PRODUCCIÓN DEL PRIMER LOTE DE
CONJUGADO ANTIRRÁBICO
DE ORIGEN CAPRINO EN EL PERÚ
Lopez I. Ricardo1, Fernández
V. Roque2
Resumen.-
El objetivo del presente trabajo fue la producción y evaluación del primer lote de
conjugado antirrábico de origen caprino producido en el Perú. La globulina antirrábica
conjugada con fluoresceína fue preparada en el Laboratorio de Referencia de Rabia y la
vacuna utilizada para la inmunización de los animales fue producida en el Laboratorio de
Rabia del Centro Nacional de Producción de Biológicos del Instituto Nacional de Salud
(Lima, Perú). Para la inmunización se utilizó una vacuna hecha a base de cultivo de
células VERO con los adyuvantes de Freundt completo e incompleto. La vacunación se hizo
semanalmente por cuatro semanas con descarga de virus vivo a la quinta y dos
revacunaciones más posteriormente. El conjugado producido en el laboratorio obtuvo una
intensidad (4+) en tinción especifica, (3+) en calidad de inclusiones y (1+) de
fluorescencia no especifica. Sin embargo, el conjugado comercial obtuvo una intensidad
más baja (3+) en tinción específica, mayor cantidad de inclusiones (4+) y menos
tinción inespecífica (0+).
Palabras clave: Rabia, conjugado antirrábico
Abstract.-
The objective of the present study was the production and evaluation of the first batch of
caprine anti-rabies conjugate produced in Peru. The anti-rabies globulin conjugated with
fluorescein was prepared at the Rabies Reference Laboratory of the Centro Nacional de
Laboratorios de Salud Pública of the Instituto Nacional de Salud (INS) and the vaccine
employed for animal immunization was produced at the Rabies Laboratory of the Centro
Nacional de Producción de Biológicos of the INS in Lima,Perú. A VERO tissue culture
vaccine was used for the immunization with Freundt complete and incomplete adjuvants. The
vaccination was performed weekly for four weeks, plus a live virus discharge on the fifth
week and two additional boosters on the following two weeks. The conjugated produced in
the laboratory had a (4+) in specific staining, (3+) in quality of inclusions and (1+) in
non specific fluorescence. However, the commercial conjugate had less intensity of
specific staining (3+), more quality of inclusions (4+), and less non specific staining
(0+).
Key word: Rabies, anti-rabies conjugate. |
Introducción.-
Fue en 1958 que Goldwasser y Kissling [1] reportaron el uso de la prueba de anticuerpos
fluorescentes para rabia. Desde entonces han surgido otras técnicas para el diagnóstico
de rabia, además de la inoculación en ratones, como el inmunodiagnóstico enzimático
rápido de rabia (RREID) (rapid rabies enzyme immunodiagnosis) y el aislamiento en
células de neuroblastoma murino. Sin embargo, la técnica de la inmunofluorescencia
directa sigue siendo la prueba más rápida, sensible, específica y de bajo costo que
existe. La inmunofluorescencia directa consiste en la utilización de un anticuerpo
marcado con fluoresceína (conjugado) para visualizar el antígeno rábico. Esta reacción
se hace visible microscópicamente mediante la excitación de la fluoresceína del
conjugado con luz ultravioleta. Este conjugado se ha venido adquiriendo durante muchos
años de casas comerciales.
El Instituto Nacional de Salud con la implementación de la Red de Laboratorios Regionales
y con otros Laboratorios Regionales de Diagnóstico de Rabia, ya en marcha, pone de
manifiesto la necesidad creciente del conjugado antirrábico.
El objetivo del presente trabajo fue la producción de un lote de conjugado antirrábico
utilizando hamsters, cabras y conejos.
Materiales y Métodos.-
La globulina antirrábica conjugada con fluoresceína fue preparada en el Laboratorio
Referencial de Rabia utilizando para este estudio diez hamsters, cuatro conejos y una
cabra. Los procedimientos a seguir para la hiperinmunización y posterior conjugación
fueron muy semejantes a la descrita por Larghi [2] con modificaciones de Kaplan y
Koprowski [3] y Meslin et al [5]. La primera modificación fue la de sustituir el
antígeno inmunizante por una vacuna producida por primera vez en el Centro Nacional de
Producción de Biológicos en cultivo de células VERO. La segunda modificación fue en el
protocolo de inmunizaciones y la tercera en el uso de adyuvantes. Las fases para la
preparación de conjugado fueron: inmunización de animales, sangrías exploratorias,
conjugación de las inmunoglobulinas y evaluación del conjugado.
Vacuna: Para la inmunización se utilizó una vacuna hecha a base de cultivo de
células VERO y virus Pasteur (PV) producida en el Laboratorio de Rabia del Centro
Nacional de Producción de Biológicos. La vacuna utilizada obtuvo valores antigénicos
que sobrepasaron las 2,5 UI que es el requerimiento mínimo exigido por la Organización
Mundial de la Salud para vacunas en cultivos celulares.
Adyuvantes: Se utilizaron los adyuvantes de Freundt completo e incompleto. El
adyuvante de Freundt completo se diferencia del incompleto en el contenido de
Mycobacterium tuberculosis, la concentración del aceite mineral y el monooleato de
manide.
Inmunizaciones: Para las inmunizaciones se prepararon emulsiones a partes iguales
de adyuvante de Freundt y vacuna antirrábica. Estas emulsiones fueron inoculadas
semanalmente por cuatro semanas. Luego, a la quinta semana se inoculó virus vivo
producido en células VERO. Posteriormente, a partir de la sexta semana se procedió a
efectuar sangrías exploratorias.
Sangrías exploratorias: Se realizaron sangrías exploratorias después de una
semana de la última inyección endovenosa y luego semanalmente. La prueba que se utilizó
para detectar el nivel de anticuerpos en el suero fue la Inhibición de la
Hemoaglutinación (IH).
Conjugación de las inmunoglobulinas: La única modificación a la técnica en la
conjugación fue el uso de la prueba de Lowry [4] para determinar la concentración de
proteínas del suero.
Resultados y Conclusión.-
Existen tres criterios para la evaluación de un conjugado: intensidad de la tinción
específica, cantidad de inclusiones y presencia de fondo o tinción inespecífica. Los
resultados de la evaluación pareada 30 muestras positivas y 30 negativas coloreadas con
un conjugado comercial y el conjugado de origen caprino producido en el INS se muestran en
la Tabla 1.
TABLA N° 1
Comparación promedio de títulos óptimos del conjugado antirrábico caprino (INS, Perú)
con un conjugado comercial*. |
| Variable |
INS |
Comercial |
Intensidad específica
Cantidad de inclusiones
Tinción inespecífica |
4+
3+
1+ |
3+
4+
0+ |
* SANOFI Diagnostics
Pasteur. Este conjugado se reconstituye y se usa en forma directa, sin disoluciones. |
El conjugado producido en el INS obtuvo
una intensidad de la tinción específica más alta, pero con ligeramente menos
inclusiones (1+) y más fondo inespecífico que el conjugado comercial. Es preciso
recalcar que la tinción inespecífica fue más alta que la del conjugado comercial porque
el conjugado producido no fue tratado para eliminar el fondo inespecífico, como lo fue el
producido por SANOFI. En conclusión, se ha obtenido un conjugado satisfactorio, pero es
aún necesario hacer un tratamiento adicional, sea utilizando polvo de tejidos o Sephadex
para eliminar la tinción inespecífica. Además, en la producción del segundo lote se
mejorarán detalles de diluciones, precipitaciones y diálisis con las experiencias
obtenidas en el primer lote, que mejorarán la visualización de las inclusiones obtenidas
con el conjugado de origen caprino producido en el Instituto Nacional de Salud.
AGRADECIMIENTOS:
A la Dra. Ana María Navarro, María Rosa Spedaletti de Sanofi Diagnostics Pasteur, a las
biólogos Patricia Garrido, Albina de Fernández, Victoria Gutiérrez, Paquita García,
Ivonne Torres, al personal de la granja del INS.
Bibliografía
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1. Médico Veterinario, Dpto. de Virología, Centro Nacional de Laboratorios de Salud
Pública, Instituto Nacional de Salud, A.P 451 Lima, Perú.
2. Médico Veterinario, Dpto. de Producción de Vacuna de Rabia. Centro Nacional de
Producción de Biológicos, Instituto Nacional de Salud Pública, Likma, Perú.
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