ESTUDIO BIOQUÍMICO DEL VENENO DE LA SERPIENTE
Bothrops hyoprorus

Bonilla César¹, Zavaleta Alfonso²

Introducción.-

Las serpientes venenosas del género Bothrops, son responsables de la mayoría de los accidentes ofídicos registrados anualmente en el Perú, los que se caracterizan por presentar hemorragia y necrosis local, sangrado por coagulopatía de consumo, hipotensión, shock y muerte [1,2,3]. El accidente ocurre principalmente en áreas rurales donde la cobertura de salud es deficitaria [4,5,6,7,8]. Bothrops hyoprorus "jergón" es una serpiente reportada en selva baja (Loreto), que alcanza a medir 100 cm, sindicada como responsable de casos de envenenamiento en humanos, careciéndose de estudios sobre la bioquímica y farmacología de su veneno [9].

Recientemente se ha relacionado la actividad de Fosfolipasa A con la miotoxicidad [11], la neurotoxicidad y la letalidad del veneno [10,12,13,14], obteniéndose técnicas para la estandarización de antivenenos comerciales a través de la medición de la actividad de la Fosfolipasa A. Asimismo, se ha correlacionado la potencia antiletal de los sueros con la inhibición específica de dicha actividad [1,15].

La hemólisis in vivo postulada en la década de los 40 para los venenos, en el género Bothrops, es poco frecuente. Los estudios efectuados con venenos de otras especies han mostrado la existencia de factores líticos directos en los venenos de elápidos pero no en venenos de vipéridos de los géneros Bothrops y Lachesis [16,17,18]. La hemólisis in vitro (indirecta) es reportada en muchos venenos ofídicos. El factor responsable (factor lítico indirecto) ha sido asociado a la presencia de la enzima Fosfolipasa A2 (EC.3.1.1.4) en el veneno, la que actúa sobre una fuente exógena de lecitina y genera lisofosfátidos con acción lítica sobre los eritrocitos [2,19-24].

En este estudio se evalúan las actividades: hemolítica, citotóxica y se caracteriza la actividad fosfolipásica del veneno cristalizado de Bothrops hyoprorus, y sus fracciones obtenidas mediante filtración en el Sephadex. Se obtiene una fracción purificada (FIIa1).

Material y Métodos.-

VENENO OFÍDICO:

Se utilizó veneno desecado cristalizado obtenido en el serpentario del Instituto Nacional de Salud en Lima, a partir de ejemplares adultos de B. hyoprorus (Loreto, Perú).

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS:

El contenido proteico del veneno fue estimado por el método de Lowry modificado por Stauffer25 usando como estándar albúmina sérica bovina (BSA) (1mg/mL=0.66 Abs 280nm).

FRACCIONAMIENTO DEL VENENO:

Para los ensayos, el veneno cristalizado fue reconstituido con una solución de acetato de sodio 50mM pH 3, centrifugándolo por 10 minutos a 3000 r.p.m. antes de su uso. 100 mg de veneno cristalizado de B. hyoprorus fueron diluidos en 1mL de solución de acetato de sodio 50mM pH 3, centrifugado por 10 minutos a 3000 r.p.m. y aplicado a una columna de 90 x 1.8 cm de gel Sephadex G-100 Superfino (Pharmacia, Suecia), calibrada y eluída a temperatura ambiente con buffer acetato de amonio 0.2M pH 8.4 a flujo constante de 6.3 mL/ hora. Las fracciones eluidas (2.1mL/tubo) se colectaron en un colector de fracciones y la absorbancia a 280nm fue registrada espectrofotométricamente.

La filtración en Sephadex G-50 Fino se realizó en una columna de 100 x 1.0cm de gel Sephadex G-50 Fino (Pharmacia, Suecia), calibrada y eluida a temperatura ambiente con buffer bicarbonato de amonio 200 mM pH 8.4 a flujo constante de 6.0 mL/ hora. Las fracciones eluidas (2.0 mL/tubo) se recogieron en un colector de fracciones, registrándose su absorbancia a 280 nm.

DETERMINACIÓN DEL PESO MOLECULAR APARENTE:

El peso molecular aparente de las fracciones fue estimado mediante filtración en gel Sephadex y electroforesis en gel de poliacrilamida:

a) Luego de la filtración en columna de gel Sephadex G-100 s.f. se grafica el logaritmo del peso molecular de las fracciones eluídas versus la constante de distribución (Kav=Vi/Vo) de las fracciones y estándares proteicos de peso molecular conocido: Azul de dextrano (2000 Kd, Pharmacia), Albúmina Sérica Bovina (66 Kd, Sigma), Anhidrasa Carbónica (29 Kd, Sigma), Citocromo C (12.4Kd, Sigma) y Aprotinina (6.5 Kd, Sigma).

b) Electroforesis en gel de Poliacrilamida en condiciones desnaturalizante S26 (SDS-PAGE). Se empleó geles verticales de SDS-PAGE al 14% en buffer Tris-Glicina (0.25M-1.92M, SDS 1%) bajo corriente constante de 13 mA durante 5 horas. Se utilizó estándares similares a los descritos para la técnica de filtración en gel.

ISOELECTRO ENFOQUE:

Para la determinación del punto isoeléctrico de las fracciones se utilizó la metodología empleada por Berheimer, Weinstein y Linder [27]. Para detectar la presencia de la actividad de Fosfolipasa y su punto isoeléctrico se vertió sobre el gel una suspensión de agarosa-yema de huevo la cual se gelifica y luego se incuba la placa a 50°C. El aclaramiento de la suspensión de yema de huevo, confirma la presencia de Fosfolipasa.

ACTIVIDAD HEMOLÍTICA [16,28]:

La actividad hemolítica del veneno fue ensayada en eritrocitos humanos lavados obtenidos de donadores O Rh positivos y mantenidos en suspensión con tampón glicina -NaCl (glicina 0.1 M en cloruro de sodio al 0.6%) a pH 5.8. La actividad hemolítica directa e indirecta fue evaluada en tubo y en placa respectivamente, por los métodos siguientes:

a) Hemólisis en tubo.-

En forma similar al utilizado por Martínez, Bonilla & Zavaleta (1989) para veneno de B. barnetti, determinando la cantidad de hemoglobina liberada mediante la técnica de la cianometahemoglobina que emplea el reactivo de Drabkin. La actividad hemolítica se expresó como Unidad Específica de Hemólisis Directa (U.E.H.D,) o Indirecta (U.E.H.I.) según sea el caso:

UEHD = % de Hemólisis directa
                  mg Proteína

UEHI = % de Hemólisis indirecta
                mg Proteína

% Hemólisis =     __ HL___
                       HT x 100

Donde :    HL = Hb liberada por tratamiento
              HT = Hb Total (con Tritón X-100)

a.1) Hemólisis directa en tubos conteniendo 0.2 mL de eritrocitos lavados y 1.6 mL de buffer glicina-NaCl a los que se adicionó en un ensayo típico, 0.2 mL de solución de veneno (9.4-564 µg/mL), y se incubó por 20 minutos a 37°C, luego de los cuales se procedió a centrifugar la suspensión a 1000 r.p.m. durante 20 minutos, cuantificándose la hemoglobina liberada en el sobrenadante. El efecto del tiempo de incubación sobre la hemólisis directa fue estudiado para tiempos de incubación de hasta 2 horas.

a.2) Hemólisis indirecta (método de Grassmann y Hanning [16]). Una mezcla de veneno (0.5 mL, 18.8-94 µg/mL) y 0.5 mL de suspensión de yema de huevo al 6.4% en buffer Tris-HCl 50 mM pH 7.5 se preincuban a 37°C durante 30 minutos, 0.2 mL del hidrolizado obtenido es ensayado en el sistema de hemólisis indirecta incubando la mezcla a 37°C por 1 hora, al cabo de los cuales se centrifuga la mezcla y se mide la hemoglobina liberada en el sobrenadante. El efecto del tiempo de incubación sobre la hemólisis indirecta fue estudiado para, tiempos de incubación de 30 minutos a 2 horas.

b) Hemólisis en placa de agar.-

b.1) Hemólisis directa en placa: Las placas se preparan mezclando partes iguales de agar SIGMA tipo I de baja electroendósmosis al 1% y agar DIFCO de alta electroendósmosis al 1% preparados en buffer acetato de sodio 0.05 M a pH 7.5 y adicionando 2 mL de eritrocitos lavados a 40°C. Luego de homogenizar la mezcla, se reparte en placas de vidrio de 10 x 10 cm, y luego de la gelificación se practican agujeros de 3 mm de diámetro en el gel para adicionar el veneno (9.4-94 µg/mL). Las placas conteniendo veneno y control salino, se incubaron a 37°C, por períodos variables de tiempo (0-120 minutos), midiéndose a continuación el diámetro (mm) del halo producido con un Vernier.

b.2) Hemólisis indirecta en placa: Se empleó el método de agar yema de huevo-eritocitos modificado por Da Silva [19], preparada agregando 1mL de suspensión de yema de huevo al 85% en acetato de amonio 100 mM pH 7.4 al agar base a 50°C, y luego de llevar a temperatura de 45°C y se agregó 1 mL de eritrocitos lavados. Procediéndose a homogenizar la mezcla, y repartirla en placas de vidrio de 10 x 10 cm. Se deja gelificar y se practicaron agujeros de 3 mm de diámetro en el gel, para adicionar el veneno (9.4-94 µg/mL). Las placas conteniendo veneno y control salino, se incubaron a 37°C, por períodos variables de tiempo (15-120 minutos), midiéndose a continuación con un Vernier, el diámetro (mm) del halo.

La actividad hemolítica directa e indirecta en placa se expresa como Unidad Hemolítica Directa (UHD) ó Indirecta (UHI) según sea el caso:

UHD =  Diámetro de Hemólisis directa (mm)
            hora x mg de Proteína

UHI =   Diámetro de Hemolisis indirecta (mm)
            hora x mg de Proteína

ACTIVIDAD DE FOSFOLIPASA A₂:

La actividad es determinada por la disminución de la turbidez de una suspensión de yema de huevo por acción de la Fosfolipasa sobre la lecitina de la yema, cuantificada a 925 nm.

La actividad fosfolipásica se evaluó en dos sistemas: en tubo y en placa.

a) En tubo (método turbidimétrico de Marinetti) [22]. Se incubó 100µL de veneno (18.8-94 µg/mL) con 200 µl, de una suspensión de yema de huevo al 5% (60 a 70% de lecitina correspondientes a 0.6 unidades de absorbancia a 925 nm) en buffer Tris-HCI 50 mM a pH 7.5 y 800 µL de NaCl 0.85%. Se estudió el efecto del tiempo de incubación (0 a 2 horas), sobre la actividad fosfolipásica del veneno. Una Unidad de actividad específica de Fosfolipasa (UEF), se expresa como la cantidad de enzima capaz de producir la disminución de la turbidez de la mezcla en una miliunidad de absorbancia a 925 nm, por minuto.

UEF    =      ___    UF _  __    
             mg de Proteína

Siendo:

UR =    (Abs. 0'-Abs. 10') x 1000
              tiempo (10 minutos)

UF corresponde a unidades de Fosfolipasa

b) En placa, se empleó el método de Habermann y Hardt [30] que mide la formación de un halo claro producto de la hidrólisis de la lecitina por la Fosfolipasa. La placa de agar yema de huevo es preparada agregando 1mL de suspensión de yema de huevo al 85% en acetato de amonio 100 mM pH 7.4, al agar base a 50°C. Luego se homogeniza la mezcla y se reparte en las placas. Después de la gelificación se practican agujeros de 3 mm de diámetro para adicionar el veneno (9.4-94 µg/mL) o salino como control.

Las placas conteniendo veneno y control salino, se incubaron a 37°C, por períodos variables de tiempo (15-120 minutos), midiéndose a continuación con un Vernier, el diámetro (mm) del halo. La enzima Fosfolipasa A de Páncreas Porcino (SIGMA P-6534) con actividad de 14500 unidades/mL (Una unidad hidroliza 1uM de L-a-fosfatidilcolina de soya hasta L-a-lisofosfatidilcolina y ácido graso por minuto a pH 8.0 y 37°C fue empleada como estándar.

Para la evaluación de los resultados en placa se aplicó análisis de regresión lineal, considerándose como válidas aquellas concentraciones en donde el coeficiente de regresión r fue igual o superior a 0.99. Una unidad de actividad fosfolipásica (UF) en placa se expresa como la cantidad de proteína capaz de lisar 1 mm de gel en 1 hora de incubación y se determino mediante la fórmula:

UF = Diámetro de Hidrólisis (mm) x hora
        mg de Proteína

ENSAYOS DE AUTODIGESTIÓN:

Para evaluar la estabilidad de las fracciones, estas se sometieron a autodigestión incubándolas durante 18 horas a 23°C y luego cromatografíandolas según lo descrito para filtración en Sephadex.

CITOTOXICIDAD:

La acción citotóxica del veneno de B. hyoprorus se estudió en macrófagos peritoneales de ratón de la cepa BALB/c extraídos inoculando 3 mL de MEM (Medio Esencial Mínimo) en la cavidad peritoneal. El líquido peritoneal es extraído y los macrófagos se adhieren en laminillas cubreobjetos las que son posteriormente mantenidas en MEM con Suero Fetal Bovino al 13% e incubadas en atmósfera húmeda a 37°C y 5% de CO₂ hasta su uso. El efecto citotóxico, se determinó observando al microscopio de fluorescencia las laminillas previamente tratadas con 3 mL de NaCl 0.85% conteniendo 10 ug/mL de diacetato de Fluoresceina, 120 µg/mL de Bromuro de etidio y 20ug/mL de Naranja de acridina, a 24°C. Las células vivas se colorean de verde y las muertas lo hacen de color rojo, tomándose como parámetro cualitativo de observación: Leve (redondeo celular, +), Moderado (desprendimiento celular, ++) y Severo, (muerte celular, +++).

Para la evaluación de la citotoxicidad directa, se incubaron durante 15 minutos los macrófagos con MEM conteniendo veneno o fracción (50-100µg/mL), y para la citotoxicidad mediada por sustrato, se incubaron por 15 minutos en MEM los macrófagos, el veneno o fracción (50-100mg/mL) y 0.5mL de suspensión de yema de huevo al 6% en NaCl 0.85%.

Para la evaluación de la citotoxicidad indirecta, se preincubó MEM conteniendo veneno o fracción (50-100 mg/mL) y 0.5 mL de suspensión de yema de huevo al 6% en NaCl 0.85% por 30minutos a 50°C; Luego la mezcla fue agregada a los macrófagos e incubados por 15 minutos.

INMUNIZACIÓN EN CONEJOS:

Se inmunizaron dos conejos Nueva Zelanda (machos de 1.5 Kg), empleando dosis de 0.1 mL de veneno (10mg/mL), según el esquema mostrado en la Tabla 1.

La presencia o ausencia de anticuerpos en el suero de conejo inoculado con veneno fue evaluada empleando la técnica de inmunodifusión radial en gel de Ouchterlony [31]. Para la inmunodifusión se empleó Agarosa Tipo II-Low (Sigma) al 1% en buffer barbital (Sigma) a pH 8.6 con un diseño de un pozo central y 6 periféricos equidistantes.

En el pozo central se colocó el suero obtenido experimentalmente ó el suero comercial antibotrópico polivalente nacional [32] (INS/MINSA, Perú) y en los restantes, el veneno control y las fracciones obtenidas de la purificación dejándose difundir las muestras durante 48 horas a 4°C. A continuación las placas se tiñeron con 0.1% Coomassie Blue 250-R (Sigma), y se decoloró en una solución 5:5:2 (v/v) de metanol, agua destilada y ácido acético glacial.

TITULACIÓN DEL SUERO POR DOT-ELISA:

Se empleó como antígeno, 1µl de veneno o fracción equivalente a 2µg de proteína, embebidos en círculos de papel de nitrocelulosa colocados en el fondo de los pocitos de placas de microtitulación; el suero experimental, un suero anticonejo obtenido en cabra 1/250 conjugado con fosfatasa alcalina. Como sustrato, Br-4-Cl-Indolilfosfato; como solución de bloqueo, PBS conteniendo Tween-20 al 0.05% y leche deshidratada de vaca al 8% se empleó como sustrato, 3.75 mg de NBT (Nitrobiue tetrazolium, SIGMA) 1.8mg de BCIP (5-Br-4-Cl-Indolylfosfato, SIGMA) diluídos en 37ml de N-N-dimetilformamida y disueltos en 7.5 mL de buffer fosfato alcalino [33,34]. Se ensayaron diluciones de 1/50 a 1/12800.

WESTERN-BLOT:

La electroforesis en poliacrilamida al 10% (PAGE), del veneno, sus funciones y estándares se realizó según el método antes indicado. Se empleó marcadores pre-coloreados de alto peso molecular (SIGMA MW-SDS-Blue): Triosa fosfato Isomerasa (26.6 Kd), Deshidrogenasa láctica (36.5 Kd), Fumarasa(48.5 Kd). Piruvato quinasa (58 Kd), Fructuosa-6-fosfato quinasa (84 Kd), b-Galactosidasa (116 Kd) y a2-Macroglobulina (180 Kd); marcadores de bajo peso molecular (SIGMA MW-SDS-70): Lisozima (14.3 Kd), b-Lactoglobulina (18.4 Kd), Tripsinógeno (24 Kd), Pepsina (34.7 Kd), Albúmina de huevo (45 Kd), Albúmina bovina (66 Kd). Las muestras fueron distribuidas en dos mitades del gel, manteniendo la ubicación, una mitad del gel fue coloreado con Coomassie blue G-250 en ácido perclórico al 5%. La otra mitad fue empleada para la transferencia electroforética utilizando papel de nitrocelulosa de 0.2 micras de poro como membrana de transferencia y Tris 25 mM-glicina 5.5% en metanol al 20%, como buffer de transferencia. Para la transferencia se aplicó 0.2 miliamperios/placa durante 18 horas.

La membrana de nitrocelulosa inmunotransferida fue cortada en tiras siguiendo los rastros de la corrida, se coloreó con tinta china las tiras de los patrones de peso molecular, mientras que las tiras con el veneno y las fracciones fueron tratadas con coomasie blue en forma similar a la inmunodifusión, preincubándolas por 45 minutos con el suero experimental (título no menor a 1/5000) antes de la conjugación.

Resultados.-

CONTENIDO PROTEICO:

El contenido proteico del veneno cristalizado fue estimado en 94.3% por el método de Lowry.

FILTRACIÓN EN GEL SEPHADEX:

El veneno fraccionado en Sephadex G-100 s.f. (Figura 1) eluyó en tres fracciones (FI, FII y FIII). Las actividades hemolítica indirecta (Vi/Vo = 1.77-2.14) y fosfolipásica (Vi/Vo = 1.542-2.28) eluyeron conjuntamente en la fracción FII. La fracción FII fue reunida, concentrada mediante liofilización y recromatografiada bajo las mismas condiciones, obteniéndose la fracción FIIa con Vi/Vo muy similar a FII (1.88-2.0 para la actividad hemolítica y 1.41-2.25 para la actividad fosfolipásica) (Figura 2). Luego de la filtración en Sephadex G-100 s.f. se logró una purificación de 2.11 veces para la actividad de Fosfolipasa (Tabla 2).

Fig. 1: Filtración en gel Shepadex G-100 s.f del veneno de B. hyoprorus. 100 mg de veneno diluido se aplicaron a una columna de 90 x 1.8 cm de gel Shepadex G-100 S.f  y se eluyeron a temperatura ambiente (22-25°) con buffer acetato de amonio 0.2M pH 8.4, a un flojo de 6.3 mL/hora. Las fracciones eluidas (2.1 mL/tubo) se colectaron en un colector de fracciones. La barra horizzontal muestra el pool de tubos, la Actividad Fosfolipásica y Hemolítica Indirecta. Se detecto en la fracción FII.

Fig. 2: Filtración en gel Shepadex G-100 s.f de la fracción FII del veneno de B. hyoprorus. Las condiciones experimentales fueron similares a las descritas en la figura 1. La barra horizontal muestra el pool de tubos cpn Actividad Fosfolipásica y Hemolítica Indirecta (fracción FIIa1).

La fracción FIIa fue concentrada y filtrada en Sephadex G-50f eluyendo en dos picos mayores de los cuales solo en el primero de ellos, FIIa1, se detectó la actividad fosfolipásica (Figura 3).

Fig. 3: Filtración en gel Shrapadex G-50 f de la fracción FIIa del veneno de B. hyoprorus. 20 mg de la fracciónFIIa fueron aplicados a una columna de 100 x 1.0cm de Gel Shepadex G-50 F y eluidas a temperatura ambiente con buffer bicarbonato de amonio 200 mM pH 8.4, a flujo constante de 6.0 mL/hora. Se colectaron fracciones de 2.0 mL/tubo. La barra horizontal muestra el poll de tubos con Actividad Fosfolipásica y Hemolítica Indirecta /fracción FIIa1).

DETERMINACIÓN DEL PESO MOLECULAR APARENTE:

El peso molecular aparente para las fracciones con actividad hemolítica indirecta y fosfolipásica fue estimado en 12 ± 0.5 Kd en la fracción de mayor actividad, mientras que la fracción con menor actividad fosfolipásica presentó dos picos de actividad máxima con pesos moleculares de 12 y 23 Kd respectivamente.

Por SDS-PAGE desnaturalizante el veneno presenta ocho bandas proteicas con pesos moleculares de 73, 59, 55, 40, 38, 35, 23 ± 0,5 y 12 ± 0,5 Kd (Figura 4). El patrón electroforético de las fracciones FII y FIIa mostró dos bandas a 23 ± 0,5 y 12 ± 0,5 Kd coincidiendo con lo hallado en la filtración en Sephadex. La fracción FIIa1l mostró una sola banda de 23 ± 0,5 Kd. No se apreciaron bandas menores. (Figura 4).

Fig. 4: Esquema de SDS-PAGE del veneno cristalizado de B. hyoprorus y de las fracciones aisladas: FII, FIIa y FIIa1, estándares de peso molecular (BSA=66 Kd, Anhidrasa carbónica=29Kd, Citocromo C=12.4 Kd y Aprotinina=6.5 Kd).

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1. Biólogo, Máster en Bioquímica. Centro Nacional de Control de Calidad, Instituto Nacional de Salud, Lima - Perú.
2. Médico Cirujano, Doctor en Farmacología, Director General, Centro Nacional de Control de Calidad, Instituto Nacional de Salud, Lima - Perú; Profesor Principal Sección Farmacología. Dpto. Ciencias Fisiológicas, Facultad de Ciencias y Filosofía, Universidad Peruana Cayetano Heredia, A.P 5045, Lima 100, Perú.

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