Using in situ hybridization, human papaillomavirus type 16 was identified in both primary and recurrent cervical carcinoma following radiation therapy.
Se ha postulado que el papilomavirus humano (PVH) jugaría un rol importante en la etiología del cáncer del cuello uterino. Ello se basa en una fuerte asociación observada desde puntos de vista epidemiológico, citológico, histológico, inmunológico y de biología molecular (1). Se han demostrado más de 50 tipos -de PVH (2), de los cuales algunos como el 6 y el 11 se encuentran frecuentemente en condiloma acuminado genital y displasias tempranas, mientras que PVH 16 y 18 se detectan en la mayoría de las displasias avanzadas y cáncer invasor (3). Las técnicas de hibridización molecular son muy sensibles para la detección del ácido nucleico del PVH, existiendo dos fundamentales: hibridization Southcm blot e hibridization in situ (4). En ambas se utilizan sondas de ácido desoxiribonucléico (ADN) o ácido ribonucléico (ARN) marcado con un radioisótopo (5), que formarán una molécula híbrida con el genoma (ADN) viral cuando este esté presente en el tejido neoplásico. Esta molécula marcada se hará visible con un proceso de autoradiografía en el cual se observa la positividad (señal de hibridización) como bandas oscuras en el caso del Southern blot, 6 gránulos oscuros (plata de la emulsión fotográfica) en la hibridización in situ. La intensidad de esta señal varía de acuerdo al número de copias del genoma viral presentes en cada célula (6). La técnica in situ se aplica en secciones de tejido fijado en formol y embebido en parafina, y permite estudiar la localización celular del ADN, evaluando además su distribución tisular y la morfología (5). Tiene la desventaja de ser menos sensible que Southern blot, requiriendo un mayor número de copias del genoma viral por célula. No existe reportes previos acerca de la presencia del ADN del PVH en cáncer cervical recurrente luego de radioterapia. La radiación ionizante produce injuria subletal y muerte celular a través de daño al ADN nuclear, incluyendo ruptura de uniones entre nucleótidos, aberraciones cromosomiales y mutaciones. No se conoce si la radioterapia altera la hibridización molecular del ADN y ARN del PVH en las células del cáncer cervical. Este estudio utiliza hibridización in situ para identificar y tipificar el PVH en cáncer primario y en lesiones recurrentes luego de radioterapia en la misma paciente. Se comparó cáncer primario y recurrente respecto al tipo de PVH, patrón de la señal de hibridización e intensidad de la misma, para así examinar el efecto de la terapia con radiaciones sobre el PVH en cáncer de cuello uterino.
MATERIAL CLÍNICO En este estudio se utilizó tejido fijado
en formol y embebido en parafina, proveniente de biopsias de 10 pacientes con carcinoma de
cuello uterino que presentaron recurrencia pelviana luego de ser tratadas con radioterapia
en el Instituto Nacional de Enfermedades Neoplásicas (INEN), Lima, Perú (Tabla N.º 1).
La edad de las pacientes fluctuó entre 34 y 65 años con una mediana de 52,5 años. El
tiempo de recurrencia luego de completar radioterapia varió entre 6 y 29 meses, con una
mediana de 15,5 meses. Ocho pacientes tuvieron carcinoma epidermoide y dos presentaron
carcinoma adenoescamoso. Dos cánceres fueron bien diferenciados, cuatro medianamente
diferenciados y los cuatro restantes pobremente diferenciados. La distribución por
estadíos clínicos fue la siguiente: Ib en un caso, IIb en cinco y IIIb en los cuatro
restantes. Todos ellos recibieron radioterapia externa seguida de braquiterapia con
radium, totalizando una dosis al punto A de 8,200 a 8,600 cGy.
Cada bloque de tejido fue procesado para
hibridización en dos experimentos separados. En otros reportes se han descrito en detalle
varias técnicas de hibridización in situ con tejidos embebidos en parafina (7,8).
En este estudio se utilizaron sondas de ARN (ribosondas) marcado con S35 para investigar
los tipos de PVH 6,11,16 y 18. Básicamente la técnica consistió en montar una sección
de tejido de 4 m m en una lámina portaobjetos, desparafinarla, agregarle la sonda de ARN
marcado, desnaturalizar el ácido nucleico del tejido y permitir la hibridización.
Proceder luego a la autoradiografía utilizando emulsión Kodak NB-2, desarrollo, fijado,
tinción con hematoxilina. eosina y colocación de lámina cubreobjetos. El examen al
microscopio de luz permitió catalogar como positivo el caso cuando satisfizo los
siguientes criterios: aumento a los gránulos de plata nucleares en por lo menos tres
veces respecto a los controles negativos, más de una célula con hibridización positiva
por cada campo de 400 aumentos, y ausencia de señal de hibridización con las otras tres
sondas de PVH en secciones tisulares adyacentes. Se utilizaron como controles positivos
injertos cutáneos humanos infectados con PVH 11, cultivados bajo la cápsula renal de
ratones atímicos (9), y biopsias de cáncer de cérvix con presencia de PVH 16 y
18 demostrada por la técnica de Southern blot.
El PVH 16 fue el único tipo detectado y estuvo presente en 6 de los 10 casos (60%). Este PVH 16 fue identificado en el tumor primario y recurrente en 4 pacientes, y en un caso solamente en el tumor primario. En el caso número 10 se detectó PVH 16 en el tumor recurrente pero no se contó con tejido biópsico del tumor antes de la irradiación. Se compararon las densidades de la señal de hibridización en las lesiones primarias y recurrentes en cada paciente. Aunque hubo diferencias evidentes entre pacientes distintos, no se apreció diferencia significativa en la señal cuando se trataba del mismo paciente. Se observaron dos patrones en la señal de hibridización que fueron llamados "uniforme" y "focal". En tres casos se encontró el primer patrón representado por una distribución uniforme de los gránulos de plata tanto en el núcleo como en el citoplasma de aproximadamente el 75% de las células malignas, con una intensidad 5 a 10 veces mayor que la señal de base. En otros tres casos se encontró una distribución focal con relativamente pocas células malignas mostrando gránulos de plata muy densos (más de 20 veces la intensidad de base), concentrados preferentemente en los núcleos de las mismas.
La tasa de detección del PVH por la técnica de hibridización in situ utilizando ribosondas es comparable con otras reportadas recientemente. Con la técnica de hibridización in situ ADN-ARN se encuentra el PVH en 30 a 80% de casos (6,8). Schnneider y col. demostraron PVH 16 en el 60% de 17 cánceres invasores del cérvix utilizando sondas ARN, y estimó que la técnica era sensible a la presencia de 20-50 copias del genoma viral por célula (10). No se observó hibridización cruzada entre las cuatro sondas de PVH usadas. En este estudio se reconocieron dos patrones diferentes de la señal de hibridización como se describió en otro reporte previo (10). Los cánceres con patrón "focal" tienen una señal muy intensa distribuida en relativamente pocas células malignas, ocurriendo lo contrario con el patrón "uniforme". El verdadero significado de esas diferencias de distribución e intensidad de la señal de hibridización es incierto, per podría reflejar el potencial biológico del tumor Schneider describió una distribución uniforme e NIC III y en 15 de 17 cánceres invasores, mientras que la densidad "focal" fue característica en NICII y en algunos carcinomas medianamente diferencia dos (10). Con la técnica utilizada en este estudio es posible detectar el ADN viral y el ARN de transcripción es así que demuestra la persistencia del ADN y ARN del PVH en el cáncer cervical recurrente luego de tratamiento con dosis terapéuticas de radioterapia. Las lesiones primarias y recurrentes mostraron una intensidad similar de la señal de hibridización sugiriendo que no hubo una alteración significativa en el número de copias del genoma viral, ni en el nivel de transcripción, luego de radioterapia. Las sondas marcadas con S35 requieren 50 a 500 genomas virales por célula para producir una señal que se considere positiva con la hibridización in situ (10,11). El RNA de transcripción ha sido detectado en cáncer cervical y en líneas celulares derivadas del mismo (12,13), así como en adenocarcinoma in situ (14), por ello, la señal intensa, especialmente en los tumores con distribución focal, probablemente representa RNAs de transcripción acumulados. Esta distribución focal de la señal sería indicativa de heterogeneidad en aspectos sutiles de la diferenciación de las células malignas, la cual no cambió con la radioterapia. En el caso 10 hubo positividad en el tumor primario mas no en el recurrente. Esto podría deberse a una pérdida del genoma viral o a un error geográfico de muestreo, puesto que en el tumor primario, una pocas células en un área limitada, mostraron positividad. Estos experimentos de hidridización in
situ en un pequeño número de casos de cáncer cervical son loi primeros en demostrar
la persistencia del ADN de PVH en cáncer recurrente Postradioterapia. Si tomamos la
intensidad de la señal de hibridización como una medida grosera del ADN y ARN total
celular entonces, estos experimentos indican que la radioterapia no altera el contenido de
ADN y ARN del PVH en el cáncer cervical recurrente. La persistencia y la transcripción
del ácido nucleico viral en cáncer recurrente añade soporte a la teoría actual acerca
del activo rol que jugaría el PVH en el mantenimiento del estado maligno. |
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