TRABAJOS ORIGINALES

Identificación de la Bartonella Bacilliformis a la Microscopía de luz en la Verruga Peruana

Dres. Javier Arias-Stella C. (1,2,3) y Javier Arias-Stella (1,2)

(1) Laboratorio de Patología Arias Stella.
(2) Universidad Peruana Cayetano Heredia.
(3) Instituto de Enfermedades Neoplásicas

RESUMEN

- La coloración de Warthin-Starry identifica con facilidad a la Bartonella bacilliformis en los nódulos de Verruga Peruana.

- Los gérmenes se ven en el intersticio, sobre la superficie de las células endoteliales proliferadas y, en casos, aparentemente incorporados en el seno de sus citoplasmas.

- Los microorganismos son abundantes en las lesiones incipientes y floridas, disminuyen considerablemente en las fases de regresión inicial y desaparecen en la fase de resolución avanzada.

- La tinción de Warthin-Starry da resultados similares en los extendidos de bartonelosis en fase hemática.

SUMMARY

- Six "miliary", three "nodular" and three "mular" lesions of Verruga Peruana, and the peripheral blood of a case of Carrion’s disease in the hematic phase were stained with the Warthin-Starry technique.

- Warthin-Starry stain clearly demonstrates the Bartonella bacilliformis in tissue sections of Verruga Peruana and in the peripheral blood in the hematic phase of Carrion’s disease.

- In Verruga Peruana the microorganisms are located in the interstitium or seen over the cells.

- In early and florid cases they were abundant and formed arrays or masses between the proliferated endothelial cells.

- In the intermediate resolving lesions the number of bacili decreases and cells showing organisms apparently incorporated in the citoplasms were seen.

- In the late resolving verrugas no microorganisms were identified.

INTRODUCCIÓN

En el estudio de la histología de la fase eruptiva de la Enfermedad de Carrión con la microscopía de luz, pocos temas son más confusos y controversiales que el relativo al reconocimiento de la bartonela en la lesión verrucosa. Un análisis crítico de la literatura inicial y reciente demuestra que hay dos grupos de observaciones. De un lado, las de aquellos que no han sido capaces de encontrar microorganismos en las lesiones, no obstante haber usado variadas tinciones (1)(2)(3)(4)(5)(6) y, de otro, las que han reportado la presencia de gérmenes, con distintas características, en o entre las células del verrucoma (7)(8)(9)(10)(11)(12)(13).

El asunto de fondo en relación a la presencia de la Bartonella bacilliformis en la lesión verrucosa quedó resuelto cuando la microscopía electrónica mostró que en el verrucoma las bartonelas se encuentran, fundamentalmente, en los intersticios, entre las células endoteliales proliferadas (5)(6)(14). Quedaba, sin embargo, la pregunta ¿puede o no reconocerse la Bartonella bacilliformis en los tejidos a la microscopía de luz?, ¿cómo enjuiciar los hallazgos positivos y negativos de previos observadores?.

Nuestras investigaciones ultraestructurales han demostrado que los llamados «clamidozoarios» o «inclusiones de Rocha-Lima», tempranamente descritos en la verruga peruana (2)(15), eran, en realidad, masas constituidas por bartonelas parcialmente degradadas, entremezcladas con sustancia fundamental intersticial, incorporadas en cisternas citoplásmicas formadas en las células endoteliales del verrucoma (14). Si bien en aquel estudio señalamos que la coloración de Warthin-Starry teñía a la inclusión, no reconocimos, entonces, su bondad para visualizar las bartonelas libres en el tejido verrucoso.

Recientemente, al estudiar la «angiomatosis bacilar» (17) hemos ganado experiencia en el manejo e interpretación de esta tinción y descubierto su excelencia y sensibilidad para demostrar las bartonelas en los tejidos. En el presente trabajo mostramos los resultados de las observaciones realizadas. Parte de estas observaciones fueron presentadas, por primera vez, en el XIV Congreso Nacional de Anatomía Patológica en Octubre 25, Lima, 1996, y en forma de abstracto en el Annual Meeting United States and Canadian Academy of Pathology en Orlando, Florida, en Marzo de 1997 (16).

MATERIAL Y MÉTODOS:

El presente trabajo está basado en el estudio de 12 lesiones verrucosas. Seis corresponden a verrugas miliares, tres a verrugas nodulares y tres a verrugas mulares, y comprenden lesiones floridas, en regresión inicial y en regresión avanzada.
Dos de los casos incluidos en este reporte habían sido estudiados ultraestructuralmente en una previa investigación (14). Se estudia también un caso de enfermedad de Carrión en fase hemática.

Los tejidos fueron fijados en formol al 10% e incluidos en parafina, y las secciones histológicas teñidas con hematoxilina-eosina, Giemsa (18) y Warthin-Starry (19). Se puso cuidado en la preparación de los reactivos para el Warthin-Starry, ciñéndonos estrictamente a las recomendaciones, en especial al uso del agua bidestilada, a la pulcritud en la limpieza de la vajilla de vidrio y al ajuste del pH para el agua acidulada (18).

Todos los casos clínicos incluidos en este estudio provenían de zonas endémicas de los departamentos de Ancash , Lima y Cajamarca del Perú.

RESULTADOS

En los cortes coloreados con hematoxilina-eosina y con Giemsa no encontramos microorganismos. En las secciones de lesiones incipientes y floridas coloreadas con la técnica de Warthin-Starry se encontraron gran cantidad de gérmenes bacilares en los intersticios y sobre la superficie de las células endoteliales proliferadas. Las Figs. 1, 2 y 3 ilustran el aspecto histológico y la tinción de Warthin-Starry en una lesión florida de modelo compacto o sólido. Los microorganismos se veían libres, en grupos o formando cúmulos densos en los que sólo moviendo el micrométrico del microscopio puede reconocerse la individualidad de los gérmenes. La mayoría eran bacilares y con una longitud de 1 a 3 micras, aunque cuando están en grupos pueden alinearse y aparentar una longitud mayor. Las formas cocoides oscilaron entre 0.3 a 0.6 micras. Cuando los oscilaron entre 0.3 a 0.6 micras. Cuando los neocapilares son bien visibles se les ve formando cadenas que rodean a los vasos (Figs. 4 y 5). El contraste entre el fondo amarillento-naranja de los citoplasmas e intersticios permite destacar a los organismos bacilares que toman con intensidad la sustancia argéntica. Los gérmenes bacilares se ven como bastoncitos alargados o con dobleces caprichosas; las formas cocoides como elementos granulares ovales o redondeados. Si bien en todos los casos de lesiones floridas los gérmenes eran abundantes, ellos fueron más notables en las proliferaciones sólidas pseudotumorales.

Fig. 1. Verruga Peruana .Lesión nodula florida, modelo solído compacto, tipo "hemangioendotelioma". Coloración H-E. Proliferación densa de células endoteliales con sólo ocacional formación de esbozos capilares.		Fig. 2. Tinción de Warthin-Starry de la lesión anterior. Se ven enormes cantidades de bacilos sobre ó entre células verrucosas.

En los nódulos en resolución inicial el número de microorganismos intersticiales disminuye, los bacilos forman pequeños conglomerados y se ven imágenes que sugieren la incorporación de los gérmenes en el citoplasma (Fig. 6 y 7). En las lesiones en resolución avanzada no se encontró gérmenes.

Fig. 3. Mayor aumento del anterior. Los bacilos son bien visibles ya sea libres o formando agregados.	Fig .4. Verruga Peruana. Le´ión florida de modelo "angiomatoso". Coloración H-E Los neocapilares son bien definidos (x 250)
Fig. 5. Coloración de Warthin-Starry del caso anterior. Alrededor de un capilar central aislado, se ven grandes masas de bacilos agregados. (x 900)	Fig. 6. Verruga Peruana. Resolución inicial. Tinción de Warthin-Starry. En la parte central se ven los bacilos apararentemente incorporados en el citoplasma célular.

En una de las lesiones floridas se encontró cuerpos de Rocha-Lima que, con el Warthin-Starry, tomaban una coloración marrón oscura, como lo hemos ilustrado en una comunicación previa (20). En la vecindad de estas inclusiones los bacilos, libres, intersticiales o sobre la superficie de las células endoteliales eran abundantes.

La Fig. 8 muestra un extendido de sangre periférica correspondiente a la fase hemática de la enfermedad de Carrión, teñida con Warthin-Starry. La similitud de la tinción con la observada en los tejidos es evidente.

Fig. 7. Verruga Peruana.    Resolución inicial.Tinción de Warthin-Starry. Bacilo unico, aislado en el intersticio.	Fig. 8. Extendido de sangre periferíca de la fase hemática en la Enfermedad de Carrión. Tinción de Warthin-Starry. Las bartonelas sobre ó en los glóbulos rojos son bien visibles. Compárese la similitud entre el aspecto y coloración de los gérmenes con lo observado en los tejidos. (Caso clínico estudiado por el doctor Pedro Larrea, Hospital 2 de Mayo, Lima)

Dos de las lesiones floridas, pseudotumorales, incluidas en el presente estudio, habían sido previamente investigadas a la microscopía electrónica. La comparación de las observaciones ultraestructurales con los resultados del Warthin-Starry mostraron la identidad de los organismos.

DISCUSIÓN Y COMENTARIO

En los estudios iniciales de reputados investigadores extranjeros como Cole (1), Mayer, Rocha-Lima y Werner (15) y Strong y col. (3), usando una variedad de tinciones que incluyen la hematoxilina-eosina, Gram, Giemsa, Levaditi y otros colorantes, se llegó a la conclusión que: «no se encuentran microorganismos en los cortes histológicos o en los extendidos preparados de verrugas frescas».

Posteriormente, investigadores peruanos han tenido también similar experiencia. Así en 1966, Cuadra (4) afirma: «las secciones histológicas de nódulo verrucoso coloreadas con H-E mostraron la arquitectura conocida del tejido angiomatoso, más no bartonelas o inclusiones clamidozoarias». «En frotises de tejido verrucoso... las preparaciones coloreadas con Giemsa mostraron numerosas células, más no bartonelas, sean las formas corrientes o las formas clamidozoarias». En 1970, Takano-Morón (5), estudiando cinco nódulos verrucosos señala lo siguiente: «En secciones coloreadas con Giemsa...... los resultados fueron dudosos». En 1972, Recavarren y Lumbreras, estudiando seis nódulos verrucosos, subrayan: «Con las tinciones de hematoxilina-eosina y Gram no encontramos bacterias» (6).

Al lado de estos reportes encontramos también, como se resume en la Tabla 1, una serie de observaciones en las que se describen microorganismos de distintas dimensiones y características en las lesiones.

La descripción de Izquierdo, en 1885 (7), sugiere una contaminación desde que los gérmenes se veían en y fuera de la lesión e incluso dentro de los vasos. El resultado de Letulle en 1898 (8), Profesor en París, en especímenes que le fueran remitidos por el Dr. Odriozola desde Lima, es sorprendente pues refiere el hallazgo de gérmenes con las características tintoriales del bacilo de Koch.

En 1902, Escomel (9) describe, e ilustra con dibujos de cortes histológicos, bacilos de aproximadamente 10 a 15 micras. En 1922, Mackehenie y Battistini (10) describen bacilos de 0.5 a 2 micras: «uno, dos, tres, o cuatro en cada célula» y presentan dibujos de cortes histológicos mostrando los microorganismos en los intersticios. Resultados similares señalan Mackehenie y Weiss (11) en 1926, en el verrucoma experimental del mono.

En la segunda expedición de la Universidad de Harvard al Perú, Pinkerton y Weinman (12), en 1937, usando la fijación de Regaud y la coloración de Giemsa, estudiaron 10 nódulos verrucosos y describen la «presencia invariable de células llenas de bartonelas, a menudo en grandes cantidades». Los autores ilustraron sus hallazgos con dibujos de células tomadas de extendidos preparados directamente de los nódulos verrucosos, fijados en alcohol y coloreados con Giemsa. En 1965, Urteaga y Calderón (13), en una biopsia de piel en fase pre-eruptiva y en tres nódulos verrucosos, usando la tinción con Giemsa, describen células perivasculares y reticulohistiocitarias «llenas de bartonelas cocoides». Ilustran sus observaciones con microfotografías de los cortes histológicos ó extendidos citológicos.

Sin duda, la falta de adecuada documentación objetiva que respalde las afirmaciones sostenidas hace difícil juzgar el significado de las observaciones arriba anotadas. En el reporte de Urteaga y Calderón, que es el único sustentado con microfotografías, es evidente que las células que ilustran como células adventiciales «llenas de bartonelas» no son otra cosa que típicas células cebadas, mientras que las células que ilustran como retículo histiocitarias llenas de gérmenes en extendidos de nódulos verrucosos, parecen corresponder a los cuerpos de Rocha-Lima.

Las condiciones de fijación y la técnica de las tinciones varía de uno a otro laboratorio y esto puede explicar, por lo menos, en parte, la diversidad de los resultados. Ningún autor después de Pinkerton y Weinman ha utilizado la fijación de Regaud en la preparación de los tejidos y esto puede ser un elemento importante a tenerse en cuenta. Nosotros, en los preparados fijados en formalina, incluidos en parafina y coloreados con Giemsa, no hemos visualizado gérmenes. No hemos experimentado con el fijador de Regaud y esto es algo que dejamos pendiente para ulteriores estudios.

Lo que parece evidente es que en las condiciones del trabajo rutinario y con las coloraciones corrientes, incluyendo el Giemsa, la mayoría de los autores no han podido demostrar organismos a la microscopía de luz. Esto es lo que da significación a los resultados que ahora relatamos****. En los dos casos en los que hemos podido comparar los hallazgos con el Warthin-Starry y las observaciones ultraestructurales, no nos quedó duda alguna de la identidad de los organismos que veíamos con una y otra técnica. En la sangre periférica la Bartonella es facilmente demostrable, en la fase hemática de la enfermedad, con las coloraciones de Giemsa, Wright y las variantes del Romanowsky. Como hemos ilustrado la tinción de Warthin-Starry las tiñe en idéntica forma como lo hace en los tejidos.

Es interesante subrayar que con la coloración de Warthin-Starry existe similitud en la apariencia de los gérmenes en la «angiomatosis bacilar» (17) y en la verruga peruana. Esto era de esperarse desde que los dos procesos son producidos por microorganismos relacionados, la Bartonella henselae en la «angiomatosis» y la Bartonella bacilliformis en la Enfermedad de Carrión.

****Cuando presentamos por primera vez nuestras observaciones en el Congreso de Patología Nacional en la Estación de Comentarios el Dr. Recavarren mencionó que en su Laboratorio el Dr. Cook había hecho tinciones de Wathin-Starry en algunas verrugas, con estudios similares. Hay que señalar también que Le Boit, sin referir observaciones concretas, ha comentado: "In contrast to what has been reportes the Wharthin-Starry stains works well in verruga peruana"(21). También, sin presentar obervaciones concretas, en el libro Pathology of infections Diseases de Connor y Chandler, 1997, se dice: "When conclusions are not present, the diagnosis rest in clinicopathologic correlation, the presence of plump atypical endothelial cells and small intersticial clusters of silvered (blackened) bacteria using the Warthin-Starry technique". (22).

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:

1. Cole HN. Verruga Peruviana and its comparative study in man and the ape.Arch Intern Med 1912; 10: 668-74.

2. Rocha-Lima H. Zur Histologie der Verruga Peruviana. Verh Dtsch Ges Pathol 1913; 16: 409-16.

3. Strong RP., Tyzzer EE., Brues CT., Sellards AW., Gastiaburu JC. Report of first expedition to South America (1913) Harvard School of Tropical Medicine. Cambridge, MA: Harvard University Press, 1915.

4. Cuadra M. Cultivo del Verrucoma. Anales Fac Med Lima 1966; 49: 646-58.

5. Takano-Morón J. Enfermedad de Carrión(Bartonellosis Humana). Estudio morfológico de la fase hemática y del período eruptivo con el microscopio electrónico (Tesis Doctoral). Lima, Perú: Facultad de Medicina, 1970.

6. Recavarren S., Lumbreras H. Pathogenesis of the verruga of Carrion’s disease. Am J Pathol 1972; 66: 461-70.

7. Izquierdo V. Spaltpilze bei der Verruga peruana. Virchow’s Arch 1885; 99: 411-8.

8. Letulle M. Histologie pathologique de la verruga peruvienne.Compt Rend Soc Biol Par 1898; 5: 764-5.

9. Escomel E. Anatomie pathologique du verrucoma de Carrion. Ann Dermatol Syphiligr (Paris) 1902; 3: 961-84.

10. Mackehenie D., Battistini T. Contribución al estudio de la Verruga Peruana. Arch Assoc Peruana Progreso Ciencia 1922; 2: 14-8.

11. Mackehenie D., Weiss P. Contribución al estudio de la Verruga Peruana. Gac Med Peruana 1926; 4: 51-9.

12. Pinkerton H., Weinman D. Carrion’s disease .II. Comparative morphology of the etiological agent in Oroya Fever and Verruga Peruana. Proc Soc Exp Biol Med 1937; 37: 591-3.

13. Urteaga O., Calderón J. Ciclo biológico de reproducción de la Bartonella bacilliformis en los tejidos de pacientes de Verruga Peruana o enfermedad de Carrión. Arch Peruanos Pathol Clin 1965; 19: 1-37.

14. Arias-Stella J., Lieberman PH., Erlandson R., Arias-Stella J. Jr. Histology, immunohistochemistry and ultrastruture of the verruga in Carrion’s disease. Am J Surg Pathol 1986; 10: 595-610.

15. Mayer M., Rocha-Lima H., Werner H. Untersuchungen uber Verruga Peruviana. Munch Med Wochenschr 1913; 60: 739-44.

16. Arias-Stella, J.Jr. and Arias-Stella, J. Warthin Starry stain recognizes Bartonella bacilliformis in Verruga Peruana. Modern Pathology 10(1) 41,a,1997.

17 Arias-Stella J., Bravo-Puccio F., Arias-Stella C. J. Angiomatosis Bacilar en el Perú. Una nueva forma de Bartonelosis que es necesario diferenciar de la Verruga Peruana. Folia Dermatológica 1996; 7: Nº2, 31-6.

18. Romeis, B. Guía-Formulario de Técnica Histológica. Editorial Labor, Barcelona, 1936.

19. Prophet E. B., Mills B., Arrington J. B., Sobin L. H. Laboratory Methods in Histotechnology. Armed Forces of Pathology. American Registry of Pathology. Washington D.C.1992.1

20. Arias-Stella, J. y Arias-Stella, C. J. Las inclusiones de Rocha-Lima en la Verruga Peruana. Folia Dermatológica, 7(3-4) 37-42,1996.

21. Leboit, P.E. In Consultation. Bacillary Angiomatosis. Modern Pathology. 8,(2), 218-222, 1995.

22. Connor, D.H. and Chandler, F.W. Pathology Infectious Diseases. Appleton & Lange, Stanford, Connecticut, 1997, page 435.

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