DERMATOLOGÍA PERUANA - VOL. 9, SUPLEMENTO 1, DICIEMBRE - 1999


DETERMINACIÓN DE COMPATIBILIDAD E IDENTIDAD

La PCR puede ser utilizada para amplificar selectivamente una porción del gen HLA (human leukocyte antigen) DQalfa, o el receptor de LDL (low-density lipoprotein). En ambos casos se trata de un locus muy polimórfico del genoma humano y para los que existen algunos kits comerciales para su detección. Esto permite comprobar la correcta identidad de los tejidos de pacientes en casos dudosos por no existir correlación entre los hallazgos histológicos y el contexto clínico 173.

En trasplantes, la tipificación de HLA tradicionalmente se realiza mediante análisis inmunológicos. Sin embargo, la aplicación de análisis genéticos permite una mayor resolución174.

VARIANTES DE PCR175,80:

RT-PCR (reacción encadena de polimerasa-transcripción inversa)

Se utiliza para la detección y amplificación de ARN. Permite estudiar la expresión de determinados genes (su traducción a proteínas). En primer lugar se extrae el ARNtotal de las células en estudio y se separa la fracción correspondiente al mensajero (ARNm). Tras purificarlo el ARN se transcribe a ADN mediante una transcriptasa inversa, por cada molécula de ARNm se sintetiza una molécula de cADN monocatenaria que posteriormente se ha de convertir en bicatenaria utilizando una ADN polimerasa (la rTth ADN polimerasa de Thermus thermophilus es un enzima recombinante y termoestable que actúa como transcritasa inversa y como ADN polimerasa simultáneamente). A partir de aquí se aplica la técnica de PCR lo que permite una detección de la expresión de ARNm mucho más sensible que con Northern blot o con hibridación in situl76. La,80. secuencia del fragmento amplificado se determina mediante secuenciación automática de ADN. Existen diversos kits comerciales, como Gene Amp de ARN-PCR (Pekin-Elmer, Alemania) que pueden ser utilizados para RT-PCR,50,80

Aplicación en dermatología

La RT-PCR puede ser aplicada al ARN extraído de mínimos volúmenes de sangre o en material archivado como extensiones en laminillas así como en secciones de tejidos. Por ello, la RT-PCR es muy útil para detectar la presencia de virus ARN (como el virus del sarampión)177 y el análisis citogenético molecular de translocaciones cromosómicas176.

Esta técnica se puede usar por ejemplo para detectar la expresión proteica de antígeno específico prostático en células (detección de micrometástasis o células tumorales circulantes)178.

Las translocaciones en los tumores de piel y partes blandas son detectadas mediante RT-PCR (Tabla 6). En el liposarcoma mixoide y en sus variantes pobremente diferenciadas, la translocación t(12,16) origina un gen de fusión entre el gen CHOP gene y el gen FUS; y en los lipomas, el gen HMGI-C se reordena por alteraciones estructurales que afectan a la región 12q 14-15, un hecho que puede ser utilizado en el diagnóstico diferencial de este tipo de tumores 179,180.

TABLA 6. Cambios cromosómicos de tumores en Dermatología
Tumor Anomalía cromosómica
  Translocacions
Leiomioma t(12;14)(q14-15;q23-24)
Liposarcoma mixoide t(12:16)(113;p11)
Lipoma 12q14-15
Liposarcoma mixoide t(12;16)
Lipoblastomas Reordenamientos 8q
Sarcoma de células claras (melanoma maligno de partes blandas) t(12;22)(q13;q12,2ó12)
Tumor desmoplásico de células redondas pequeñas t(12;22)(q13;q11,2 ó 12)
Dermatofibrosarcoma protuberans y fibroblastoma de células gigantes t(17;22)
Linfoma anaplásico t(2;5)
Linfoma linfoblástico T t(1;14)
  Deleciones u otros cambios
Tumores lipomatosos atípicos Cromosomas en anillo
Lipomas intramusculares Alteraciones en 12q, 6p y 13q
Lipomas fusocelulares y pleomórficos Alteraciones en 16q
Hibernomas Alteraciones en 11q
Carcinoma epidermoide cutáneo Trisomía 7
Queratoacantoma Trisomía 7
Melanoma pérdidas en 6q, 9p y 10q
Linfomas T Alteraciones en 7p, 7q ó 14q

Los estudios genéticos en el angiolipoma subcutáneo, una lesión de partes blandas caracterizada por ser generalmente múltiple, con predilección por el sexo masculino y a veces hereditario, demuestran que su cariotipo es siempre normal, lo que los distingue claramente de los lipomas, lipomas fusocelulares y pleomórficos, lipoblastomas e hibernomas, que casi siempre muestran alteraciones cromosómicas clonales181.

TABLA 7. Genética de algunas enfermedades cutáneas183,195
Cromosoma Enfermedad Gen
1q Epidermólisis ampollosa juntural LAMB3 LAMC2
1q21 Queratodermia de Vohwinkel loricrin
3p Epidermólisis ampollosa DISTRÓFICA COL7A1
3q21-q24 Hailey-Hailey Desconocido
6p21 Queratodermia palmoplantar estriada desmoplaquina
8qter Enfermedad de Meleda(queratodermia palmoplantar) Desconocido
9p21 Melanoma  
9q22.3 Síndrome epitelioma basocelular nevoide  
10q Epidermólisis ampollosa juntural BPAG2 ó COL17AL
12q Nevus blanco en esponja Queratina 4(K4)
12q11-q13 Queratodermia palmoplantar focal, paquioniquia congénita K6a
12q13 Monilethrix Queratinas del pelo hHb1 yhHb6
12q14 Melanoma CDK4
12q23-q24.1 Enfermedad de Darier ATP2A2
14q11 Ictiosis lamelar Transglutaminasa-1(TGM1)
16q12-q13 Cilindromas múltiples familiares Desconocido
    Aldehidodeshidrogenasa grasa
17p11.2 Sjögren-Larsson (FALDH)
17q Nevus blanco en esponja K13
17q12-q21 Queratodermia palmoplantar focal, paquioniquia congénita K16, K17
17q Epidermólisis ampollosa juntural ITGB4
17q25 Queratodermia palmoplantar-cáncer esofágico envoplaquina
17q Psoriasis Desconocido
18q12.1 Queratodermia palmoplantar esriada Adherinas desmosómicas (desmogleinas)
18q11.2 Epidermólisis ampollosa juntural Lamininina alfa 3, LAMA 3
Wp22.3 Ictiosisligada a X Esteroide
Xq13.1 Displasia ectodérmica anhidrótica estodisplasina
Xq24-q27.1 Hipertricosis congénita generalizada Desconocido

En el dermatofibrosarcoma protuberans y el fibroblastoma de células gigantes se observa una translocación t(17,22), que origina una fusión entre el gen COLIAI del cromosoma 17, que codifica la proteína colágeno tipo I al (COLIA I), con el gen PDGFB del cromosoma 22, que codifica la cadena B del factor de crecimiento derivado de plaquetas. La proteína quimérica resultante COIA1/PDGFB, tiene actividad PDGFB que parece jugar un papel esencial en la oncogénesis de estas dos neoplasias, y el distinto comportamiento clínico de éstas se debe a otros factores adicionales182.

En algunas familias con incidencia elevada de melanoma cutáneo se ha localizado el gen responsable en el cromosoma 9p21, que codifica la proteína p16INKA4a, y actúa como un gen supresor de tumor pues es un inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina y complejos de ciclina (como CDK4-ciclina DI) que fosforilan la proteína del retinoblastoma. También se ha descrito mutación de CDK4 (que puede actuar como un oncogén) en algunos melanomas183.

La identificación de células tumorales circulantes en la sangre periférica de pacientes con melanoma es posible mediante la utilización de RT-PCR para analizar transcripciones (ARNm) de proteínas asociadas al melanoma (tirosinasa, Melan-A/ MART-1, MAGE-3, gp100, y p97). En el estadio II un 23,8% y en el estadio IV un 37,5% de los pacientes presentan muestras positivas para al menos uno de esos marcadores en RT-PCR. Aunque el análisis de la proteína S-l00 en suero (LIA análisis de inmunoluminometría) parece ser más sensible, RT-PCR podría ser útil para la detección de micrometástasis en tejidos184.
En las enfermedades congénitas o degenerativas de la piel se ha descrito numerosas alteraciones cromosómicas (Tabla 7).

Una de las causas de síndrome hiper IgE, en pacientes con historia prolongada de eccema, abscesos por estafilococos y neumonía recurrente son las alteraciones cromosómicas, como la pentasomía X, aunque el mecanismo de estos síndromes hiper IgE es desconocida187.

El estudio de ARNm y de su expresión proteica se utiliza para conocer mejor los mecanismos inmunológicos y de la inflamación. De esta forma, en sujetos atópicos, se ha comprobado que la eotaxina juega un papel importante en la reclutación de eosinófilos en las primeras 6 horas, mientras que la eotaxina-2 y la proteína quimifiláctica para monocitos-4 (MCP-4) participan a las 24 horas188. Por otra parte, en la dermatitis atópica se observa una expresión elevada de ARNm de interleuquina-4, sobre todo en las lesiones agudas, mientras que en las lesiones crónicas se observa un mayor número de células positivas para ARNm de IL-5, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GMCSF) e IL-12(p40), conclusiones similares se obtienen tras el estudio mediante hibridación in situ de los receptores de estas citoquinas. Además, se ha observado un marcado incremento de células positivas para el ARNm de receptores GM-CSFRalfa y IL-2Rbeta2 en la piel con psoriasis189.

En el liquen plano, el estudio de ARNm de interleuquina 6 e interferón gamma ha demostrado que estas citoquinas proinflamatorias se producen en el liquen piano tanto por linfocitos T activados como por queratinocitos alterados, lo que podría hacer perdurar la lesión190.

También se ha empleado RT-PCR en el estudio de citoquinas (interleuquina{IL}-2, IL-4 y IL-10) en la dermatitis por hipersensibilidad de contacto, comprobándose un nivel elevado en estas reacciones, mientras que en la dermatitis por mecanismo imtativo no se detecta elevación en el ARN de estas citoquinas191.

En sangre periférica y en biopsias de piel, es posible estudiar el patrón de respuesta inmunológica en las reacciones asociadas a daño tisular en la lepra lepromatosa mediante el estudio de citoquinas por ELISA y RT-PCR del ARNm de céiulas mononucleares. Así, se ha observado que los pacientes de lepra lepromatosa sin reacciones tienen un patrón T helper2 (Th2) y Th0, mientras que los enfermos con reacciones muestran una respuesta tipo Th 1, con presencia de interferón gamma y ausencia de interleuquina 4 y IL-12 p4O192.

La psoriasis es una enfermedad cutánea mediada por células Th 1, que se ha asociado a infecciones por estreptococo beta-hemolítico del grupo A, el cual presenta péptidos (M6), cuyo ARN puede ser detectado mediante RTPCR, con secuencias de aminoácidos similares a las queratinas epidérmicas humanas193.

En el eritema nodoso, la expresión de genes de las citoquinas IL-2 e interferón-gamma en biopsias de piel y en sangre periférica indica una respuesta inmune tipo Th 1, independientemente del agente causal194.

Utilización terapéutica

En el estudio de nuevas dianas para la inmunoterapia del melanoma, se estudia la expresión de ARNm de determinados antígenos, como el Melan-A196, para comprobar que este producto sea específico de células melánicas, lo que a su vez proporciona una herramienta útil de diagnóstico, gracias al desarrollo de anticuerpos monoclonales aplicables a tejido en fresco y fdado en parafina, muy útiles para detectar micrometástasis en el estudio de ganglios linfáticos centinelas197.

En el estudio de enfermedades inflamatorias de la piel, puede utilizarse RT-PCR para valorar el efecto y mecanismo de acción de determinados fármacos. Así, se ha demostrado que los corticosteroides tópicos disminuyen la expresión de ARNm de E-selectina, segregada por las células endoteliales en el proceso inflamatorio198.

El análisis de citoquinas mediante RT-PCR en alopecia areata demuestra que el patrón de citoquinas es Th1 y se modifica (aumento de IL-2, IL-8, IL- 10, y factor de necrosis tumoral alfa) durante el tratamiento inmunoterápico tópico (difenilciclopropenona), por lo que el tratamiento con IL-10 recombinante podría ser útil en estos pacientes199.

PCR asimétrica

Produce fragmentos de ADN de cadena simple al utilizar los dos cebadores necesarios a concentraciones molares distintas en una relación entre 50/1 y 100/1. así se produce ADN de doble cadena en cantidad exponencial hasta que se agota el cebador minoritario y luego sólo se produce la cadena que hibrida con el ADN que se encuentra en exceso, produciéndose a partir de entonces de forma lineal. De esta forma el producto de PCR contiene 10 a 20 veces más de ADN monocatenario que de ADN bicatenario. Recuperando exclusivamente el ADN monocatenario se puede utilizar para una secuenciación directa con la técnica de Sanger 200,80

PCR anclada

Permite la amplificación de ADN o ARN cuando sólo se conoce el extremo 3'de la secuencia de interés. Por ejemplo, el extremo 5' de la región a amplificar es artificialmente creado añadiendo una cola de nucleátido definida utilizando la enzima terminal deoxinucleotidiltransferasa (Tdt). Esta cola, a su vez sirve de secuencia que ahora puede ser reconocida por un iniciador 5'. A partir de aquí se realiza PCR convencional201.


PCR anidada ( "meste" PCR)

Se realizan dos PCR consecutivas de 25 a 30 ciclos cada una. En la primera se utilizan un par de cebadores llamados externos; en la segunda se usan cebadores complementarios a secuencias de ADN contenidas en los fragmentos que se amplificaron en la primera PCR (cebadores internos) que flanquean una región central que es la que queremos amplificar202,80 . La idea que persigue esta técnica es que los productos de la primera amplificación son un molde ideal para la segunda amplificación, mucho mejor que el ADN genómico original203.

Dada su enorme sensibilidad, uno de los peligros de esta técnica es la contaminación, por lo que su utilización es difícil en laboratorios de rutina204.

En el estudio de los genes IgH, el ADN genómico puede ser amplificado utilizando oligonucleótidos específicos para la región variable (FR2A) y de unión (LJH). La secuencia obtenida es comparada con la secuencia VH de línea germinal utilizando programas informáticos como HUSAR84.

Aplicación en dermatología

Este sistema sirve para aumentar la sensibilidad y especificidad de la reacción y se utiliza cuando partimos de cantidades muy bajas de ADN problema.

Se ha diseñado protocolos de consenso específicos para la detección de un amplio espectro de HPVs cutáneos no genitales o asociados a epidermodisplasia verruciforme205.

En tejidos incluidos en parafina, el estudio de productos de PCR anidada obtenidos con iniciadores que codifican una proteína de 65 Kca común a todas las micobacterias, se ha observado que en un 80% de las lesiones cutáneas de sarcoidosis, una enfermedad granulomatosa sistémica, se identifica ADN de micobacterias. Mediante el análisis del patrón de enzima de restricción en estos productos de PCR (PCR/REPA) se ha subclasificado las micobacterias detectadas en estos tejidos y han sido M. tuberculosis complex, M. avium-intracellulare y M. kansasii206.

Con la variante "anidada" de PCR-electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización se detecta hasta un 90% de clonalidad en el receptor TCR-gamma en lesiones de micosis fungoides en todos los estudios207.

Sin embargo, puesto que en un 6% de las biopsias de piel con procesos inflamatorios benignos (incluyendo pitiriasis liquenoide y varioliforme aguda o parapsoriasis de pequeña placa entre otros) también presentan monoclonalidad de células T, debe realizarse siempre una correlación entre el estado de la clonalidad con las características morfológicas e inmunofenotípicas que ayuden a diferenciar los infiltrados linfocitarios benignos de los linfomas cutáneos207.

PCR semianidada ("semi-nested' PCR)

Es una PCR anidada en la que sólo se utiliza uno de los cebadores internos. El método no añade mucha especificidad pero en ciertas aplicaciones añade la suficiente especificidad para conseguir el producto PCR deseado203. De esta forma, para la detección de genes IgH reordenados clonalmente puede utilizarse PCR semi-anidada 84.

"Drop-In/Drop-Out Nested" PCR

Esta técnica se basa en incluir cebadores internos (anidados) con el punto de fusión significativamente más bajo que los cebadores externos, lo que evita que esos cebadores internos se hibriden (annealing) durante la primera PCR. Con este método se evita la utilización de capas de aceite que de otra forma serían necesarias para separar los reactivos de las dos PCRs203.

PCR múltiplex

Consiste en hacer diversas amplificaciones en el mismo tubo de reacción colocando múltiples parejas de cebadores. Las secuencias a detectar han de estar lo suficientemente lejos unas de otras para que las amplificaciones no interfieran entre sí8O.

Esta técnica se utiliza en la detección del gen de la distrofina en la distrofia muscular de Duchenne; un gen enorme (de mas de 2 millones de pares de bases), que no es adecuado para ser estudiado mediante análisis indirecto, y que además presenta una marcada heterogeneidad en sus mutaciones208.

El análisis de sonda fluorogénica, desarrollado en 1997, es un método sencillo que puede ser aplicado a la detección de HPV y subtipos en varios tipos de muestras. La técnica se basa en la actividad 5'->3´ exonucleolítica de la Taq polimerasa que aumenta la señal de marcadores fluorescentes al liberarlos de las sondas especificas para esos genomas durante PCR múltiple. Esa fluorescencia puede ser detectada en un fluorómetro automático y se correlaciona con la cantidad de ADN de HPV presente en la muestra antes de la amplificación209.

"Touch-down" PCR

Es una reacción de PCR en dos partes. En la primera parte, que dura 20 ciclos, se empieza con una temperatura de hibridación elevada y se va disminuyendo hasta la temperatura de hibridación óptica; esto evita la formación de dímeros de cebadores en las primeras fases. Luego, en la segunda parte, se hacen otros 20 ciclos más a la temperatura de hibridación óptima para que se produzca cantidades masivas de ADN. Se utiliza cuando se trabaja con cebadores degenerados porque es difícil calcular la temperatura de hibridación óptima8O, también es útil cuando
no se ha determinado exactamente el grado de complementariedad del molde del cebador, pero esta técnica tiene algunos inconvenientes, como requerir una programación complicada, sobre todo en las máquinas equipadas para reducir automáticamente y progresivamente la temperatura en cada ciclo sucesivo203.

"Hot start" PCR

Consiste en empezar la PCR a una temperatura elevada. Antes de calentar la muestra ya se puede formar dímeros y uniones inespecíficas si la Taq polimerasa está presente. Para evitarlo se añade la Taq polimerasa en último lugar antes de comenzara ciclar, a una temperatura de 95°C80. Con la Amplitaq gold de Perkin-Elmers no es necesario este paso porque sólo se activa tras el Primer calentamiento16

PCR cuantitativa

Se utiliza un segundo objetivo dentro de la muestra que sirve de control interno para la síntesis de cADN y se basa en la competencia de los iniciadores por las dos secuencias objetivo. Es muy difícil y casi nunca se usa80

PCR "ín situ"

Consiste en realizar la PCR directamente sobre cortes de tejido o extensiones citológicas de forma que, posteriormente, se puede detectar los productos de PCR amplificados en el lugar donde se localiza el ADN (o ARN) original en la muestra, en lugar de utilizar un gel o una membrana80 En realidad este término se ha utilizado indistintamente para denominar dos técnicas diferentes:

PCR-hibridación in situ (PISH)

Consiste en realizar una PCR sobre el corte de tejido o la extensión citológica y después detectar el ADN amplificado mediante hibridación in situ con sondas complementarias marcadas colorimétricamente (avidina-biotina-peroxidasa).

Aunque técnicamente compleja, es utilizada para detectar la infección latente de VIH en cortes histológicos, por ejemplo, en ganglios linfáticos, músculo esquelético, o cérvix, en individuos portadores asintomáticos210.

Utilizando PCR hibridación in situ podemos detectar una única copia de genoma del virus del papiloma humano (HPV) en una célula determinada. Esto permite localizar células que contienen el virus en infecciones ocultas94. Utilizando PCR in situ, se ha detectado en ADN del HPV en algunas lesiones no diagnósticas en vulva y pene que fueron negativas para hibridación in situ, frecuentemente por estar ocultas tras una capa granulosa engrosada focalmente o por hiperqueratosis94.

Si el virus no puede ser detectado mediante PCR in situ, es muy improbable que esté presente en esa sección tisular Sin embargo, su complejidad y la pérdida de calidad del tejido después de sucesivos calentamientos y su elevado costo no hacen de la hibridación in situ una alternativa válida en el trabajo diario.

El virus del sarampión también puede ser localizado en tejido gracias a esta técnica311.

PCR in situ (en sentido estricto)

Consiste en realizar una PCR sobre el corte de tejido o la extensión citológica utilizando dNTPs (nucleótidos) o cebadores marcados colorimétricamente o con fluorescencia.

En ambos casos es necesario utilizar termocicladores con bloque térmico adaptado a la utilización de portas. Para evitar las uniones del ADN en el área de interés se utiliza irradiación ultravioleta (y se procede como en la PCR convencional) o se combina PCR con hibridación in situ, como hemos visto más arriba.

PCR de célula única

Se ha utilizado en el análisis preimplantación del gen de la fibrosis quística en una célula única extraída de un embrión de ocho células212, en el análisis de esperma y en el estudio de la expresión de genes en células de Reed-Sternberg213.

PCR-inmuno

Se emplean dos tecnologías, la detección basada en anticuerpos y PCR, La detección del antígeno por el anticuerpo se ve enormemente potenciada por la conjugación del sistema de detección del anticuerpo con un fragmento de ADN que posteriormente es amplificado mediante PCR. Esta técnica recuerda a ELISA (análisis inmuno absorbente ligado a enzima) y permite detectar incluso 10 femtogramos de proteína. Una variación de PCR-inmuno es el empleo de cromógenos unidos a uno de los cebadores o iniciadores, y la posterior determinación colorimétrica de la cantidad de producto generado214.

TÉCNICAS PARA DETECCIÓN DE MUTACIONES PUNTUALES

El cribado de mutaciones puede incluir la detección de alteraciones específicas y conocidas en la secuencia de nucleótidos en lugares concretos previamente determinados que contienen mutaciones, o puede realizarse la detección de mutaciones dispersas en varios lugares dentro de un segmento de ADN. Se ha empleado varias técnicas para identificar mutaciones en lugares previamente determinados, que con frecuencia se aplican tras la realización de PCR. Entre ellas, destacamos la hibridación de oligonucleátidos específica de alelo, la amplificación específica de alelo (ya sea a través de PCR con iniciadores que reconocen la secuencia alterada en sus extremos 3'o mediante la reacción en cadena de la ligasa), y procedimientos que crean o destruyen los lugares de restricción215.

La detección de mutaciones en lugares indeterminados del ADN puede ser realizada en segmentos que contienen una secuencia conocida o cuando no se dispone de información de la secuencia en la región que se está estudiando; esto último, por supuesto, supone una complicación considerable. Una solución posible es el rastreo de discordancias genéticas (genomic mismatch scanning)215.

MÉTODOS DE CRIBADO PARA LA DETECCION DE MUTACIONES NO CONOCIDAS (Rastreo del gen)

Según el nivel de información de que dispongamos, podremos utilizar cada una de las técnicas aquí descritas (Tabla 8). En general, SSCP (polimorfismo estructural de cadena simple) y DGGE (electroforesis en gel en condiciones desnaturalizantes) están indicadas para el cribado de mutaciones, es decir, para confirmar o no la existencia de mutaciones. Por otro lado, EMC (método de la rotura enzimática) y CCM (método de la rotura química) son útiles para conocer cuántas mutaciones existen y dónde están localizadas. Por último, la secuenciación nos permite conocer cuál es la mutación203

En un gran número de enfermedades genéticas se desconoce la secuencia de los genes e incluso su localización en los cromosomas. Para ello, se hace uso de las variaciones naturales que se producen en las secuencias de ADN (polimorfismos)216. Otros métodos están basados en el análisis de la secuencia del ADN. Un tercer grupo lo constituyen los métodos estructurales, basados en la movilidad alterada en electroforesis que presenta el ADN mutado, que tienen una sensibilidad moderada para detectar mutaciones raras en mezclas de fragmentos (alrededor de un 10% de fragmentos con mutaciones). Por último, se utiliza las técnicas basadas en el reconocimiento de discordancia de bases (sustancias químicas o proteínas que actúan en las bases no concordantes de ADN); puesto que estas técnicas trabajan con heterodúplex de fragmentos mutados y normales de ADN, no pueden ser aplicadas a fragmentos de ADN amplificados de células mutadas homocigotas, a diferencia de las técnicas estructurales. Esta limitación puede ser obviada añadiendo ADN normal a la mezcla de PCR203.

TABLA 8. Indicaciones de las técnicas de rastreo del gen
Nivel de información Información buscada Método
Cribado ¿Hay o no hay mutación? SSCP, DGGE
Rastreo ¿Cuántas y dónde se localizan? EMC, CCM
Identificación ¿Cuáles son las mutaciones? Secuenciación

Secuenciación

Consiste en la identificación de la secuencia de bases de un determinado fragmento de ADN. Se utiliza para corroborar mutaciones detectadas con otras técnicas (PCR-SSCP DGGE, ASO, etc.). Existen dos formas de secuenciar un producto de PCR.

Secuencia directa

Se purifica el producto de PCR separando el producto amplificado de otros elementos presentes en la muestra (dímeros de oligonucleátido, sales, dNTPs, iniciadores Y Taq polimerasa)21. Una vez obtenida la cadena deseada, si el ADN es bicatenario hay que desnaturalizarlo por calor o con álcali (este paso no es necesario si tenemos ADN monocatenario como por ejemplo en el producto de PCR asimétrica217. La secuenciación directa es el estándar para la detección de sustituciones de una sola base. Aunque la técnica es algo complicada, hoy día puede ser automatizada218. Los resultados de la secuenciación directa pueden ser analizados: a. mediante la evaluación de los productos de PCR en electroforesis en gel; b. utilizando un escáner para estudiando la secuencia obtenida y valorándola con un software específico; y c. analizando la secuencia mediante un analizador de mutaciones es la posibilidad de definir "regiones calientes": en la secuencia que se presentan al usuario para su análisis visual, independientemente del estado de mutación que tengan. Esto es especialmente útil cuando se desea analizar una región determinada, como mutaciones específicas en una población mixta de VIH219.

Secuenciación indirecta

Se realiza tras la clonación del producto amplificado. La cionación del ADN consiste en introducir una secuencia del genoma en un vector, que puede ser bien un lago viral o bien un plásmido (los plásmidos están constituidos por ADN circular extracromosómico que está presente en las bacterias y que se replica de forma independiente del ADN bacteriano, generalmente son los portadores de genes de resistencia a antibióticos2l.

En ocasiones para clonar grandes fragmentos de ADN se utilizan los cromosomas artificiales de la levadura "YACs (yeast artificial chromosome)" en vez de los plásmidos. En los YAC es posible clonar fragmentos de ADN 1000 veces mayores que en los plásmidos21.

Los métodos clásicos de secuenciación son: enzimático, que requiere un ADN molde de cadena simple (como el bacteriófago M 13 o el plásmido PUC) y añadiendo a la mezcla del ensayo el fragmento mayor de la ADN polimerasa y los cuatro deoxinucleótidos trifosfato precursores marcados radioactivamente, y químico, que mediante reactivos químicos (metilación, ácido fórmico, piperidina , etc.) permite romper la cadena de ADN de modo selectivo en cada una de las posiciones ocupadas por las cuatro bases modificadas. Los vectores de clonación facilitan la obtención de ADN marcado21. Otro método es la secuenciación quimioluminiscente, en el que la secuenciación enzimática se lleva a cabo con un cebador estándar, no marcado, y tras la secuenciación y electroforesis se fijan los productos de la secuenciación a una membrana de nylon, la cual se híbrida con un oligonucleótido biotinilado complementario al cebador utilizado. Actual mente, estos protocolos están controlados por secuenciadores automáticos, que proporcionan gran rapidez y comodidad, incrementando la eficiencia de la secuenciación21.

Aplicación en dermatología

Este método permite disponer de un método sensible y rápido para el cribado de mutaciones de p53 en el estudio de cáncer de piel inducido por radiación UV220.

Más de un 50% de pacientes con dermatitis atópica tienen test cutáneo e IgE específica positivos para Malassezia furfur. Este hongo es capaz de producir un amplio abanico de proteínas que fijan IgE. Para valorar la participación de estos componentes en la enfermedad se ha clonado los alergenos de M. furfur, se ha secuenciado los insertos y se ha elaborado proteínas recombinantes en fagos Escherichia coli. De esta forma se ha identificado dos genes: Mal f5, similar al identificado en Aspergillus fumigatus, y Mal f6, muy parecido a la ciclofilina22l. En el caso de M furfur 2 y M furfur 3, sus secuencias son similares a las proteínas de la membrana de peroxisoma de Candida boidinii y un aiergeno de Aspergillus fumigatus, AsP f399.

La secuenciación es el método de elección para monitorizar cambios lentos en una determinada secuencia a lo largo del tiempo, por ejemplo, la progresión de la resistencia a AZT con el tiempo, debido a mutaciones del VIH-1203.

El gen que origina la enfermedad de Darier codifica una bomba de calcio, según se ha comprobado tras análisis de secuencia en un cromosoma artificial de levadura que incluía la región crítica de la enfermedad. Tras un estudio posterior de Northern Blots y RT-PCR se estudió la expresión de los genes en queratinocitos y se encontraron defectos en ATP2A2 (o SERCA2, una ATPAsa Ca2+ lenta del retículo sarcoplásmico del músculo estriado)222.

RFLP. Análisis de fragmentos de restricción mutación, mediados por iniciadores o no

El RFLP (restriction fragment lenghth polymorphism) utiliza enzimas (endonucleasas) de restricción que rompen el ADN en determinadas secuencias, de existir una mutación en estas secuencias no se produciría la rotura y el número de fragmentos observado en electroforesis será menor que de no existir la mutación. Existe una modificación en la técnica en la que, en el caso de que el fragmento que queremos detectar mutaciones no haya ninguna secuencia susceptible de reconocimiento por ninguna enzima de restricción, se introduce la secuencia sensible a la rotura por el enzima de restricción en el iniciador de la PCR de forma que esta secuencia que de justo en la vecindad de los posibles sitios de las mutaciones que buscamos. Como resultado de la sustitución de bases, de existir esta mutación, el sitio de restricción es irreconocible por el enzima.

Cuando las sondas son probablemente dirigidas contra un gen o una región cercana a éste, que puede ser desconocido, pero se cree que se asocia con una determinada enfermedad o locus, se habla de análisis indirecto, análisis de relación o linkage analysis. Un alelo se define como "relacionado" a un gen causante de una enfermedad si se encuentra en individuos afectados con una frecuencia mayor que la esperada por el azar La asociación de una enfermedad con un haplotipo genético relacionado se denomina desequilibrio de relación (linkage dysequilibrium)223.

Los estudios de análisis de relación han sido esenciales en el estudio de enfermedades hereditarias, aunque sólo pueden ser utilizados cuando existe polimorfismo en un determinado locus. Otro requisito es que debe existir una familia con varios sujetos afectados, y todos deben participar en el estudio. Por otra parte, otra limitación es que no todas las familias afectadas ofrecerán datos relevantes para un determinado marcador polimórfico relacionado223. Por ello, el diagnóstico molecular está evolucionando hacia otras técnicas que permiten la detección directa pues los genes específicos están siendo clonados y caracterizados y se están identificando las mutaciones correspondientes.

Una ventaja de esta técnica es que, si se conoce la localización cromosómica del gen marcador, puede establecerse la localización cromosómica del lugar polimórfico (por tanto del gen mutante con él relacionado). De esta forma ha sido posible localizar el gen de la fibrosis quística en el cromosoma 7, lo que en último término ha permitido su clonación. La lista de enfermedades de un solo gen en el que el análisis de relación es útil continúa creciendo y entre ellas se encuentran la distrofia muscular de Duchenne, el síndrome del cromosoma Xfrágil, la enfermedad poiiquística renal y la neurofibromatosis224.


Aplicación en dermatología

Esta técnica se ha empleado en el diagnóstico de la anemia de células falciformes, pues en el gen normal de la beta-globina (HbA) existen tres lugares que son reconocidos específicamente por la enzima de restricción Mst II225.

En la detección de portadores y en el diagnóstico prenatal de enfermedades con importante heterogeneidad en sus mutaciones, como la hemofilia A y B, cuyos genes, además son de gran tamaño, lo que impide un examen rápido de todos sus exones, se utiliza linkage analysis indirecto con RFLPs, lo que hace necesario disponer de numerosos miembros de la familia226.

En la atriquia universal congénita o atriquia con lesiones papulosas (una forma hereditaria de alopecia, en el que la pérdida de pelo ocurre poco después del nacimiento y años después se sigue una erupción papulosa difusa) el análisis de relación usando marcadores microsatélites de la región del gen de la pérdida de pelo (hairless) humano demuestra que el locus de la atriquia con lesiones ampulosas se encuentra en la región cromosómica 8p 12227,228. En esa misma región se ha detectado el gen responsable de la hipotricosis de Marie Unna, un trastorno autosómico dominante que aparece en la infancia229. Existen otras formas hereditarias de alopecia que no están relacionadas con el gen de la pérdida de pelo humano del cromosoma 8230.

En la porfiria cutánea tarda esporádica se ha estudiado la mutación de un gen similar a MHC clase I cuya mutación se piensa que es la causa de la hemocromatosis. Con la digestión por enzimas de restricción de ADN genómico amplificado por PCR es posible detectar esta mutación en donantes de sangre sanos. La mutación Cys282Ty aparece en un 44% de los pacientes y un 11% de los controles, por lo que son necesarios estudios posteriores sobre esta enfermedad231.

En la dermatitis atápica, el estudio mediante PCR-RFLP en sangre periférica muestra un predominio significativo (85%) de homocigotos para alelos acetiladores lentos (N-acetiltransferasa 2, NAT2) entre los pacientes con dermatitis atópica, frente a un 54% en sujetos sanos232. otros estudios describen una mayor frecuencia de acetiladores rápidos en pacientes con dermatitis alérgica de contacto que en controles233.

El estudio W polimoffismo alélico del gen quimasa de mastocitos (MCC, una proteasa sérica segregada por los mastocitos) indica que las variantes genéticas del gen MCC se asocian sobre todo al eccema atópico solitario, con IgE sérica inferior a 500 IU/mL, y no se asocian sobre todo al eccema atópico con enfermedad respiratoria y una IgE sérica superior a > 2000 IU/mL234.

En familias japonesas se ha observado que las diferencias en la actividad transcripcional del gen de IL4 influye en la predisposición a dermatitis atópica, al estudiar el polimorfismo del gen
IL4235. En otros estudios, usando marcadores muy polimórficos, se observa vínculos entre la dermatitis atópica y marcadores del cromosoma 11q13 (como D11S903 y el gen del receptor IgE de gran afinidad {FCER 1 B ó Fc(epsilon) RI-b Leu 181}236,237.

Las técnicas genéticas son útiles para explicar cómo los defectos en la angiogénesis participan en ciertas anomalías vasculares. Las mutaciones en genes de los receptores del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGFR-w y VEGFR-2) y los defectos en el gen responsable de la producción deVEGF son letales para el embrión en desarrollo por causar errores en la diferenciación endotelial normal y en la formación de vasos238. Por otra parte, las mutaciones de los genes de los receptores de la tirosinquinasa Tie-1 y Tie-2 se asocian a malformaciones hereditarias venosas en varias familias238.

La telangiectasia hemorrágica hereditaria o síndrome de Rendu-Osler-Weber es una anomalía vascular sistémica autosómica dominante, causada por mutaciones en genes de algunas proteínas expresadas por las célula endoteliales (proteínas de unión al factor del crecimiento transformante beta, endoglina y quinasa similar al receptor de activina)238 .

En la cavernomatosis familiar cerebral asociada a angiomas cutáneos, un trastorno autosómico dominante, se ha identificado el gen causante en el cromosoma 7q, mientras que el gen del síndrome de malformación vascular autosómico dominante en el que las lesiones predominantes son cutáneas, se ha mapeado en el cromosoma 9p21239 . En el síndrome de Bean o de nevus vejiga de caucho azul, caracterizado por múltiples hemangiomas azulados de la piel y el tracto gastrointestinal, el gen se ha identificado en el cromosoma 9p240. En otras familias con hemangiomas infantiles, que también se heredan de forma autosómica dominante con alta penetrancia, el análisis de relación localiza el gen en el cromosoma 5q241.

El gen de la neurofibromatosis tipo I se localiza en el cromosoma 17 y el gen del tipo II se ha situado en el cromosoma 22. En el síndrome von Hippel-Lindau el gen se ha localizado en el cromosoma 3p25-26242.

En estudios genealógicos, el locus responsable del síndrome de Marfan ha sido localizado en el cromosoma 15q21.I, que codifica la fibrilina 0. Las mutaciones en la fibrilina 2 originan la aracnodactilia crontractural congénita, las fibrilinas son microfibrillas que solas, o en combinación con la elastina confieren las propiedades biomecánicas al tejido conjuntivo. Dada la heterogeneidad del gen de la fibrilina I, el diagnóstico prenatal y presintomático del síndrome de Marfan que es posible mediante RT-PCR, está limitado a unas pocas familias243.


Técnicas estructurales

-DGGE/TGGE Electroforesis en gel en condiciones desnaturalizantes /Electroforesis en gel con gradiente de temperatura

La DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis)/ TGGE (temperature gradient gel electrophoresis) es el método más eficaz y utilizado. Se realiza una electroforesis del ADN de doble cadena a través en gel con concentraciones crecientes de un agente desnaturalizante (urea o formamida) o en el que la temperatura es creciente. Así, el ADN de doble cadena se disocia dependiendo de su conformación a una temperatura o una concentración de desnaturalizante diferente dependiendo de la existencia o no de mutaciones. Esto hace que, de existir una mutación en el fragmento de ADN estudiado previamente amplificado por PCR, habrá bandas diferentes a las que aparecen en la electroforesis de ese mismo fragmento de ADN estudiado previamente amplificado por PCR, habrá bandas diferentes a las que aparecen en la electroforesis de ese mismo fragmento de ADN normal. Este método permite separar segmentos de ADN de menos de 1 kb de longitud que contienen una única mutación244.

Una variante de esta técnica es la electroforesis en gel en condiciones desnaturalizantes constantes (CDGR), en la que la concentración del agente desnaturalizador químico sea constante y cercana a la que separa las cadenas del fragmento normal215

Los inconvenientes de esta técnica es que sólo permiten detectar fragmentos de ADN de hasta 600 bp, requiere un equipo sofisticado y las condiciones exactas del gen a menudo han de ser determinadas para cada fragmento examinado. La limitación en el tamaño del fragmento de ADN puede evitarse utilizando electroforesis bidimensional, en la que la separación por tamaño de fragmentos ocurre en la primera dimensión bajo condiciones del gel constantes y la separación por secuencia ocurre en la segunda dimensión mediante DGGE215.

Algunos genes son resistentes al método DGGE debido a su alto contenido en nucleótidos G+C. En estos casos puede utilizarse SSCP que es fácil de realizar. aunque debe definirse cuidadosamente las condiciones de trabajo245.

Aplicación en dermatología

Mediante PCR con iniciadores específicos para segmentos Vgamma 1-8 y Vgamma9 del gen del receptor de linfocitos T (TCR-gamma), en combinación con electroforesis en gel en condiciones desnaturalizantes (PCR-DGGE), se ha observado que un 66% de micosis fungoides en estado en placa y un 100% de micosis fungoides en estadio tumor o de linfomas cutáneos de células T pleomórficos presentan reordenamientos clonales del gen TCR-gamma, mientras ninguno de los pseudolinfomas cutáneos de células T, estudiados presentaban este reordenamiento246.
En los estudios comparativos entre las diversas técnicas de electroforesis para la demostración de poblaciones clonales de células T en biopsias de piel y su diagnóstico diferencial con dermatosis inflamatorias, la electroforesis en gel con gradiente de temperatura cargada con heterodúplex (HD-TGGE) y el análisis de fragmentos son más sensibles que la electroforesis en gel de poliacrilamida cargada con heterodúplex en geles MDE (mutation detection enhancement). Por su coste, la más recomendable es HD-TGGE247.

-SSCP Polimorfismo estructural de cadena simple

Bajo ciertas condiciones, los ácidos nucleicos monocatenarios adoptan estructuras tridimensionales secundarias en solución. Estas estructuras varían dependiendo de la composición de las bases y pueden resultar alteradas por el cambio de una única base. Esto hace que, si existe mutación en el ADN estudiado, la estructura tridimensional que adopta éste sea diferente de la que adopta el ADN normal de control, por lo que las bandas obtenidas en la electroforesis de ambos productos serán diferentes debido a que la agarosa (o poliacrilamida) ofrecerá distinta resistencia al paso del ADN dependiendo de su estructura tridimensional (bajo condiciones no desnaturalizantes215.

SSCP (single-strand conformation polymorfism) es una técnica relativamente simple que se utiliza en el cribado inicial de mutaciones. Si se observa una banda anormal, ésta puede ser extraída del gel y, posteriormente, secuenciada directamente los productos amplificados mediante PCRIII. Permite analizar fragmentos de ADN de hasta 250-300 bp y con múltiples geles, permite detectar hasta el 95% de las mutaciones215.

Aplicación en dermatología

Se utiliza para detectar mutaciones en toda la región de codificación del gen p53. Las mutaciones de p53, estudiadas con PCR-SSCP se encuentran más frecuentemente en carcinomas epidermoides infiltrantes que en el carcinoma in situ (enfermedad de Bowen) o microinfiltrante126. También se asocian a linfomas cutáneos primarios y a la evolución de micosis fungoides estadio placa a estadio tumoral143 y a la transformación histológica del linfoma folicular en un linfoma difuso más agresivo249. Sin embargo, tanto SSCP como el análisis de secuenciación de ADN puede dar lugar a falsos negativos debido a la presencia de células del estroma o células normales residuales en la biopsia, aunque en el examen microscopico preliminar predomine la presencia de células tumorales. Por otra parte, SSCP permite detectar mutaciones puntuales en fragmentos que no son mayores de 300 bp250.

También se utiliza en el estudio de gen supresor tumoral hptc (patched), cuyas mutaciones se describen en el epitelioma basocelular y parecen ser más frecuentes en el epitelioma basocelular esporádico (30%) que en el asociado a xeroderma pigmentoso (11%). Además, se ha comprobado la coexistencia de mutaciones en p53 y en hptc en un 50% de los epiteliomas basocelulares asociados a xeroderma pigmentoso251.
Los estudios moleculares permiten asimismo estudiar el origen histogenético de algunas células. De esa forma, el descubrimiento de polimorfismo de la molécula CDla en célula de Langerhans de donantes en los receptores de trasplante de médula ósea, parece indicar un origen en médula ósea de este tipo celular. Que a su vez podría representar un dendrocito inmaduro. Otra prueba de dicho origen es la presencia de cromosomas Y en las células de Langerhans en mujeres trasplantadas con la médula ósea de donantes varones252.

- Análisis de heterodúplex

Se somete una mezcla de ADN control y de ADN a estudio a desNatluralización por calor y a reacoplamiento (reannealing) posterior Si no existe mutación sólo se producen homodúplex (cadenas que emparejan todos sus nucleótidos) pero si existe la mutación se producen tanto homodúplex como heterodúplex (cadenas que no emparejan 100% puesto que algunos de sus nucleótidos son distintos). Los homodúplex y los heterodúplex tendrán distintas movilidades electroforéticas. Así, de existir la mutación aparecerán dos bandas y de no existir sólo una(253).
Se realiza en geles no desNatluralizantes y tiene la ventaja de no necesitar controlar las condiciones del análisis para cada fragmento de ADN. Por otro lado, el método HET detecta un número menor de mutaciones que DGGE y suele utilizar junto con otros métodos215.

Aplicación en dermatología

El cribado molecular de algunos genes, como el colágeno VII (COL7AI) en pacientes y familiares puede realizarse mediante análisis de heterodúplex, que permite detectar mas del 90% de las mutaciones de este gen. Este gen se encuentra alterado en la epidermólisis ampollosa distrófica, pero no se identifica mutaciones en el síndrome de Kindler un raro trastorno caracterizado por ampolla acrales en la infancia temprana y poliquilodermia generalizada con marcada atrofia cutánea y en el que se desconoce el lugar exacto de la dehiscencia253.
El gen de la laminina 5 se ha mapeado en el cromosoma 8. Su expresión está muy reducida en la epidermólisis ampollosa juntural grave de Herlitz y generalmente se detecta en la epidermólisis ampollosa juntural no let al254.

-Electroforesis con concentraciones de disolventes parcialmente desNatluralizantes

Esta técnica es poco utilizada y permite detectar mutaciones en fragmentos de hasta 800 bp2l5.

Métodos basados en los errores de acoplamiento

-Método de la rotura por ARNasas

Bajo determiNatllas condiciones los puntos donde hay errores en el acoplamiento (mismatches) entre heterodúplexARN:ARN yARN:ADN pueden ser rotos por una ARNasa. Tras la rotura los fragmentos se analizan por electroforesis con desNatluralización en gel255. Pero este método sólo detecta un 50% de las mutaciones215.

-Método de la rotura química. CCM (chemical cleavage method)

Los nucleótidos desemparejados en los heterodúplex ADN:ADN o ADN:ARN son modificados por agentes químicos (hidroxilamina y tetróxido de osmio son peligrosos y se han sustituido por carbodiimida) que no afectan a los nucleótidos emparejados. Luego los heterodúplex son expuestos a piperidina que los rompe en los sitios donde hay modificación química256. La localización de la mutación puede deducirse del tamaño de los fragmentos obtenidos. Esta técnica puede detectar mutaciones en fragmentos de ADN de hasta 1499 bp de longitud, con un 90 a 95% de eficiencia215.

-Método de la rotura enzimática. EMC (enzyme mismatch cleavage)

Se produce los heterodúplex ADN:ADN por calor y reacoplamiento y se exponen a una endonucleasa tras lo cual los fragmentos se analizan por electroforesis en gel. Se ha utilizado las nucleasas de la haba mung y S1, pero este método es muy dependiente de la secuencia y no detecta muchas mutaciones215.

-EMC con resolvasas de bacteriófagos

Es un método sensible para la detección de mutaciones en heterodúlplexs de ADN ramificadas. Dos de estas enzimas, la T4 endonucleasa VII (T4E7) y la T7 endonucleasa I, (T7E1) rompen en ADN cerca de los sitios de discordancia de las bases. Los productos de la rotura pueden ser analizados mediante electroforesis en gel y permite analizar fragmentos de al menos 1500 bp. el método permite detectar un 95% de las mutaciones y parece ser más sensible que SSCP en el cribado de algunos genes, como BRCA1215.

-CFLP (cleavage fragment lenght polymorphism) Polimorfismo de longitud de fragmentos de rotura

Tras desNatluralizar los fragmentos de ADN de cadena simple éstos se doblan sobre sí mismos formando unas estructuras tridimensionales secundarias que dependen de su secuencia y que contienen numerosos pliegues y horquillas. La endonucleasa "cleavage" I rompe el ADN en los puntos en los que comienzan esas horquillas, en el punto 5 de la unión entre el ADN de cadena simple y el de doble cadena. Por lo tanto, este enzima produce fragmentos que serán distintos en el segmento de ADN normal de control y en el ADN problema de existir en éste un cambio en la secuencia (inserciones, deleciones o mutaciones puntuales215.

-Detección de mutaciones por proteínas que se unen a los errores de acoplamiento (mismatch binding protein)

Se generan heterodúplex por calor y posterior reacoplamiento entre cadenas de ADN control normal y ADN mutado. Después se incuban con proteína MutS (que forma parte del sistema de reparación de ADN de la E. coli). Esta proteína queda unida a los puntos donde no hay acoplamiento entre los nucleótidos enfrentados. Después somete esa mezcla a la acción de exonucleasas, como la MutS protege al ADN al que está unida de la rotura por exonucleasas, el número y tamaño de los fragmentos obtenidos tras esta digestión será diferente de no haber mutación (en cuyo caso tendríamos homodúplex a los que no se habría unido proteína) que de haber mutación (en ese caso la proteína protegería algunos puntos en los que, sin ella, podría haber actuado la exonucleasa obteniéndose menos fragmentos). Una variación consiste en que la proteína se inmoviliza en membranas de nitrocelulosa; esto hace que aumente significativamente la afinidad de la proteína por el ADN no acoplado, lo que permite detectar un mayor número de mutaciones y evaluar fragmentos de mayor tamaño. Además, al detectarse las notaciones mediante unión en vez de mediante separación de fragmentos en electroforesis en gel, esta técnica podría automatizarse215.

También se ha utilizado la transfección del heterodúplex de ADN a E. coli in vivo. Es una técnica compleja que permite analizar una secuencia amplia (hasta 10 kb) de ADN215

-PTT Test de truncamiento de proteínas

El PTT (protein truncation test) sólo sirve para detectar mutaciones que implican la aparición de un codón (secuencia de 3 nucleótidos) de fin de la traducción proteica (stop codon). Se realiza una PCR para amplificación de un gen que codifica para una determiNatlla proteína utilizando iniciadores a los que se ha añadido secuencias de iniciación para células eucariotas y un promotor T7. Por lo tanto, los productos de PCR (que contienen estas secuencias) se pueden someter a reacciones de transcripción-traducción con lo que se consigue péptidos. El tamaño de los péptidos será menor en el caso de que ADN contenga una mutación que determine la aparición de un codón de fin puesto que la reacción se detendrá en este punto. El tamaño de los péptidos se determina mediante electroforesis de los mismos para proteínas (Western blot)215.

- ASO (Allele-specific oligonucleotide hibridation oNatllNchips)

El ASO (Allele-specific oligonucleotide hibridation on ADN chips) consiste en fijar sondas de oligonucleótidos de secuencia conocida a una base sólida (chip) y exponer esta base a las secuencias diana marcadas para detectar si se unen a los oligonucleótidos (son complementarios) o no. Hay que diseñar un chip especial con los oligonucleótidos específicos para la secuencia que queremos buscar y para el cribado de cada nucleátido dada una secuencia consenso requiere la exposición a cuatro sondas distintas. Si el número de posibles alelos es muy elevado, puede utilizarse dot-blotting inverso. En este caso, el panel de sondas de oligonucleótidos es inmovilizado en el filtro y se hibrida con un producto de PCR marcado. Entre las aplicaciones de esta técnica inversa se encuentran las pruebas de HLA y forensía, y el diagnóstico de la beta-talasemia y de la fibrosis quística, en las que pueden existir múltiples mutaciones257.

ASO, sobre todo mediante dot-blotting inverso258, y el PCR-SSP (sequence-specific priming)259 se realiza para el cribado inicial de posibles donantes y son considerados métodos con una relativa baja resolución en la tipificación de HLA. Gracias a estas técnicas es posible identificar un posible donante con pelos enviado por correo. Como método de alta resolución, para seleccionar el donante más adecuado, se utiliza PCR-RFLP

MÉTODOS PARA LA DETECCIÓN DE MUTACIONES CONOCIDAS (DIAGNÓSTICO DIRECTO DEL GEN).

La secuenciación de ADN no es un procedimiento definitivo para la detección de mutaciones, pero es muy laboriosa. Por ello, se ha desarrollado técnicas más eficientes, aunque no están aún totalmente automatizadas y requieren un instrumental costoso. Por otra parte, muchas de estas técnicas no ofrecen información sobre la localización o la Natluraleza de la mutación dentro de un fragmento de ADN determiNatllo. Este último inconveniente puede ser soslayado con los métodos en los que los heterodúplexs de ADN son cortados en la posición de los nuecleótidos no concordantesl 11.

ASO. Hibridación con oligonucleótidos específicos de alelo

El ASO (Allele-specific oligonucleotide hibridation) se emplea cuando la mutación que produce la enfermedad no altera los lugares de corte de ninguna enzima de restricción conocida. Se transfiere el ADN producto de LCR (o de reacción en cadena de ligasa), cortado en fragmentos y sometido a electroforesis desde un gel a una membrana de nylon donde se inmoviliza, o bien se fija el producto de PCR directamente a una membrana (dot-blot). Después se procede a hibridar estas membranas con oligonucleótidos complementarios a la secuencia Natliva a una temperatura determiNatlla. De existir una mutación en el punto que buscarnos no se producirá la hibridación260.


Aplicación en dermatología

También se ha utilizado esta técnica en el diagnóstico de hemogloblinopatías como la anemia de células falciformes261, aunque uno de los ejemplos más demostrativos es la deficiencia de alfa 1 -antitripsina, que a menudo se asocia a un solo cambio G-> A en el gen de la alfa 1 -antitripsina, produciendo el alelo Z262.

Utilizando oligonucleótidos específicos de secuencia y ADN genómico amplificado para los alelos HLA-DQA1, DQB1, y DPB1, se ha observado una frecuencia elevada de DQB1 *03 y una frecuencia disminuida de DQB1 *06 en los pacientes de alopecía areata263.

-Amplificación específica de alelos ASA (Allele-specific amplification)

Se realiza dos PCR paralelas: una de ellas utilizando como iniciador 5' una secuencia complementaria a la secuencia normal y la otra utilizando como iniciador 5' una secuencia complementaria a la secuencia mutada que queremos detectar Si existe la mutación se producirá amplificación sólo en el tubo que contiene el iniciador de la secuencia mutada mientras que el iniciador de la secuencia normal no se habrá unido al ADN de muestra y por lo tanto no habrá amplificación y viceversa215.

-Extensión del iniciador de un solo nucleótido. (Single nucleotide primer extension) Minisecuenciación

Su principio es similar al del ASA. Se basa en la extensión del extremo 3'del iniciador por un único nucleótido marcado. La adición de este nucleótido (extensión) ocurre cuando el nucleótido marcado es complementario al nucleótido adyacente al extremo 3' del iniciador en el ADN muestra. Así, si hay mutación no se une el nucleótido y no se detecta el marcaje215.

-ARMS. Sistema de mutación refractario a amplificación

Se utiliza dos cebadores idénticos en su secuencia excepto en su nucleótido 3'. Uno tiene el nucleótido 3' complementario al gen salvaje, mientras que el otro cebador 3' es complementario al gen mutado. La amplificación sólo ocurra con emparejamientos perfectos, con lo que dependiendo de qué cebador origine una señal positiva, podremos distinguir el gen salvaje del gen mutado264 , ARMS es un método especialmente sensible para la detección de mutaciones.

-OLA (oligonucleotide ligationassay) Prueba del enlace de oligonucleótidos o LCR (ligase chain reaction) Reacción en cadena de la ligasa

Se utiliza dos pares de iniciadores, complementarios a lugares donde puede haber mutaciones o polimorfismos en el ADN a estudio de modo que estos iniciadores se acoplen con el ADN de forma que queden consecutivos

(es decir que el extremo 3' del primero se continúe con el extremo 5' del segundo). Cuando no hay mutación los iniciadores se colocan consecutivos y se pueden ligar por la acción de una ligasa tras lo cual es posible amplificar el ADN con PCR, pero si hay mutación los fragmentos no se acoplan 100% al ADN muestra y no están consecutivos, por lo tanto la ligasa no puede unirlos con lo que tampoco es posible la amplificación correcta con la PCR265.

Aplicación en dermatología

Junto con la PCR, se ha utilizado para el estudio de mutaciones del gen p53 en la carcinogénesis por rayos ultravioleta, observándose que en la piel normal expuesta a esta radiación pueden identificarse mutaciones del gen p53, sobre todo en los codones 245 y 247/248266.

INESTABILIDAD DE MICROSATÉLITES

Utilizando distintas técnicas no se estudia la presencia o ausencia de mutaciones puntuales o polimorfismos génicos sino la situación de un genoma anómalo (por ejemplo de un tumor) comparándola con la situación del genoma normal. Lo que se compara entre ambos genomas son unas secuencias relativamente conservadas, que aparecen en 10,0090 o 100,000 locus en cada genoteca y que se encuentran constituidas por una repetición sistemática de entre 1 y 6 pares de bases aproximadamente unas 100 veces, estas secuencias se denominan microsatélites. Se estudia al menos 5 microsatélites distintos comparando el genoma tumoral con el normal. Si se encuentran variaciones en la migración de las bandas en electroforesis (es decir diferencias en el tamaño) entre el genoma tumoral y el normal en al menos dos microsatélites se considera que existe una inestabilidad génica en el tumor Esta situación se ha estudiado con relativa frecuencia en carcinomas de colon y también se detecta en pacientes con enfermedad granulomatosa crónica, fibrosis quística, neurofibromatosis, distrofia miotónica, síndrome de Charcot-Marie-Toth, síndrome de Kaliman o síndrome del cromosoma X frágil267.

Las ventajas del análisis de microsatélites son utilizar muy poca cantidad de ADN, tener una resolución alta, ser muy reproducible, existir un gran número de sitios bien localizados y muy informativos, ser más sencilla que la técnica de Southern, y permitir el marcaje con métodos radioactivos o no radioactivos25. Sin embargo, también tiene algunos inconvenientes, como la necesidad de realizar muchas reacciones para distinguir entre pérdidas y ganancias alélicas y examinar solamente una porción muy pequeña del genoma25.


La pérdida de heterocigosidad (LOH) o pérdida de uno de los alelos en una región en particular es habitualmente detectada por Southern blot o por análisis de microsatélites25. La LOH es útil para identificar alteraciones en regiones cromosómicas grandes y para delimitar las regiones de interés en cromosomas determiNatllos, sin embargo, no es un método válido para la identificación de nuevos genes supresores25.

Aplicación en dermatología

Aunque se ha detectado la presencia de trisomía 7 en algunos estudios de queratoacantoma y carcinoma epidermoide de piel76, en el queratoacantoma esporádico sólo se identifica inestabilidad microsatélite en el locus 17p 12 (D17S520, p53) en un 10% de los tumores estudiados y no se identifica pérdida de heterocigosidad, por lo que los eventos genéticos parecen jugar un papel secundario en la génesis del tumor119,268,269,270.

En el síndrome Muir-Torre el análisis de microsatélites de queratoacantoma, adenomas sebáceos, epiteliomas basocelulares y adenocarcinoma metastásico en la piel en estos enfermos, muestran una marcada inestabilidad microsatélite271 . Estos pacientes podrían compartir mecanismos genéticos de génesis tumoral con los pacientes con carcinoma colorrectal hereditario no asociado a poliposis273.

La pérdida de heterocigosidad en el cromosoma 9q22,3 y las alteraciones en genes supresores ubicados en esa región parece ser un evento tardío en desarrollo del carcinoma epidermoide de piel y no se identifica en la piel normal expuesta que presenta mutaciones del gen p53, ni en las displasias, mientras que aparece en el 65% de los carcinomas in situ y carcinomas epidermoides de piel273.

El análisis de microsatélites y la pérdida de heterocigosidad en más de un brazo cromosómico no sucede en el liquen plano oral, ni en las lesiones reactivas de la boca, y sí son frecuentes y gradualmente crecientes en las displasias epiteliales y en el carcinomas epidermoide274 .

La pérdida de heterocigosidad en los cromosomas 6q y 10q en el melanoma cutáneo se asocia a un peor pronóstico clínico275.

La porfiria cutánea tarda esporádica es una enfermedad cutánea que se asocia a siderosis hepática. Los alelos microsatélites que definen el haplotipo hemocromatosis ancestral (HLA-A3) se estudia en estos pacientes231.

La ictiosis congénita autosómica recesiva es un trastorno de la queratinización clínicamente heterogéneo. En los subtipos ictiosis lamelar y eritrodermia ictiosiforme congénita no ampollosa se describe mutaciones en el gen de la transglutaminasa 1. Los marcadores de microsatélite relacioNatllos con este gen permiten el estudio de familias con estas enfermedades276.

La psoriasis es una dermatitis crónica inflamatoria que afecta a un 2% de la población. Mediante linkage analysis, se ha mapeado varios genes de susceptibilidad posibles, sobre todo en las regiones cromosómicas 17q y 6p, pero también en 2p, 4q, 8q, l6qy 20p. Los estudios mediante microsatélites no han podido demostrar un vínculo significativo con esos marcadores y sí con marcadores para el cromosoma 1 cen-q21 (la molécula CD1d es codificada en esta región)277. Mediante marcadores microsatélites polimórficos se ha localizado el gen de psoriasis vulgar en un segmento de 111 kb telomérico al gen HLA-C278. La mayoría de las investigaciones se centran la región MHC clase 1, en el cromosoma 6, sobre todo en el alelo HLQ-Cw6279.


ACTIVIDAD DE TELOMERASA

La capacidad de crecimiento ilimitado de las células neoplásicas requiere la actividad de la ribonucleoproteína telomerasa280,281,282. Sin esta enzima, los extremos de los cromosomas(telómeros) se van acortando en cada división mitótica. Cuando los telómeros están agotados, la célula deja de proliferar y comienza su senescencia. Las células malignas contienen actividad de telomerasa para estabilizar sus telómeros50.

El oncogén c-myc induce telomerasa tanto células epiteliales283. La expresión de telomerasa puede ser detectada por varios métodos:

Protocolo de amplificación de repetición telomérica (TRAP)

Se emplea para determinar la actividad de telomerasa282. El resultado puede expresarse en unidades relativas respecto al control positivo (100 unidades) y el negativo (0 unidades).

RT-PCR (reacción en cadena de polimerasa-transcripción inversa)

Se utiliza para detectar el molde del ARN de telomerasa (hTR) en extractos de tejidos

Hibridación in sítu

Se aplica para localizar en hTR en cada célula, lo cual es necesario en tumores como la enfermedad de Hodgkin en la que las células de Reed-Sternberg apenas constituyen un 1 % de la masa celular total50.

Se ha comprobado, sin embargo, que las células linfoides normales pueden expresar telomerasa, por lo que los extractos de tejidos no son útiles para la determinación de la presencia de esta molécula en procesos linfoproliferativos50.
La actividad de telomerasa se detecta en 30% de úlceras cutáneas crónicas por radiación y puede ser un marcador para predecir el pronóstico y el efecto del tratamiento de estas úlceras284.
La Tabla 8 refleja un resumen de las aplicaciones prácticas de algunas de las técnicas aquí estudiadas.

TABLA9. Estrategias de diagnósico molecular1
Estrategia Técnicas(*) Ejemplos
- presencia o ausencia SB,NB,HIS,PCR Enfermedades infecciosas (diagnóstico epidemiología)
Determinación de identidad: Transplantes de tejidos.
Mutación puntual de un gen RED,SB,PCR,ASO,SSCP,SEQ Enfermedad hereditaria: geroderma pigmentoso, queratodermia almoplantar.
anomalía de una egión de un gen (diferente a una mutación puntual, como inserciones o deleciones) SB,PCR,FISH Enfermedad hereditaria: Enfermedad von Willebrand tipo II, síndrome de repetición de triconucleótidos
Monosomía o trisomía FISH Congénito: síndrome de Down
Reordenamiento de un gen SB, PCR Tumores malignos linfoides; diagnósico, enfermedad mínima residual
Traslocación de un gen SB, PCR, FISH Tumores malignos
Creación de un nuevo gen NB, PCR
leucemia aguda promielocítica, leucemia linfocítica aguda pre-B
Tumores malignos: Leucemia mieloide crónica
* ASO, Hibridación de oligonucleótidos específica de alelo; FISH, Hibridación in situ-fluorescencia; HIS, Hibridación in situ; PCR, Reacción en cadena de la polimerasa; NB Nothern blot; RED, Digestion con endonucleasas de restricción; SB, Southern blot; SEQ, Secuencia; SSCP, Polimorfismo  estructural de cadena simple

CONCLUSIONES

La existencia de técnicas moleculares más sencillas y el mejor conocimiento de los mecanismos genéticos de las enfermedades, a lo que sin duda ha contribuido la libre disponibilidad de bases de datos de bibliografía médica y de mutaciones, como OMIM285 o Human Genome Organization (HOGO) Mutation Database Initiative286 han permitido popularizar el empleo de estos nuevos métodos en el diagnostico dermatológico.

En un futuro próximo, estarán disponibles de forma rutinaria nuevas técnicas aplicables a dermatología que permitirán un mejor análisis de los productos de KR, como la cromatografía líquida de alto rendimiento, la electroforesis capilar o la PCR, la electroforesis capilar o la KR sobre chips de oligonucleótidos22. Los chips de oligonucleótidos para PCR son dispositivos fabricados mediante litografía fotográfica sobre chips de silicona, que contienen miles de oligonucleótidos diferentes unidos a la fase sólida. Las mezclas de complejos de ácidos nucleicos pueden ser analizados mediante hibridación del chip, y los pocillos positivos indican la presencia de una secuencia complementaria en la mezcla287.

También se extenderá el uso de nuevas técnicas de amplificación de ácidos nucleicos que competirán con PCR, como la amplificación de ácidos nucleicos basada en secuenciación (NASBA) o la replicación automantenida de secuencia (3SR). En ambos casos la tecnología se basa en la amplificación isotérmica de un ARN diana gracias a la actividad simultánea de transcriptasa inversa, ARN polimerasa y ARNsaH, que permite obtener ARN de cadena simple amplificado. Estas técnicas ya se han ensayado en la detección de HPV VIH-1 y citomegalovirus288.

En aquellas lesiones en la que sea importante valorar la morfología, las técnicas de hibridación in situ yPCR in situ serán el complemento lógico de la inmunohistoquímica. La hibridación in situ, con los nuevos métodos de amplificación de señal y microscopia confocal, se convertirá en una herramienta de rutina para la detección de determiNatllos ácidos nucleicos en los tejidos.

La citogenética seguirán siendo un complemento más de la morfología y de la biología molecular, no sólo a través de la hibridación in situ sino con la realización de estudios con sondas que marcan las diversas regiones del cromosoma con diferentes colores (Figura 3).

En todo caso, será necesaria una estandarización en las técnicas de biología molecular y en su interpretación, para poder utilizar ampliamente estas herramientas con resultados válidos. Estos pasos serán facilitados principalmente FIGURA3

Figura 3. Estudio de bandas de colores en el cromosomas 5.
Cedido por el Dr. JM Hernández. Universidad de Salamanca, España


por la evolución tecnológica (Figura 4), la automatización en todos los pasos289 y la informatización de los datos obtenidos, incluyendo programas de control de calidad. Un ejemplo de esta evolución lo tenemos en el analizador avanzado de ácidos nucleicos (AAAN), que consiste en un dispositivo con diez módulos de reacción y una computadora portátil. En la pantalla van apareciendo las reacciones efectuadas en cada cámara, indicando número de ciclos, tiempo y estado de la detección289.
FIGURA 4

Figura 4. Analizador avanzado de ácido nucleido

 

En los sistemas de PCR basados en fluorescencia, aún no disponemos de sistemas que permitan cuantificar cómodamente la cantidad de ADN monoclonal, por ejemplo del receptor de linfocitos T TCR-gamma, aunque se utiliza métodos semicuantitativos. El desarrollo de PCR cuantitativa o semicuantitativa permitiría monitorizar la respuesta A tratamiento de los tumores y comprobar la existencia de enfermedad residual mínima, por ejemplo en el síndrome de Sézary16.

Las investigaciones de clonalidad en los infiltrados linfocitarios de la piel pueden beneficiarse de nuevos métodos de alta resolución, como el análisis automatizado de reordenamientos del gen TCR-beta utilizando iniciadores marcados fluorescentemente. Estos métodos permiten detectar poblaciones oligoclonales en infiltrados de células T que antes eran considerados policlonales, como los pesudolinfomas cutáneos CD8 que aparecen en pacientes infectados por VIH207.

No hay duda que la clonalidad estudiada mediante PCR puede ayudar a los dermatólogos en el diagnóstico de malignidad linfoide cutánea temprana, sobre todo linfomas T cutáneos, siempre y cuando los resultados se analicen teniendo en mente todas las limitaciones que estos métodos poseen.

En muchas enfermedades en las que existe un mayor riesgo relativo en familiares, como la dermatitis de contacto alérgica al níquel, cuya base genética se desconoce, aunque se sabe que el gen TAP2B (transportador asociado con el procesamiento antigénico) se asocia con un mayor riesgo de alergia al niquel290 será necesario conocer mejor estos mecanismos genéticos antes de poder identificar det alladamente el o los genes responsables291.
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Actualmente, se utiliza en la práctica clínica citoquinas recombinantes, como el interferón y las interleuquinas, u hormonas recombinantes como la insulina y la hormona de crecimiento humana, para tratar pacientes con enfermedades neoplásicas, virales, inflamatorias y genéticas. Se está investigando métodos seguros para transferir los genes terapéuticos (como interleuquina10 en enfermedades por hipersensibilidad) más eficazmente a los queratinocitos y mantener la expresión de ese gen durante mucho tiempo, y de esta forma tratar no sólo enfermedades dermatológicas sino sistémicas, como la hemofilia B, que podría ser curada introduciendo el gen del factor IX humano en quratinocitos292.

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