacia) y pCR-Script Amp SK(+) (Stratagene) para el subclonamiento. OPTIMIZACIÓN DEL PCR PARA EL CLON T26-U3 El ADNc del clon T26-U3 fue amplificado por PCR utilizando los primers específicos para ?gt11 forward. 5’ GGTGGCGACGACTCCTGGA GCCCG 3’ y reverse, 5’ TTGACACCAGACCAACTGGTAATG 3’ a partir de una placa de lisis del fago crecido en E coli Y 1090. El buffer de reacción contuvo 1 U de enzima AmpliTaq DNA Polimerasa y 2 mM de MgCl2. Las condiciones usadas durante la amplificación in vitro fueron 95°C por 30 s, 40°C por 1,5min. y 72oC por 2 min. + 2s/ciclo durante 30 ciclos. Al producto amplificado se le denominó PCR-U3. SUBCLONAMIENTO EN EL pUC18 El producto PCR-U3 fue cortado con 25 U de la endonucleasa EcoRl Para permitir su subclonarniento mediante ligación, en el vector pUC 18 EcoRI/BAP (Pharmacia Biotech), utilizando 2U de T4 DNA licasa. Las mezclas de ligación fueron precipitadas usando etanol absoluto. El ADN purificado fue usado para transformar E. coli JM 109 por electroporación con un pulso de 11.8 kV. Las colonias recombinantes fueron seleccionadas para una maxipreparación de ADN plasmídico utilizado en el secuenciamiento temático basado en una modificación del método de terminación de cadena mediado dideoxinucleósidos trifosfatos (ddNTPs)9. Los plásmidos recombinantes fueron denominados pUC 18U3. SECUENCIONAMIENTO AUTOMÁTICO ADN El ADN fue secuenciado usando el colorante fluorescente cianina (Cy5) (kit Auto Read Pharmacia): Universal 5’-Cy5-d [CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT]-3’y reverso5’-C y 5-d [CAGGAAACAG CTATGAC]-3’. Inicialmente, cinco µg de ADN de pUC 18-U3 fueron denaturados con NaOH 0,4 N. Después, el ADN de simple hebra fue precipita o con acetato de Na 0, 12M pH 4,8, agua MiliQ y etanol absoluto a -80oC. Posteriormente, se centrifugó y el ADN fue centrifugado y lavado con etanol al 70% y resuspendido en agua MiliQ, para agregarle los primers e incubarlo a 65oC, 37oC y a temperatura ambiente. Finalmente se adicionó DMSO, la enzima T7 DNA Polimerasa, y las mezclas; se dividieron para añadirles los ddNTPs. Antes de colocar las muestras en el gel de secuenciamiento (Ready Mix Gel-Pharmacia), fueron calentadas a 90oC. La electroforesis se realizó a 570C por 600 min. Un láser clase 1 de He-Ne excitó el Cy5 a medida que las muestras migraban, la luz emitida fue fotodetectada y digitalizada para su procesamiento por computadora. PROGRAMAS DE ADN Las secuencias nucleotídicas obtenidas fueron analizadas utilizando la interfase BLAST. También se usaron los programas DNA Strider 1,0 para hacer mapas de restricción, hallar marcos de lectura e hidrofobicidad y SeqEd 1.0.3 para el alineamiento múltiple de secuencias aminoacídicas. Resultados SECUENCIONAMIENTO PARCIAL DE ADN Y ANÁLISIS DE REESTRICCIÓN DEL CLON T26-U3 El producto de amplificación de aproximadamente 750 pb referido como PCR-U3 fue cortado con la enzima Eco RI obteniéndose un fragmento de -700 pb el cual fue subclonado en PUC18 (Fig. 1). La secuencia parcial del recombinante pUC18-U3, asociado al alto contenido de GC, sugirió que contiene 39 nucleótidos que codifican los últimos 13 residuos aminoacídicos del extremo C-terminal de una proteína homóloga a las acídicas ribosomales de tipo P2 de L. (L.) infantum (LiP y LIP’)10 y a las acídicas ribosomales de tipo P1 de Cladosporium herbarum, Alternaria alternata, Caenorhabditis elegans, Mus musculus y Homo sapiens. Por lo tanto para completar la secuencia se realizó el mapa de restricción del vector pUC18. del reconibinante pUC18-U3, de LiP, de LiP’ y de las proteínas P2 de L. (V.) braziliensis y L. (V) peruviana11. La enzima de restricción TaqI fue seleccionada por generar el menor número de fragmentos; (Fig. 2), siendo el de -416 pb subclonado en pCRScript Amp SK (+) a fin de completar la secuencia nucleotídica (Fig. 3). LA SECUENCIA DEL CLON T26-U3 CODIFICA LA PROTEÍNA ACÍDICA RIBOSOMAL DE TIPO P1 DE L. (V)
La secuencia nucleotídica completa del clon T26-U3 abarca 676 pb, conteniendo un marco de lectura que codifica una proteína de 107 aminoácidos. La región 5’ no codificante del clon no posee el miniexón y la región 3’ no codificante presenta una cola de poliA. La secuencia del T26-U3 presenta identidad parcial con los genes de las proteínas LiP’ y LiP de L. (L.) infantum y e tramo G-GTG-(GT)11, -A-GG-TG-G-G de T26-U3 tiene identidad parcial con la región 3’ no codificante de Lip’. Cuando se comparó la secuencia aminoacídica del clon T26-U3 mediante BLAST, se confirmó que codifica una proteína homóloga a las proteínas P1 de diversos eucariotes12. Así se encontró 71,43% de homología total (51,02% identidad, 20,41% cambios conservativos) con la proteína P1 de T cruzi (TcP1). Por lo tanto T26-U3 contiene la proteína acídica ribosomal de tipo P1 de L. (V) peruviana a la que se denomino LpP1. La secuencia de LpP1 está disponible en la base de datos GenBank/EMBL/DDBJ con código AF045249 desde febrero de 1998. Discusión La secuencia nucleotídica descrita, codifica la proteína acídica ribosomal de tipo P1 de L. (V) peruviana (LpP1). lo cual constituye la primera información sobre la proteína P1 en el género Leishmania. Hasta el momento los pocos estudios sobre dominios conservados en las proteínas-P de tripanosomátidos, han sido incompletos y contradictorios4,13 Por ello el análisis comparativo de este gen con otras 14 secuencias aminoacídicas de las proteínas P1 de distintos eucariotes. proporcionó datos confiables de las regiones de LpP1. Las regiones conservadas en LpP1 pueden sostener el hecho que la proteína conservaría su función estructural como parte del pedúnculo ribosomal de L. (V.) peruviana. al lado de otras proteínas P14,15, de las cuales solo se han descrito las de tipo P2 en L. (L.) infantum10. Una característica de importancia inmunológica es la región hidrofílica adyacente al extremo C-terminal de la LpP1. que al estar expuesta al reconocimiento de los anticuerpos, podría contener el principal epítope antigénico lineal de LpP1. de modo similar a la proteína P2 de Artemia salina, donde el epítope lineal en la zona hidrofílica es reconocido por los autoanticuerpos del lupus eritematoso sistémico (LES)8. Además la conservación del dominio de máximo valor de hidrofilicidad, podría representar parte del principal epítope lineal antigénico de LpP1. de forma similar a los epítopes de la proteínas P2 de L (L.) infantum que no se ubican en la secuencia consenso de la región C-terminal16. En conclusión podemos señalar que la secuencia nucleotídica completa del clon T26-U3 contiene codificada la proteína acídica ribosomal de tipo P1 de L. (V) peruviana (LpP1). Dicha secuencia presenta identidad parcial con las secuencias de los genes de las proteínas LiP’ y LiP de L. (L.) infantum. Además el tramo G-GTG-(GT)-A-GG-TG-G-G de LpP1 tiene identidad parcial con la región 3’ no codificante de LiP’ de L.(L.) infantum, mientras la secuencia aminoacídica de LpP1 tiene 71.43% de homología con la proteína TcP1 de T cruzi.
________________________________________________ 1 División de Biología Molecular, Centro Nacional de Laboratoios de Salud Pública, Instituto Nacional de Salud Pública
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