DIAGNÓSTICO TEMPRANO EN UN BROTE EPIDÉMICO DEL VIRUS
DENGUE EN PIURA USANDO RT-PCR y NESTED-PCR

Nolasco Oscar¹, Carrillo Carlos², Guitierrez Victoria³, Yabar Carlos¹,
Douglas Susan¹, García María³, Montoya Ysabel¹.

Introducción.-

La infección en humanos por el virus dengue está considerada como una enfermedad reemergente en América Central y del Sur [1] por lo que su diagnóstico temprano es importante en salud pública. En el Perú, se han reportado varios brotes epidémicos en ciudades de la Selva amazónica norte y central y en la Costa norte producidos por el virus dengue serotipo 1 desde 1990 [2]. Debido a la aparición de infecciones ocasionados por el virus dengue serotipo 2 en 1995, el Perú se ubicó como un país en riesgo de presentar dengue hemorrágico [3]. Sin embargo, es de resaltar que hasta la actualidad sólo se han reportado casos de dengue clásico en el Perú.

Generalmente, el diagnóstico serológico de la enfermedad usando MAC-ELISA permite detectar anticuerpos virales a partir del quinto día de las manifestaciones clínicas del paciente [4]. Asimismo, la confirmación del agente etiológico se realiza por cultivo celular mediante la visualización del efecto citopático y por evaluación del IFI. Sin embargo, ambos métodos requieren de tiempos prolongados a fin de obtener un diagnóstico satisfactorio.

Este trabajo de investigación reporta la optimización y validación de las técnicas Transcripción Reversa-Reacción en Cadena de la Polimerasa (RT-PCR) y Nested-Reacción en Cadena de la Polimerasa (Nested-PCR) para el diagnóstico del dengue circulante en nuestro país. De esta manera, el Instituto Nacional de Salud dispone de herramientas moleculares a ser usadas en una intervención temprana ante un brote epidémico del virus dengue.

Materiales y Métodos.-

SUEROS:

Durante el brote de dengue ocurrido en el mes de mayo 1997 en la Costa norte peruana (Mancora, Piura), treinta y cuatro sueros fueron obtenidos provenientes de pacientes con síntomas clínicos compatibles a esta enfermedad. Estas muestras serológicas fueron evaluadas por la técnica de MAC ELISA, IM y RT-PCR. Asimismo, diez sueros fueron obtenidos de donantes sanos y usados como controles negativos para evaluar las técnicas.

CULTIVOS VIRALES IN VITRO:

En el Laboratorio de Arbovirus del Instituto Nacional de Salud los sueros provenientes de casos clínicos sospechosos con infecciones virales de dengue fueron aislados in vitro y tipificados por inmunofluorescencia indirecta (IFI) usando anticuerpos monoclonales anti-dengue. Asimismo, fueron cultivados in vitro las cepas referenciales del virus dengue-1 (Hawai), dengue-2 (New-Guinea), dengue-3 (H87) y dengue-4 (H 241) proporcionados por el CDC de Atlanta, Georgia, EE.UU. y el virus de fiebre amarilla (H). El aislamiento del virus dengue se realizó en cultivo celular de mosquito Aedes albopictus clon C6/36 en medio de cultivo MEM suplementado con 5% de suero fetal bovino. Los cultivos se desarrollaron hasta un 75% a 100% de visualización del efecto citopático.

EXTRACCIÓN DE ARN:

Para la extracción de ARN del virus dengue a partir de cultivos y sueros fueron empleados dos métodos. El primero se realizó empleando el reactivo TRIZOL (Gibco, BRL). Este método se basa en separar las moléculas de ARN en un sistema de fenol y precipitación con alcohol [5].

El segundo método fue realizado usando un kit comercial (QIAamp Qiagen). Para tal fin, la muestra biológica es lisada bajo condiciones desnaturalizantes. Posteriormente, la muestra es colocada en una columna de afinidad a la cual se unirá el ARN mientras que los contaminantes son eliminados mediante lavados. El ARN puro es liberado de la columna con la adición de agua.

RT-PCR:

La transcripción reversa (RT) se realizó usando el oligonucleótido D2 específico correspondiente a la región específica que codifica a la proteína pre-M del virus dengue [6]. Asimismo, en el sistema de reacción se incluyó a la enzima transcriptasa reversa AMV (Avian Myeloblastosis virus), por un período de 90 minutos a 42°C.

La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) fue realizada usando los oligonucleótidos D2, D1 y la enzima ADN Polimerasa Taq Gold (Perkin Elmer). La etapa de desnaturalización se realizó a 94°C durante 50 segundos, la hibridación a 57°C durante 90 segundos y la extensión durante 72°C por 120 segundos. PCR se llevó a cabo en 35 ciclos seguidos de una extensión final a 72°C durante 10 minutos.

NESTED-PCR:

El fragmento de ADNc amplificado en RT-PCR diluído 1/100 fue sometido a una segunda amplificación (Nested-PCR), usándose el oligonucleótido iniciador D1 con oligonucleótidos específicos para cada serotipo [6]. Para amplificar el fragmento específico para virus dengue 1 se usaron los oligonucleótidos TS1 y D1, para el serotipo dengue 2 se usaron los oligonucleótidos iniciadores TS2 y D1. Asimismo, para dengue 3 se usó TS3 con D1 y para dengue 4 se uso TS4 con D1. Las condiciones de amplificación incluyeron 30 ciclos de desnaturalización 94°C por 50 segundos, hibridación a 57°C por 90 segundos y de extensión a 72°C por 120 segundos seguida de una extensión final de 72°C por 10 minutos con la enzima ADN Polimerasa Taq Gold. Los productos de amplificación fueron separados por electroforesis en un gel de agarosa al 4% y visualizados con luz ultravioleta previa tinción con bromuro de etidio.

Resultados.-

EXTRACCIÓN DE ARN VIRAL:

Ambos métodos fueron comparados y se determinó que ambos pueden ser usados indistintamente puesto que la pureza y calidad del material biológico es satisfactorio. Sin embargo, se sugiere el uso del kit de Qiagen para la extracción de ARN a partir de sueros por su rapidez, simplicidad y evitar el riesgo que residuos de etanol alteren la actividad de la enzima durante la PCR. Asimismo, para la extracción de ARN a partir de los cultivos virales se sugiere el uso del reactivo Trizol.

DETECCIÓN Y TIPIFICACIÓN DEL VIRUS DENGUE A PARTIR DE SUEROS Y CULTIVOS IN VITRO:

Al usar los oligonucleótidos iniciadores correspondientes a la región Pre-M del virus (D1 y D2) y realizar el RT-PCR se obtuvo exitosamente el producto de amplificación correspondiente a 511pb. Este producto al ser sometido al Nested-PCR para la identificación de los serotipos dengue 1, dengue 2, dengue 3 y dengue 4 se obtuvieron, como se esperaba, fragmentos de 482pb, 119pb, 290 y 392 respectivamente. Además, fueron evaluados los ARN de los cultivos virales de Fiebre Amarilla y ARN de cultivos de células de mosquito C6/36 sin infectar, no observándose algún producto de amplificación (Foto 1).

Foto 1: Análisis de los productos de Nestel PCR en gel de agarosa al 4%. Carril 1 RT-PCR de ARN total de cultivo de células de mosquito sin infectar; Carril 2 RT-PCR de ARN total de cultivo viral de fiebre amarilla; Carril 3 RT-PCR de ARN total de cultivo viral de dengue 1 (para todos los serotipos se obtuvo el producto del mismo tamaño); Carril 4 RT-PCR Marcador Ladder 100 pb; Carril 5 Nested PCR para serotipo de dengue 1; Carril 6 Nested PCR para serotipo de dengue 2; Carril 7 Nested PCR para el serotipo de dengue 3; Carril 8 Nested PCR para serotipo de dengue 4.

SENSIBILIDAD DE RT-PCR, MAC ELISA Y CULTIVO IN VITRO:

Las muestras de sueros fueron evaluadas por RT-PCR & Nested PCR, así como por MAC ELISA y cultivos virales. La Tabla 1 muestra que los sueros de Piura tipificados por IFI y RT-PCR & Nested-PCR corresponden a dengue serotipo 1. Asimismo, el Nested-PCR reconoció al 82% de sueros (28/34) mientras que la técnica de MAC ELISA reconoció 41% (14/34) de los sueros evaluados durante la primera semana de las manifestaciones clínicas. Una similar sensibilidad diagnóstica fue observada a partir de los cultivos virales evaluados (38%=13/34).

Sin embargo, los sueros que presentan mayor tiempo de enfermedad (> 4 días) no pudieron ser diagnosticados por RT-PCR ni ser aislados por cultivos in vitro. Por lo tanto, para evaluar sueros de pacientes con síntomas clínicos mayor a cuatro días se les debe realizar el MAC ELISA (Tabla 1). El serotipo (Dengue 1) fue tipificado en todas las muestras positivas por IFA así como también por Nested-PCR.

Discusión.-

El virus dengue afecta a más de 100 países a nivel mundial y su prevalencia se debe a múltiples factores entre los que se debe considerar las condiciones de pobreza y sanidad principalmente de las ciudades tropicales y subtropicales de América. Por otro lado, la proliferación del vector Aedes albopictus y su rápida dispersión contribuyen a la reemergencia de epidemias que se pensaban estaban bajo control [7,8].

El desarrollo de recientes tecnologías tal como la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) permiten disponer de un test de diagnóstico temprano a partir de muestras serológicas desde el primer día de las manifestaciones clínicas del virus dengue en humanos.

Existen múltiples reportes en la literatura sobre secuencias oligonucleotídicas descritos para ser aplicados en el diagnóstico de esta enfermedad sin embargo estas secuencias nucleotídicas inicialmente deben ser validados en el país donde serán usados en el diagnóstico para su correcta aplicación epidemiológica. Nuestros resultados sugieren que los sets de oligonucleótidos reportados por Lanciotti, 1992 pueden ser aplicados satisfactoriamente en Piura. Sin embargo, necesitan ser evaluadas otras dreas epidémicas del virus dengue para poder usar estas secuencias nucleotídicas a nivel nacional.

RT-PCR y Nested-PCR son técnicas comparativamente más sensibles que el MAC-ELISA usadas en la detección y tipificación del virus dengue. Asimismo, estas herramientas moleculares brindan un diagnóstico temprano de la enfermedad puesto que la muestra serológica debe ser tomada durante los primeros cinco días de manifestaciones clínicas. Es así que podemos disponer de un ensayo de diagnóstico rápido y conocer rápidamente la coexistencia de los serotipos de virus dengue circulando en territorio peruano para tomar las medidas apropiadas frente al riesgo de presentarse casos de dengue hemorrágico.

Actualmente, los productos de amplificación obtenidos en este trabajo de investigación han sido clonados y su ADN esta siendo secuenciado a fin de determinar las variaciones en la secuencia del virus dengue serotipo 1 circulante en el Perú. Asimismo, la disponibilidad de la secuencia de este serotipo circulante permitirá desarrollar nuevos oligonucleótidos iniciadores que permitan identificar nuevos serotipos y/o mejorar su identificación en el diagnóstico.


AGRADECIMIENTOS:

Los autores agradecen al CDC de Atlanta, Georgia EEUU por proporcionarnos las cepas referenciales del virus dengue-1 (Hawai), dengue-2 (New Guinea), dengue-3 (H87) y dengue-4 (H 241). Además se agradece a la Dra. Laura Chandler de la Universidad de Texas, Galvestone, por proporcionamos los sets de oligonucleótido usados en esta investigación.


Bibliografía

________________________________________________________

1. División de Biología Molecular; Centro Nacional de Laboratorios en Salud Pública, Instituto Nacional de Salud, Lima - Perú.
2. Jefatura, Instituto Nacional de Salud, Lima - Perú.
3. División de Virología, Centro Nacional de Laboratorios en Salud Pública, Instituto Nacional de Salud, Lima - Perú.

Volumenes anteriores