Trabajos Originales

IDENTIFICACIÓN DEL MYCOBACTERIUM LEPRAE EN PIEL Y NERVIO SURAL DE PACIENTES SOMETIDOS A TERAPIA POR LEPRA

Adriana Ciudad¹, María Ysabel Escalante², N. Violeta Seminario³,
Rosa Maita⁴, Rosa García⁴, Ernesto Ráez⁶.

INTRODUCCIÓN

Los pacientes con antecedentes de Lepra tratada que presentan nuevas lesiones requieren, con fines diagnósticos, la identificación del Mycobacterium leprae viable en tejidos. Esto permite, entre otros, el diagnóstico diferencial entre Lepra recurrente y reacción reversa tardía a antígenos de productos del Mycobacterium [1].

El Mycobacterium leprae es un bacilo intracelular, capaz de multiplicarse en macrófagos tisulares y células de Schwann, que le sirven de hábitat; es el único bacilo con capacidad para invadir nervios periféricos, produciendo pérdida de la polaridad de las células de Schwann, proliferación de las mismas e infiltrado inflamatorio crónico con desorganización del nervio, daño funcional y/o estructural, hasta la destrucción del nervio periférico sensorial o motor, con incapacidades permanentes [2].

El propósito del presente trabajo es la búsqueda del Mycobacterium leprae en biopsias de piel (dermis y plexos nerviosos) y nervio sural de pacientes tratados por Lepra, con métodos histoquímicos (Wade Fite), inmunohistoquímicos y de microscopía electrónica.

MATERIAL Y MÉTODOS

Se estudió a 50 pacientes con Enfermedad de Hansen, Lepra o Mal de Lázaro. Se revisó la historia clínica, confeccionada según el Programa Nacional de Control de Hanseniasis. Se obtuvo 50 biopsias de piel lesionada (máculas acrómicas o hipercrómicas) y, en 13 pacientes, además de la biopsia de piel, se realizó biopsia por incisión del nervio sural.

Las biopsias de piel fueron de 4 mm de diámetro; una mitad de la biopsia se incluyó de la manera usual y la otra se cortó paralela a la superficie de la epidermis, a nivel de los plexos nerviosos papilar y dermal. La biopsia de nervio sural se cortó en dos fragmentos: uno se fijó en formol neutro al 10% para su inclusión en parafina y el otro se fijó directamente en glutaraldehido al 1% tamponado y luego en tetraóxido de osmio, para ser incluido en plástico para microscopía electrónica y de alta resolución.

Una parte de cada biopsia de piel y nervio, fijados en formol al 10%, Ph 7.3, fue incluída en parafina y cortada a 3 micras de espesor. Los cortes se colorearon con: Hematoxilina Eosina, Wade Fite, para la clasificación de Lepra, según Ridley Jopling, extensión del infiltrado celular y presencia de bacilos ácido resistentes. Otros cortes incluidos en parafina se colorearon con el método inmunoenzimático Streptavidin Peroxidasa (DAKO), con los anticuerpos primarios anti Mycobacterium diluido 1/200 y otro corte con el anticuerpo AgS100 diluido 1/200 (DAKO); el cromógeno fue 3,3 amino ethil carbazol y el contraste fue con hematoxilina de Mayer.

De cada biopsia de piel y nervio se obtuvo cortes de 1 mm³; fueron fijados en glutaraldehido (2,5%) por dos horas, post fijados en tetraóxido de osmio al 1% por una hora, deshidratados en alcoholes de concentración creciente, óxido de propileno, para ser embebidos en resina SPURR y polimerizados por 48 horas, a 70°C. Se usó un ultramicrótomo modelo Reihart Jung y se obtuvo secciones semifinas de 1 mm de grosor, las cuales se tiñeron con azul de toluidina al 1% y fueron observadas al microscopio de luz.

En el Hospital Hammersmith de Londres, Inglaterra, la Magíster María Ysabel Escalante obtuvo secciones ultrafinas, las cuales fueron colectadas en rejillas de 100 mesh de níquel, para ser teñidas con acetato de uranilo y citrato de plomo. Las secciones fueron observadas en el microscopio electrónico de transmisión a 5000, 2500 y 10000 magnificaciones; se tomaron fotografías con placas Kodak.

En los casos positivos a Mycobacterium con método Wade Fite y método inmunoenzimático, se utilizó el índice de recuento directo de BAR, como aconseja Ridley y colaboradores, en el estudio de cortes histológicos correspondientes a biopsia punción de piel de 4 mm de diámetro o biopsia por incisión de nervio. La lectura e interpretación de los resultados se realizó sin conocer la historia clínica y, posteriormente, se hizo la correlación clínico patológica.

RESULTADOS

Los pacientes estudiados tenían de 10 a 84 años de edad; el mayor número estuvo entre los de 30 a 39 años (20%) y entre los de 50 a 59 años (20%); predominó el sexo masculino (66%) sobre el femenino (34%). Distribución según la procedencia: Iquitos (32%), Pucallpa (14%), Abancay (14%), Tarapoto (12%), Yurimaguas (10%) y otros (20%) (Tablas I y II).

El tiempo de enfermedad fue hasta de 9 años en el 32% de los pacientes (Tabla III).

El diagnóstico postratamiento más frecuente fue Lepra en regresión o cicatricial (64%), caracterizada por fibrosis de piel o nervio, ausencia de signos de actividad de la enfermedad y ausencia de Mycobacterium en los tejidos. Los otros diagnósticos fueron: Lepra recurrente (18%), Lepra dimorfa lepromatosa (8%), Lepra lepromatosa (6%) y Lepra dimorfa tuberculoide (4%) (Tabla IV). Dos pacientes, con lesión recurrente de Lepra, presentaron vasculitis leucocitoclástica secundaria en la biopsia y eritema nodoso leproso en otras áreas de la piel. En todos los pacientes las biopsias se realizaron en máculas de piel y no en lesiones clínicamente compatibles con eritema nodoso leproso.

El número de Mycobacterium leprae coloreado con Wade Fite (recuento directo de BAR) y su morfología guardaron relación con el tipo histológico de Lepra, de acuerdo a la clasificación de Ridley y Jopling (Fotografía 1). Se identificó Mycobacterium en 18 de 50 pacientes.

Fotografía 1: Caso 17. Biopsia de piel. Dg. LL con numerosos Mycobacterium leprae. Coloración Wade Fite (x1000).

En las biopsias de nervio sural, 1 de 13 pacientes presentó signos de regeneración; 2 presencia de Mycobacterium con neuritis y 10, fibrosis (Fotografías 2 y 3).

Fotografía 2: Diagnóstico Lepra lepromatosa. Mycrobacterium leprae presentes en el citoplasma de células de Schwann (Microscopía Electrónica x 10 000).

Fotografía 3: Diagnóstico Lepra lepromatosa: sección transversal de fibra mielínica con dos Mycrobacterium leprae (Microscopiía Electrónica x 10 000).

El antígeno S100 y los cortes histológicos paralelos a la superficie de la piel, a nivel de los plexos nerviosos, fueron de utilidad en el estudio de alteraciones de las células de Schwann, sobre todo en casos de recurrencia (Fotografía 4).

De acuerdo con la revisión de las historias clínicas, el diagnóstico del tipo de Lepra previo al tratamiento fue: Lepra lepromatosa (72%), Lepra tuberculoide (10%), Lepra dimorfa (8%), Lepra indeterminada (4%), Lepra dimorfa tuberculoide (4%). El 68% de los pacientes recibió tratamiento multidroga y el 32% droga única. Los pacientes con droga única presentaron Lepra en regresión o cicatricial de 1 a 20 años después del término del tratamiento. Los pacientes con tratamiento multidroga fueron diagnosticados de Lepra en regresión o cicatricial de dos meses a un año después del término de su tratamiento.

DISCUSIÓN

El diagnóstico histológico de una biopsia de piel o nervio representativo de lesión, y el recuento de bacilos proveen información de importancia en la práctica clínica. El estudio de cortes histológicos con infiltrados inflamatorios perianexales y perivasculares, con focos de neuritis, obligan a hacer más cortes del tejido y repetir la biopsia para aclarar el diagnóstico con la identificación de Mycobacterium [2].

En la Lepra, las lesiones histopatológicas son diferentes (clasificación de Ridley y Jopling), debido a mecanismos inmunopatológicos de respuesta inmune en cada paciente; los polos opuestos del espectro de la enfermedad son: Lepra lepromatosa (LL) y Lepra Tuberculoide (TT); entre ambos existen las formas dimorfas, limítrofes o bipolares (LBL, LBB y LBT); todo ello conforma el espectro de la enfermedad, que va de escasa (LL), a mayor reacción por hipersensibilidad retardada o mediada por células T (TT). Según la evolución clínica de las lesiones, se consideran otras formas como: Lepra indeterminada, Lepra en regresión, lesiones recurrentes; así como también lesiones reaccionales: eritema nodoso leproso, reacción de Lucio, reacción por hipersensibilidad retardada [3].

Los casos de Lepra en regresión presentaron en la biopsia de piel o nervio: hiperplasia del colágeno, fragmentación de fibras elásticas, aumento de fibrocitos y ausencia de Mycobacterium. Las biopsias de pacientes con lesión recurrente se caracterizaron por presentar infiltrado celular inflamatorio, con macrófagos jóvenes en lesiones preexistentes o en vías de resolución y presencia de Mycobacterium cortos y sólidos.

Estudios histopatológicos muestran lesión extensa del nervio antes de que el paciente tenga síntomas o signos de alteración de la función del nervio. La neuropatía es una complicación de Lepra, aún después de iniciado el tratamiento; en la fase activa se aprecia edema e infiltrado inflamatorio del nervio. La Lepra en el nervio se presenta con localización intersticial; se lesiona el tejido conectivo, correspondiente a las envolturas del nervio. La lesión varía entre granulomas característicos-acompañando a la lesión Schwaniana, que puede ser voluminosa por necrosis, proliferación de las células de Schwann o por fibrosis. Esta última, es señalada por algunos autores, como muy sugerente de Lepra. Otros procesos patológicos que ocasionen fibrosis del nervio son sumamente raros. En Lepra lepromatosa, el diagnóstico se basa en el hallazgo de células espumosas o de Virchow, dentro de un cuadro inflamatorio tipo granulomatoso, con gran cantidad de bacilos ácido resistentes [4].

En nuestro estudio se investigó antígeno S100, para identificar cambios en las células de Schwann, a nivel de los plexos nerviosos de la piel y en biopsias de nervio sural; las lesiones, así ubicadas, fueron el lugar para una búsqueda minuciosa de bacilo ácido resistente, sobre todo en casos paucibacilares. Los resultados con coloración Wade Fite y método inmunoenzimático, para la búsqueda del bacilo fueron similares pero, en el último mencionado, fue más fácil identificar fragmentos de los mismos.

El estudio ultraestructrual es un procedimiento indispensable para visualizar fenómenos de degeneración y regeneración axonal, morfología de las fibras, alteraciones de las células de Schwann, presencia de colágeno y observación de Mycobacterium. Hay varios estudios de lesiones de Lepra por microscopía electrónica, con rara utilización del bajo aumento, como un puente entre microscopía de luz y microscopía electrónica [5].

Otros autores han encontrado que el estudio bacteriológico en la piel de niños con Lepra no fue exitoso y que las respuestas a la lepromina (Mitsuda) fueron positivas en pacientes en el polo tuberculoide de la Lepra; la patología microscópica tuvo buena correlación con la clínica en 50 a 60% de casos [6]. Muchos de estos estudios no se han beneficiado con el uso de la inmunocitoquímica y de la microscopía electrónica para la identificación del Mycobacterium en biopsias.

Existen estudios de hibridización in situ del DNA, que determinan el DNA bacilar, presente en los tejidos y el método de la reacción en cadena de la polimerasa, que identifica cantidades muy pequeñas del nucleótido del DNA.

Estos métodos no dan evidencias de la viabilidad del agente etiológico, a diferencia de la inoculación de homogenizado de tejido según protocolo standard de la Organización Mundial de la Salud (WHO/EDS/Lep/86.4.1987) en ratones blancos suizos [7].

El M. Leprae fue uno de los primeros microorganismos asociados a enfermedad humana, pero los estudios de laboratorio han sido difíciles por la incapacidad de cultivarlos in vitro [8]. Actualmente, con la secuenciación del genoma del M. Leprae, se resuelven aspectos no bien aclarados en relación al bacilo de la Lepra. Estudios comparativos de secuencia del genoma señalan que el M. Leprae contiene abundantes genes inactivos o pseudogenes, con pérdida de genes, especialmente involucrados en el catabolismo. Ello podría explicar un tiempo largo de generación de la enfermedad y la inhabilidad de cultivar el bacilo de Lepra in vitro [9].

En la actualidad se sabe que el M. Leprae ha estado perdiendo genes y, con ello, la habilidad de responder al medio ambiente. No crece in vitro y requiere de una célula huésped para sus nutrientes esenciales [8]. Se conocen los pasos iniciales de la infección de las células de Schwann, por los roles de la proteína de adhesión a laminina y el glicolípido fenólico; poco se sabe qué facilita la persistencia de esta microbacteria en las células de Schwann y en los macrófagos [9].

En nuestro estudio, hemos utilizado diversos métodos, considerando las dificultades diagnósticas en los casos paucibacilares. Se seleccionó la localización de toma de biopsias, evitando áreas de lesiones tipo eritema nodoso leproso, en la búsqueda de lesión recurrente. La Lepra recurrente, con frecuencia, estuvo acompañada de vasculitis secundaria. Hemos realizado el presente trabajo, considerando que en el Programa del Control de Lepra son componentes esenciales el diagnóstico temprano, diagnóstico de recurrencias y detección de estados reaccionales en Lepra [10,11].



Bibliografía

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1. Médico Neuropatólogo del Hospital Santo Toribio de Mogrovejo.
2. Tecnólogo Médico Especialidad Laboratorio Clínico y Anatomía Patológica Hospital Guillermo Almenara I. Magister en Ciencias.
3. Médico Patólogo. Ex-Directora del Instituto de Patología de la Facultad de Medicina UNMSM.
4. Médico Internista y Geriatra de la Clínica Tezza y Clínica Universitaria UNMSM.
5. Médico Infectólogo del Hospital Cayetano Heredia.
6. Médico Patólogo del Instituto de Patología de la Facultad de Medicina UNMSM

Trabajo realizado en el Instituto de Patología - Facultad de Medicina de la UNMSM, con auspicio de la Oficina General de Investigación de la UNMSM.

Correspondencia: nvriver@terra.com.pe

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