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Folia Dermatológica
Peruana |
Folia Dermatol. 2003; 14 (2) : 18-23
ESTUDIO
COMPARADO DE MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DE LA LEISHMANIASIS Y CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE
LOS AGENTES ETIOLÓGICOS EN LA LIBERTAD
Hernán Miranda1, Armando
Alfaro1
,Carmen Lora1, Luis Rodríguez1
RESUMEN Objetivo: Comparar el rendimiento del PCR frente al cultivo y examen directo en el diagnóstico de leishmaniasis. Material y Métodos: Estudio analítico transversal, se estudió un total de 69 pacientes con antecedente de vivir en zonas endémicas de leishmaniasis en la Región La Libertad. Se procedió a tomar muestras de bordes de las lesiones por raspado profundo que abarcaba tejido, para el posterior análisis directo, cultivo en medio bifásico y PCR. |
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Resultados: La
positividad del PCR alcanzó el 93%; el examen directo 85% y el cultivo, el 72%. La
existencia de más de una especie además de L. peruviana |
La
leishmaniasis es una de las enfermedades parasitarias de mayor impacto social y económico
en el Perú, con cerca de dos millones de peruanos que viven en zonas de riesgo (1). Dos
formas clínicas son prevalentes: la cutánea andina o “uta” en los valles
andinos e interandinos y la forma cutáneomucosa o “espundia” en las áreas
tropicales. La enfermedad es de severidad variable y en algunos casos cursa con lesiones
que pueden llevar a la incapacidad física. Miranda y col. (2) han descrito las siguientes
variedades clínicas de la leishmaniasis cutánea andina: ulcerosa o úlcero costrosa,
verrucosa, lupoide, linfonodular cerrada, linfonodular abierta (esporotricoide),
acneiforme, impetiginoide, multinodular y seudo mucosa (algunas de ellas ya conocidas
antes). La enfermedad es de severidad variable y en algunos casos cursa con lesiones que
pueden llevar a la incapacidad física (Fotografía 1).
Las lesiones son causadas por un protozoario del género Leishmania,
con más de 20 especies identificadas a nivel mundial; por lo menos la mitad de ellas han
sido encontradas en América. Las formas del parásito están relacionadas con el ciclo de
vida y son dos: promastigota, forma flagelar, que se encuentra en los insectos del genero
Lutzomyia y en cultivos; la forma amastigota (aflagelar) se encuentra en los tejidos de
hospederos vertebrados (en hombres y en animales reservorios).
Además de la identificación de las especies del parásito mediante el
estudio de técnicas de isoenzimas (3,4), métodos más sofisticados han sido
desarrollados para identificar y caracterizar la Leishmania, como el uso de anticuerpos
monoclonales (4,5), hibridación del ADN (5), inmunofluorescencia (6) y más
recientemente, la reacción en cadena de la polimerasa, PCR (7). La PCR ha incrementado la
sensibilidad y especificidad en la detección del parásito (8) y combinada con las
técnicas de RFLPs (9) y RAPD (10) facilita la diferenciación intraespecífica del
parásito. La secuencia de ADN preferida para estos estudios es aquella que se encuentran
en más de una copia en el genoma nuclear o del cinetoplasto.
Cinco especies del parásito han sido reportadas para el Perú:
Leishmania (Viannia) peruviana, L. (V) braziliensis, L. (V) guyanensis, L. (V) lainsoni y
L. (V) amazonensis (11). Las dos primeras especies causan alrededor del 90% de la
leishmaniasis. En el departamento de Huánuco, se ha registrado parásitos
“híbridos” que comparten características cariotípicas e isoenzimáticas de
las especies de L. (V) peruviana y L. (V) braziliensis (12).
El número de cromosomas de la Leishmania es del orden de 36 cromosomas
para las especies del viejo mundo, 35 para las especies del complejo braziliensis y 34
para el complejo mexicana. El tamaño del genoma de la Leishmania ha sido estimado en 34
Megabases (Mb) y los cromosomas varían entre 0.3 a 2.5 Mb (13). La menor proporción del
ADN repetitivo y la aparente falta de intrones (secuencia intercalar de ADN dentro de los
genes que no codifican aminoácidos) son características genéticas ausentes en otros
microorganismos. En base al número de genes encontrados en el cromosoma 1 (79 genes), se
estima que existen aproximadamente 9 800 genes en Leishmania, de los cuales el 40%
codifica para proteínas hasta ahora no conocidas (14).
No obstante la implementación de los programas de control del
Ministerio de Salud para reducir la incidencia de la enfermedad, los índices
epidemiológicos de la Leishmania se han incrementado sostenidamente en los últimos 25
años. El índice de morbilidad en la década de los años 80 ha pasado de 4-12 x 100 000
habitantes a 35 x 100 000 en los últimos años (15). Las cifras son más altas cuando se
analiza por departamentos y provincias. Las variaciones estadísticas en la incidencia
ocurren en cortos periodos de tiempo y están influenciadas principalmente por efectos
climatológicos del fenómeno “El Niño” y a los programas de fumigación contra
el vector, Lutzomyia, que reducen los casos de leishmaniosis en las áreas endémicas. A
estos factores también debe sumarse la resistencia del parásito a los medicamentos a
base del antimonial que se ha incrementado en los últimos años.
La Libertad es uno de los 15 departamentos con áreas endémicas del
parásito, predominando la forma cutánea andina. Con la finalidad de implementar nuevas
técnicas de diagnóstico y caracterización del ADN de la Leishmania se ha iniciado un
estudio comparativo de tres métodos de diagnóstico y caracterización del gen gp63
mediante RFLPs. El gen es responsable de la síntesis de la glicoproteína de 63 kDa
(GP63) sintetizada de manera predominante en el estadio promastigote del parásito. La
molécula contiene zinc y forma parte de la cubierta de la Leishmania, proporcionando
resistencia a la lisis mediada por el complemento, reconocimiento de la zona de acceso al
macrófago y supervivencia celular del parásito (intrafagolisosoma) cuando penetra al
tejido del huésped. Por estas funciones, se la relacionado con la virulencia.
El principal objetivo del estudio es implementar la prueba de PCR para
diagnóstico de la leishmaniosis mediante el análisis del ADN del parásito por biología
molecular, comparando su rendimiento con el examen directo y el cultivo.
Se considera posible que en zonas andinas en las que prevalece la forma
cutánea andina o “uta” existan otras especies, además de la L. (V) peruviana.
Es factible que exista más de una variedad genotípica en la especie de Leishmania (V)
peruviana asociadas a las variedades clínicas de la forma cutánea.
| MATERIALES Y MÉTODOS |
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Pacientes
Se estudió pacientes de toda edad con antecedentes de vivir en zonas
endémicas o de haberlas visitado. Tras la anamnesis y registro fotográfico se procedió
a tomar muestras de bordes de las lesiones por raspado profundo que abarcaba tejido. El
material se utilizó para el examen directo, previa coloración con Wright.
Los cultivos fueron realizados en medio bifásico agar base (BHI) con
suero desfibrinado de conejo 20% e incubados a 23°C durante cinco a veinte días.
Extracción de ADN
Parte del material de raspado de las lesiones y de los cultivos
positivos fue procesado para la extracción del ADN de Leishmania. Previamente se realizó
lavados de la muestra con solución TE 10:5 hasta que el sobrenadante quedara
transparente.
Inicialmente dos métodos fueron aplicados. El primero fue utilizando
el kit de QIAamp y proteinasa K con incubación de una hora a 56°C; el segundo consistió
en colocar el material en solución TE e incubación a 100°C por 15 minutos (boiling).
Luego se centrifuga y el sobrenadante es usado para las reacciones de PCR.
Detección y caracterización del ADN
La amplificación química del ADN se realizó mediante PCR de las
muestras de raspado y de cultivos. Dos tipos de marcadores fueron usados, el primero
amplifica parte del gen de la b-tubulina presente únicamente en las especies del
subgénero de Viannia usando los iniciadores A2A10 (12). La secuencia de los marcadores
fue extraída del clon pLgb4 de la especie de Leishmania (Viannia) guyanensis M4147 y
amplifica un segmento de ADN de 375 pb.
El segundo marcador fue el gen gp63 responsable de la síntesis de la
principal glicoproteína de superficie externa y factor de virulencia del parásito. La
secuencia pertenece al cDNA Lg63c1 de la L. (Viannia) guyanensis y los iniciadores son
simbolizados como TDM1,2 (9). Este marcador fue usado para caracterizar gp63 en las cepas
aisladas de los pacientes aplicando la técnica de PCR seguida de RFLPs (polimorfismos en
longitud de fragmentos de restricción). La digestión enzimática se realizó con 3
unidades de Eco RI y Sal I a 37°C.
Electroforesis
Los productos de ADN de las amplificaciones fueron separados mediante
electroforesis de poliacrilamida al 4% y coloreados con nitrato de plata. Para fines
comparativos, las muestras son corridas con el patrón de bandas de tamaño de ADN
(fX174/Hae III).
Diagnóstico
Dos regiones génicas fueron usadas para la detección de ADN del parásito: b-tubulina y
gp63. Cuando una de las pruebas de PCR presentaba resultado negativo, la muestra se
analizaba con el segundo marcador. Los gráficos 1 y 2
muestran
los geles de electroforesis para los resultados de PCR de cada marcador.
Un total de 69 pacientes fueron examinados con tres pruebas: examen
directo, cultivo y PCR. Dos pacientes fueron excluídos por obtener muestras no adecuadas.
La positividad de cada análisis fue 93% (62/67) para el PCR, 85% (57/67) para el examen
directo y 72% (48/67) para el cultivo. La concordancia de los resultados con los tres
análisis fue de 61% (Tabla
I). Cuando las lesiones son tratadas para limpiar las
infecciones agregadas, la positividad del examen directo se incrementa significativamente.
RFLPs
Los gráficos 3 y
4 muestran los resultados de la digestión del gen
gp63 con las enzimas Eco RI y Sal I. Con la primera enzima se analizaron 27 muestras y se
obtuvieron tres genotipos (Gráfico
3): digestión parcial (columnas 8 y 9) en 18
muestras; digestión total (columna 10) en una muestra y la ausencia del sitio de
restricción (columna 11) fue observada en 8 casos. En esta última, la digestión se
repitió con el doble de unidades de la enzima para confirmar la falta del sitio de
restricción.
Los patrones de RFLPs de digestión parcial o total son
característicos de la L. (V) peruviana y L. (V) guyanensis (9) con formación de los
fragmentos de 0.8 y 0.5 kb. Por primera vez se reporta parásitos que carecen del sitio de
restricción para Eco RI en el gen gp63 y los pacientes con leishmaniasis andina fueron
del distrito de Salpo de la provincia de Otuzco y de Santiago de Chuco.
Con la enzima Sal I se analizaron 26 muestras y tres perfiles fueron
encontrados: falta de digestión del gen gp63 encontrada en 22 muestras (columna 3 y 4 en
los gráficos 3
y 4), tres muestras con fragmentos de 1300 y ~1200 pb (columnas 5 y 6 en
el gráfico 3 y columna 2 en el gráfico
4) y una muestra con bandas de 1300 y ~1100 pb
(columna 5 en el gráfico
4). Las especies L. (V) peruviana, L. (V) guyanensis y L.(V)
lainsoni carecen del sitio de restricción para Sal I. El tercer patrón es similar al
perfil descrito para la especie L. (V) braziliensis (9) y el paciente proviene del
distrito de Chota - Cajamarca. Para confirmar el primer y segundo patrón, las muestras
fueron digeridas con el doble de unidades de la enzima obteniéndose la falta de
digestión y la digestión parcial con formación de la banda de ~1200 pb. Este último
perfil se reporta por primera vez y los pacientes proceden del distrito de Salpo, Otuzco.
El
diagnóstico certero del parásito Leishmania es crucial para el tratamiento oportuno de
la leishmaniasis. El examen directo debe realizarse después del pre-tratamiento para
eliminar las infecciones bacterianas de las lesiones que hacen difícil la visualización
del parásito, es de bajo costo y no requiere de equipamiento sofisticado. Además, es la
segunda prueba más sensible para detectar el parásito en las lesiones. En los casos de
la leishamaniasis cutánea-mucosa, la sensibilidad de la prueba depende de la calidad de
la muestra extraída de las lesiones y el raspado simple no es el apropiado para la
detección del parásito.
No obstante el reducido número de enzimas de restricción empleada en
el análisis de RFLPs, existe dos nuevos genotipos del gen gp63 de la Leishmania que no
han sido reportados previamente para el Perú (9): falta de sitio de restricción para Eco
RI y digestión parcial con formación del fragmento de ~1200 pb. Estas variantes pueden
estar asociadas a la L. (V) peruviana, L. (V) guyanensis o L.(V) lainsoni. Asímismo, la
mayoría de los perfiles de RFLPs (de 19 pacientes para Eco RI y 22 pacientes para Sal I)
se relacionan con la especie L. (V) peruviana.
En el caso del paciente con L. (V) braziliensis proveniente de la
localidad de Chota, debe considerarse la posibilidad de que la infección puede haberse
adquirido en zonas tropicales, ya que los casos de leishmaniasis en el departamento de
Cajamarca se deben a L. (V) peruviana (17). En caso contrario, se trataría del primer
caso de leishmaniasis cutánea por L. (V) braziliensis.
Análisis con mayor número de enzimas de restricción (Bgl I, Apa I,
etc.), tipificación de nuevas regiones de ADN nuclear o cinetoplasto y marcadores
específicos de especies (ADNr, G6PD) permitirían precisar la real magnitud de la
variabilidad genética de la Leishmania y la presencia de nuevas especies del parásito.
Este estudio preliminar muestra que la Leishmania que circula en las
zonas endémicas tiene distintos perfiles de ADN similares a los encontrados en el Perú.
Las interacciones del parásito y animales reservorios en áreas endémicas con
antecedentes ancestrales de leishmaniasis y factores evolutivos (selección, deriva y
otros) han contribuido a los cambios en la secuencia del gen gp63 y probablemente de otras
regiones del genoma de parásito.
También debe considerarse que el aumento de la variabilidad en la
secuencia de ADN del parásito podría estar vinculada con la expresión de los genes de
resistencia a los efectos de los medicamentos a base de antimonio, incidencia que se ha
incrementado de manera notable en los últimos años.
Ha quedado en evidencia que el número de pacientes es insuficiente
para establecer la relación (probable) entre especies y variedades clínicas de la forma
cutánea andina.
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONCYTEC) por el
financiamiento del proyecto de investigación. Las cepas referenciales de Leishmania
fueron proporcionadas por el Instituto Nacional de Salud (INS) y por el doctor Jorge
Arévalo del Instituto de Medicina Tropical “Alexander von Humboldt”.
_______________________
1 Unidad de Biología Molecular, Instituto de Medicina Tropical e
Infectología, Facultad de Medicina,
Universidad Nacional de Trujillo, Perú.
Correo electrónico: meditropical@starmedia.com;
ladelfin@amauta.rcp.net.pe
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