DETERMINACIÓN DEL ANTÍGENO DE SUPERFICIE DEL VIRUS DE
LA HEPATITIS B POR INMUNOPEROXIDASA EN UN GRUPO
DE BIOPSIAS DE CIRROSIS HEPÁTICA

Dr. Felix García Ahumada, Eleazar Antúnez de Mayolo, Martín Morales Delgado

INTRODUCCIÓN

El término cirrosis proviene del griego "Kippos" significa "amarillento" y fue utilizado por primera vez por Laennec en el año 1826 al describir hígados que presentaban esta coloración en autopsias (1,2). A través del tiempo la cirrosis hepática ha sufrido cambios en su definición y clasificación, en la cual han participado notables investigadores, entre ellos Schiff (3) quien define a la cirrosis hepática como una triada de necrosis parenquimal, regeneración nodular y cicatrización, siendo ésta la actualmente aceptada.

La cirrosis hepática se presenta con mayor frecuencia en pacientes con antecedentes de enfermedades que producen necrosis hepática como es el caso de la infección crónica por el virus de la hepatitis B (HBV). Otras causas frecuentemente asociadas a la cirrosis hepática son el alcoholismo crónico, las enfermedades autoinmunes y la desnutrición crónica (4,5). Se ha encontrado que la prevalencia de la cirrosis hepática varía según el estudio realizado: 3% en 585,963 autopsias de todo el mundo según un estudio hecho por De Jong (6), 6% en 12,257 autopsias en un estudio hecho por Gall (7); y en el Perú en un trabajo realizado por médicos (3) en el Hospital Azobispo Loayza representa el 10.5% de los diagnósticos anatomopatológicos 1924 biopsias consecutivas.

Clasificar a la cirrosis hepática basándonos sólo en la morfología es inadecuado ya que un patrón histológico determinado puede ser producido por diversos agentes etiológicos y a su vez un agente etiológico puede producir diferentes patrones histológicos (4,9).

En nuestro país según un estudio realizado por Méndez y col. (10), la prevalencia de la infección por el HBV es de 1% en donantes de sangre, 8.7% en personal hospitalario de alto riesgo y 1.4% en población aparentemente sana. La prevalencia de portadores crónicos del HBsAg en la Costa es de 3.4 y 3.0% en las zonas urbanas con mayor densidad demográfica (Lima y Trujillo respectivamente), en la Sierra es de 3.8% (Abancay) y en la Selva es mayor al 5%, lo que hace del Perú un país de mediana endemicidad para la infección por el HBV según la clasificación propuesta por la Organización Panamericana de la Salud (OPS).

La hepatitis B es producida por un pequeño virus de la familia hepadnaviridae que contiene ADN en su interior, e infecta de manera natural sólo a humanos, los que son el único reservorio conocido (11). El HBV se replica inicialmente en el tejido linfoide, luego llega a la sangre y al hígado, en este último produce inflamación y necrosis, no es citopático y gran parte de la patología es mediada por mecanismos inmunes (3,12), las células hepáticas infectadas son atacadas por células T citotóxicas que reconocen antígenos del virus, de esta manera se limita la replicación del virus; y aproximadamente el 10% de los pacientes infectados con el virus no llegan a eliminarlo del organismo y se convierten en portadores crónicos del HBV (11,13).

En el año de 1941 se estudió por primera vez la progresión de una hepatitis a cirrosis a través del estudio de biopsias hepáticas seriadas (1), lo cual ha sido confirmado por posteriores investigaciones como la del peruano Mucha (14) en el año de 1964 en un estudio sobre la relación de la hepatitis viral y la cirrosis postnecrótica.

Inicialmente por inmunofluorescencia y microscopía electrónica se estableció que el material antigénico presente en el suero de los pacientes infectados con el HBV podría encontrarse también en el citoplasma de los hepatocitos de estos pacientes (15), y posteriormente en la década de los 70 estos hallazgos fueron confirmados con el surgimiento de un nuevo método diagnóstico altamente sensible y específico para determinar el HBsAg en el tejido infectado, mediante el empleo de la inmunohistoquímica: inmunoperoxidasa (IP), método inmunológico indirecto, basado en la detección de antígenos mediante anticuerpos, donde la intensidad de la coloración marrón final en el tejido es proporcional a la cantidad de material antigénico contenido en cada una de las células (15,16). Esta técnica (IP) presenta ciertas ventajas sobre la inmunofluorescencia: no es de carácter transitorio, lo cual permite revisar los tejidos un tiempo después, y es capaz de comparar trabajos recientes con los previos (15).

El objetivo del presente estudio es determinar la presencia del HBV en un grupo de biopsias hepáticas de pacientes cirróticos mediante la demostración del HBsAg por la técnica de inmunoperoxidasa (IP).

MATERIAL Y MÉTODOS

1.- Población.- En el presente trabajo se estudiaron biopsias hepáticas provenientes de 47 pacientes de los hospitales Cayetano Heredia de Lima, de La Merced, de Chanchamayo, de Tingo María, de Pucallpa y de Clínicas de Lima, que tuvieron el diagnóstico anatomopatológico de cirrosis hepática, según consta en los informes correspondientes. Todas las biopsias fueron fijadas en formol por no más de 24 horas y embebidas en bloques de parafina. Se confirmó el diagnóstico mediante recoloración con tinción de hematoxilina-eosina.

2.- Diagnóstico Histopatológico.- Las biopsias fueron clasificadas en Cirrosis Post Necrótica (PN) y otras que incluyen cirrosis alcohólica y cirrosis biliar (No Post Necroticas: NP).

3.- Técnica de Inmunoperoxidasa para HBsAg.- La técnica seguida en el presente estudio para la detección del HBsAg se realizó en el Laboratorio de Inmunopatología de la Universidad Peruana Cayetano Heredia (LIP-UPCH). En una primera etapa del estudio se estandarizó el método y luego se aplicó a cada una de las biopsias de nuestra población. En cada procedimiento se incluyeron controles negativos (consistente en biopsias de piel) y positivos (consistente en biopsias hepáticas provenientes de paciente cirróticos con serología e inmunohistoquímica positiva para HBsAg ya conocida). El procedimiento y los reactivos empleados fueron los usados de rutina de acuerdo a criterios establecidos.

4.- Lectura de las láminas.- Inmunoperoxidasa positivo (IP+): coloración marrón de por lo menos una célula en todo el tejido estudiado. Inmunoperoxidasa negativo (IP-): ausencia de coloración marrón en todas las células del tejido estudiado.

Fig 1. Hepatocitos con necrosis celular, el color marrón indica positividad para IP (X 400)

Figura 2. Al centro hepatico positivo para IP (X400)

RESULTADO

De las 47 biopsias estudiadas, 37 provenieron del grupo diagnóstico de cirrosis hepática postnecrótica (PN), representando el 78.72% del total y 10 del grupo diagnóstico de cirrosis hepática no postnecróticos (NP), constituyendo el 21.28% del total; 9 biopsias resultaron positivas por inmunoperoxidasa (IP) para HBsAg (19.15% del total) y 38 resultaron negativas (80.85% del total). Todas las que resultaron positivas provenieron del grupo diagnóstico de cirrosis hepática postnecrótica (PN), constituyéndose en el 24,32% de este grupo.

DISCUSIÓN

Existen varios estudios mediante los cuales se ha demostrado la presencia del HBsAg utilizando este método. Wu et. al. (16) en biopsias hepáticas de 143 pacientes naturales de China con infección crónica por HBV, encontraron HBsAg citoplásmico en el 100% de pacientes portadores, 96% en pacientes con hepatitis crónica persistente, 93% en pacientes con hepatitis crónica activa y 79% en pacientes con carcinoma hepatocelular. Thomsen et. al. (17) en Escandinavia en un grupo de biopsias, encuentra un 28% de positividad para el HBsAg en el grupo de hepatitis crónica. Suzuki et. al. (18) en biopsias hepáticas de 95 pacientes japoneses con carcinoma hepatocelular, encontró el HBsAg en el citoplasma de hepatocitos no carcinomatosos en 28 casos (29.5%) y en células carcinomatosas en 11 casos (11.6%). Ilardi et. al. (19) en 18 pacientes con carcinoma hepatocelular de la República de China, encontró el HBsAg en el tejido hepático en 15 casos (83.33%) y en el tejido carcinomatoso en 3 casos (16.67%).

Se ha demostrado la presencia del HBsAg en biopsias de cirrosis hepática en estudios (17,21,22,23) similares al que hemos realizado. Nuestra serie está conformada por un grupo de biopsias con diagnóstico de cirrosis hepática de todos los tipos, en las cuales se obtuvo un 19.15% (9/47) de positividad para el HBsAg en el citoplasma de los hepatocitos por el método de inmunoperoxidasa, asimismo la positividad para el HBsAg en nuestro estudio estuvo presente exclusivamente en el grupo de cirrosis hepática post necrótica con un 24.32% (9/37). Estudios realizados en diferentes lugares del mundo para determinar la presencia del HBsAg por inmunoperoxidasa en biopsias con diagnóstico de cirrosis hepática (ver cuadro), demuestran una relación entre el porcentaje de HBsAg tisular encontrado y la prevalencia del HBV en esas zonas geográficas (20). Así, en un estudio realizado por Wang et. al. (21) en China sobre la expresión del HBsAg, en las biopsias de cirrosis hepática, encontraron un 70% de positividad para el HBsAg, esta región tiene la prevalencia más alta de portadores del HBsAg de todo el mundo (15%). En el estudio de Al-Adnani- MS et. al. (22) sobre los patrones de enfermedad hepática crónica en Kuwait encontró un 27% de positividad para el HBsAg en el grupo de cirrosis; y en el estudio hecho por Mwangi et. al. (23) sobre el HBV en cirrosis hepática y hepatocarcinoma en Kenya, encontró un 25% de positividad para el HBsAg en biopsias de cirrosis, estos dos estudios han sido realizados en regiones con una prevalencia media de portadores del HBsAg (11.3%). En el estudio realizado por Thomsen et. al. (17) en Escandinavia para determinar la ocurrencia del HBsAg en un grupo de 1539 biopsias hepáticas consecutivas, de las cuales 400 tuvieron el diagnóstico de cirrosis, encontró un 4.5% (18/400) de positividad en el grupo de cirrosis, esta región tiene la prevalencia más baja del mundo para portadores del HBsAg con un 0.1%.

Nuestro país tiene una endemicidad media para la infección por el HBV, según una clasificación propuesta por la OPS (10), con pequeñas zonas endémicas de alta prevalencia como la provincia de Abancay (3.8%). El Perú esta ubicado en el grupo de prevalencia media para portadores del HBsAg (2,2%) (24,25), junto con Kuwait y Kenya, según lo discutido anteriormente. Nuestros resultados, 19.15% de positividad para el HBsAg en biopsias de cirrosis hepática, estarían en concordancia con los encontrados en los estudios de Al-Adnani-MS et. al. (22) y Mwangi et. al. (23) para poblaciones con prevalencia intermedia del HBV. En el Perú existe sólo un trabajo sobre la determinación del HBsAg en biopsias hepáticas realizado por Arce y col. (26), donde estudian 28 biopsias hepáticas, de las cuales 3 tienen el diagnóstico de cirrosis, obteniendo 2 con resultados positivos por inmunoperoxidasa.

En nuestro estudio utilizamos biopsias hepáticas fijadas en formol por un tiempo no mayor de 24 horas y embebidas en bloques de parafina, según recomiendan autores que han realizado trabajos similares como Naoumov (27). A pesar del tratamiento previamente aplicado sobre los tejidos, el método de la inmunoperoxidasa no pierde su sensibilidad y especificidad, como lo confirman los múltiples trabajos ya realizados con este método para determinar diferentes antígenos virales y tisulares, tanto en hígado, riñón y piel (15,17,19,22,26,28,29,30,31), y también como lo demuestra un estudio brasileño de Machado (32) respecto a la eficacia de la técnica para la detección de algunos antígenos (entre ellos el HBsAg), inclusive después de desteñir secciones anteriormente teñidas. Además señalaremos que para la utilización de este método no se necesita de la evaluación de la estructura de los tejidos por otras técnicas (coloración de vimentina, fibronectina, etc), como lo respaldan los trabajos revisados para la elaboración del presente estudio, donde ninguno utiliza métodos adicionales para la demostración y evaluación de la técnica ( 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ).

CONCLUSIÓN

Este método es de utilidad para estudios de investigación especialmente retrospectivos, porque demuestra ser mejor que otros métodos ya conocidos como la inmunofluorescencia, que tiene el inconveniente de tener un tiempo corto para estudio (15). En este trabajo se muestra que el método utilizado es posible realizarlo en nuestro medio con los recursos existentes; muestra también su valor en la práctica clínica, para ser usado como herramienta adicional, sobre todo en los casos de incertidumbre diagnóstica, y en los trabajos epidemiológicos especialmente en lo casos provenientes de zonas endémicas.

Bibliografía

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Laboratorio de Inmunología: Hospital Nacional Cayetano Heredia

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