| Rev Med Exp.
Vol. 14 • Nº 2 • 1997 |
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UTILIZACIÓN DE HEMATÍES DE
PRIMATES SUDAMERICANOS
EN LA PRUEBA INHIBICIÓN DE HEMOAGLUTINACIÓN PARA
EL DIAGNÓSTICO DEL VIRUS DEL SARAMPIÓN
Palacios Rosa1, Montoya Enrique2,
Torres Ivonne1, Ortiz Ana Cecilia1
Resumen.-
La utilidad del empleo de hematíes de especies sudamericanas de primates no humanos
durante pruebas de hemoaglutinación e inhibición de la hemoaglutinación con virus
sarampión ha sido evaluada. El estudio se llevó a cabo en 18 meses, habiéndose iniciado
a fines de 1995 y terminado a comienzos de 1997.
Se obtuvo muestras de sangre de primates en solución citratada, en la sede del Instituto
de Investigaciones Tropicales y de Altura en Iquitos (IVITA) y en el Parque de las
Leyendas en Lima; el procesamiento se realizó en el Laboratorio de Virología del
Instituto Nacional de Salud. Se analizaron muestras de 22 primates de 8 especies de la
Amazonía peruana, probándolos en paralelo con hematíes patrón de monos Rhesus
y Cercophitecus, por hemoaglutinación con antígeno purificado de virus
sarampión. Las especies Saimiri boliviensis peruvianus y Sanguinus mystax
exhibieron afinidad hemaglutinante con el virus, siendo ésta parcial o incompleta y no
persistente, con elusión espontánea a los 30 minutos. Se hizo ensayos de inhibición de
hemoaglutinación con sueros pareados de personas que estuvieron con infección
sarampionosa 10 a 15 días antes de obtener la segunda muestra. No se recomienda su empleo
rutinario durante encuestas serológicas por IHA, dados los sesgos en lecturas e
interpretación que podrían presentarse.
Palabras clave: Hematíes, primates, hemoaglutinación, sarampión.
Abstract.-
The usefullness of red blood cells (rbc) of south-american non-human primates in
hamegglutination and the hemagglunation inhibition with measles virus was evaluated in an
18 months study finished at the earlier's in 1997
Primate blood samples were obtained in a citrated solution at the Instituto de
Investigaciones Tropicales y de Altura (IVITA) in Iquitos, and at the Parque Las Leyendas
Zoo in Lima. Samples obtained from 22 monkeys of 8 different species from the Peruvian
Amazon Region were tested in parallel with standard rbc of Rhesus an Cercopithecus
monkeys through hemagglutination with measles virus purified antigen. Rbc of the species Saimiri
boliviensis peruvianus and Sanguinus mystax showed hemagglutinant affinity
with the virus, being this partial or incomplete and nonpersistent, with spontaneous
elution after 30 minutes. Hemagglutination inhibition assays were performed with paired
sera samples obtainet from patients suffering measles infection with a 10 to 15 days
interval. The utilization of Peruvian non-human primates rbc in IHA used for serological
surveys is not recommended due to the possible biases in reading and interpretation of
results.
Key words: Red blood cells, primates, hemagglutination, measles. |
Introducción.-
La necesidad de contar con una técnica simplificada para estudios de prevalencia de
anticuerpos al sarampión, que pueda aplicarse en trabajos de campo y con reducidos costos
impulsó la idea de utilizar hematíes de primates del Perú en pruebas de inhibición de
la hemoaglutinación para el diagnóstico de sarampión. Los propósitos generales de la
investigación han sido estudiar la factibilidad del empleo difundido de una técnica
sencilla, de alta especifidad y bajo costo para el diagnóstico del sarampión,
posibilitando el empleo de recursos naturales del país aplicados al área de la salud
pública.
La hemoaglutinación es una prueba biológica que aprovecha la característica estructural
y fisiológica del virus sarampión para evidenciarlo e identificarlo preliminarmente en
ensayos sencillos y prácticos de laboratorio y para cuantificarlo con el propósito de
ser utilizado en pruebas rutinarias de laboratorio; para ello se requiere contar con los
hematíes de los primates correspondientes [1].
Las pruebas de hemoaglutinación (HA) e inhibición de la hemoaglutinación (IHA)
utilizadas desde los comienzos de la moderna virología aprovechan la particular capacidad
del virus de unirse a la membrana de los eritrocitos de ciertas especies de primates y su
contraparte serológica lo utiliza como un índice de reactividad para la evaluación de
niveles de anticuerpos [2,4,5].
Aún cuando se considera de baja sensibilidad relativa en comparación a pruebas de
inmunoensayo y neutralización, se le utiliza en valoraciones de tamizaje durante estudios
epidemiológicos por su buen nivel de especifidad.
Los objetivos principales del estudio fueron:
Validar el empleo de hematíes de
especies de primates no humanos de la región amazónica peruana en pruebas de
hemoaglutinación para titulación de virus sarampión.
Estandarizar las pruebas de
hemoaglutinación e inhibición de la hemoaglutinación para virus sarampión, empleando
hematíes de especies de primates de la Amazonía peruana comparándolas con hematíes
patrón.
Validar el uso de hematíes de especies
de primates no humanos durante encuestas serológicas por prueba IHA.
Estudiar la caracterización de
receptores presentes en la membrana de los hematíes utilizados.
Materiales y Métodos.-
Se preparó antígeno de virus sarampión a partir de una cepa vacunal Enders Lote 2,
1964, existente en el laboratorio propagada en cultivo celular VERO (riñón de mono verde
Cercophitecus aethiops) con un título neutralizante de 10-3 [2]. Se
empleó el método por gradiente de densidad de sucrosa para la purificación y
concentración de antígeno. También se utilizó antígeno crudo obtenido de lisado de
cultivos celulares infectadas con virus vacunal.
Se utilizó hematíes de 22 individuos pertenecientes a 8 especies distintas: Aotus
sp., Aotus nancymae, Lagotrix lagotrichia, Saimiri scireus macrodon, Saimiri boliviensis
peruvianus, Saimiri sp., Saguinus mystax y Saguinus fuscicollis.
Los hematíes patrón fueron obtenidos por gestiones ante el Patronato del Parque de Las
leyendas, en donde se crían monos de las especies Maccacus rhesus y Cercophitecus
aethiops, la obtención de sangre, estuvo a cargo de personal calificado de las
respectivas instituciones. Se hizo por punción venosa, previa aplicación de Ketalar®
como tranquilizante obteniéndose de 2 a 4 mL de sangre total en tubos con solución
anticoagulante estéril.
El transporte se hizo en condiciones de frío moderado y protegidas de acción mecánica.
Se realizó la prueba de hemoaglutinación por micrométodo empleando volúmenes a la
décima. Las lecturas a la hora de incubación a 37°C.
Para hematíes de referencia se observa estabilidad de la reacción a 4°C hasta por 12
hrs.
Se hizo a prueba de inhibición de hemoaglutinación a 40 sueros previamente probados por
ELISA con IgG comercial, 20 de ellos pareados. El procedimiento incluyó tratamiento para
remoción de inhibidores no específicos y aglutininas no específicas.
Resultados.-
En las tablas 1 y 2, se presentan los resultados obtenidos en las pruebas realizadas. La
concentración del antígeno con sucrosa incrementa en 35% el rendimiento con relación al
antígeno crudo según se deduce de los títulos obtenidos.
Se encontró satisfactorio el manejo de las variables independientes: concentración del
antígeno. Es necesario aún efectuar mayores ajustes para las variables suspensión de
hematíes y temperatura de incubación.
TABLA N° 1
Cuadro resumen consolidado de resultados de la prueba de IHA para 40 sueros en 4 ensayos. |
| Hematíe de Mono |
Título de los
sueros |
| < 1:10 |
< 1:20 |
< 1:40 |
< 1:80 |
< 1:160 |
< 1:320 |
< 1:640 |
| Total |
% |
Total |
% |
Total |
% |
Total |
% |
Total |
% |
Total |
% |
Total |
% |
C. aethiops
M. rhesus
C. boliviensis
peruvianus
S. mystax |
19
19
20
19 |
47.5
47.5
50.0
47.5 |
0
0
1
3 |
-
-
2.50
7.50 |
5
5
11
16 |
12.5
12.5
27.5
37.5 |
5
5
6
3 |
12.5
12.5
15.0
7.5 |
6
7
2
0 |
12.5
17.5
6.0
- |
6
4
0
0 |
15.0
10.0
-
- |
0
0
0
0 |
-
-
-
- |
En primera instancia se observó afinidad
hemaglutinante diversificada para con hematíes de varias de las especies ensayadas: Aotus
nancymae, Saimiri boliviensis peruvianus y Saimiri scireus macrodon,
y ligeramente para Lagotrix.
En una segunda etapa, y en presencia de hematíes de referencia de Maccacus rhesus
y Cercophitecus aethiops, se encontró reproducibilidad únicamente para Saimiri
además también la especie Saguinus exhibió afinidad motivo por el que en un
tercer ensayo se probaron las especies Saimiri scireus macrodon, Saimiri
boliviensis peruvianus y Saguinus mystax, observándose afinidad, con
elusión espontánea prematura, lo cual sugiere que la cinética de hemoaglutinación
sigue otro.
TABLA N° 2
Prueba de Inhibición de Hemaglutinación para detección del virus del sarampión
utilizando hematíes de mono: efecto de las diluciones de antígeno Viral. |
Hematíes de
mono |
Diluciones del
Antígeno Sarampión purificado |
| S/D |
1/2 |
1/4 |
1/8 |
1/16 |
CC |
C. aethiops
S. scireus macrodon hembra código 34
A. Scireus macrodon hembra código 200
S. boliviensis peruvianus código 302
S. mystax macho código 159
S. boliviensis peruvianus hembra código 75
S. scireus macrodon hembra código 25
S. mystax hembra código 3906
S. mystax hembra código 3939
S. boliviensis peruvianus macho código 1491
S. boliviensis peruvianus hembra código 50
M. rhesus
S. scireus macrodon macho código 20
S. boliviensis peruvianus macho B253 |
+
(+)
(+)
+
+
(+)
(+)
(+)
+
+
+
+
(+)
(+) |
+
O
O
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O
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+
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(+)
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(+)
+
O
O |
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
(+)
O
O |
+ : Positivo para
Hemaglutinación
O : Negativo para Hemaglutinación
(+) : Débilmente Positivo |
Discusión.-
Se ha reportado [17] que recientes aislamientos del virus sarampión no aglutinan
hematíes de mono verde africano. Asimismo se ha observado disminución de la capacidad
hemaglutinante después de varios pasajes en células VERO. En un estudio [22] se hizo una
prueba de inmunofluorescencia de la membrana de las células infectadas, revelando que la
disminución de la actividad de unión a los hematíes del mono verde africano no se
debía a variaciones en la expresión de la proteína hemaglutinina sobre la superficie
celular, sino a la existencia de otra proteína viral diferente que contribuye a la unión
del virus sarampión a los hematíes del mono verde africano y que probablemente funcione
también para otras especies de hematíes. En el caso de nuestra cepa, la capacidad
hemoaglutinante del virus. exacerbada por procedimientos de purificación de antígeno
[19], es indudable.
La identificación para la unión hemaglutinina viral-receptor del hematíe se da a nivel
de la molécula CD46 o proteína cofactor de membrana, ligada al complemento [12], ausente
en hematíes de humanos pero presente de manera análoga en los hematíes de primate, las
variaciones en la glicosilación del carbohidrato de esta glicoproteína generará las
diferencias en la afinidad para la unión reactiva. Para los primates peruanos ésta se ha
presentado de manera diversificada e inestable probablemente debido a las diferencias en
la distribución de la molécula análoga al CD46 que se encuentra en las superficies
celulares de las diversas especies de hematíes de primates [5].
Las lecturas deben realizarse en un máximo de una hora a 37°C observándose importantes
cambios en los patrones de aglutinación a tiempos mayores de incubación a la misma
temperatura, las pruebas de inhibición de la hemoaglutinación (IHA) para sueros simples
o pareados detectan anticuerpos totales y esencialmente indican infección pasada o
contacto previo con virus vacunal o salvaje por parte de los individuos muestreados [1].
El empleo de sueros pareados tiene significado diagnóstico para infecciones activas.
Habiéndose trabajado con un número escaso de muestras, cuarenta sueros comprobadamente
positivos, negativos o con valores límite de anticuerpos a sarampión, mediante pruebas
ELISA IgG, hallan su validez básicamente como instrumentos para evaluación de la
utilidad de los hematíes durante pruebas IHA, en lugar de servir para estimaciones
estadísticas.
Se han observado ciertas reacciones inespecíficas para algunos de los sueros ensayados
con hematíes de Saimiri y Sanguinus posiblemente ocasionadas por pre tratamiento
insuficiente, evento que se presenta en muy pocos casos.
Los títulos IHA para los sueros probados fueron relativamente bajos, comparativamente con
los resultados por ELISA, mas aún al emplear los hematíes de prueba, observándose
reproducibilidad de los resultados en las lecturas IHA para casos de positivos fuertes y
claramente negativos, lo cual verifica su buena especifidad dentro, de los valores
límites, pero se encuentran faltas de sensibilidad.
Conclusiones.-
El presente estudio ha ratificado la utilidad de los hematíes de monos del Viejo mundo,
mantenidos en cautiverio, de las especies Maccacus rhesus y Cercophitecus
aethiops, y ha despertado la expectativa para su utilización rutinaria. En cuanto a
la utilización de los hematíes de las especies peruanas de primates de la Amazonía, se
considera posible, ya que se ha observado afinidad, aunque inestable, predominando los
patrones de hemoaglutinación parcial o incompleta, lo cual puede ser debido a escasa,
desigual o limitada distribución de los receptores CD46 u otros análogos en las
membranas celulares de estos eritrocitos. En condiciones controladas de tiempo de vida
media de la unión hemoaglutinante (según cinética) de hemoaglutinación, pueden ser
utilizadas en pruebas de titulación de antígeno sarampión, mas no en pruebas de
inhibición de hemoaglutinación porque cabe la posibilidad de captar falsos negativos en
casos de valores límite.
Bibliografía
__________________________________________________
1. Laboratorio de virus inmunoprevenibles. Centro
Nacional de Laboratorios de Salud Pública, Instituto Nacional de Salud, A.P. 451, Lima,
Perú.
2. IVITA - Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Iquitos, Perú.
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