** Instituto de Microbiología. UNMSM. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Fax (511) 328-4741.
RESUMEN Las hojas de Lupinus ballianus C.P., Smith, procedente de las zonas altas del Departamento de Lima, contiene entre otros metabolitos, 5 flavonoides y 5 alcaloides. El flavonoide genisteina fue determinado utilizando la espectroscopia UV-Visible, observando desplazamientos batocrómicos o hipsocrómicos de los espectros son los reactivos metóxido de sodio, cloruro de aluminio, ácido bórico y acetato de sodio. El espectro IR revela la presencia del alcaloide lupinina o hidroxilupanina. El flavonoide y el alcaloide tienen marcada acción antibacteriana y el último muestra además una actividad antifúngica.
ABSTRACT The leaves of Lupinus C.P. Smith were colected from the highlands in Lima, it contains among other 5 flavonoids and 5 alkaloids. The flavonoid genistein was characterized by means of visible-UV spectroscopy, observing the bathochromic and hipsochomic movements of the spectra with sodium methoxide, aluminuin chloride, boric acid and sodium acetate reagents. The IR spectrum reveals the presence of the alkaloid lupenin or hydroxylupenin. Both the flavonoid and the alkaloid show a strong antibacterial activity and the alkaloid shows in addition of this property an antifungic activity.
INTRODUCCIÓN El presente trabajo tiene por finalidad determinar los principios activos que tiene la especie Lupinus Ballianus C.R Smith comúnmente conocido con el nombre de "Jera", y determinar la actividad antimicrobiana de los principios activos, principalmente flavonoides y alcaloides. Las especies del género Lupinus pertenecen a la familia Fabaceae, que comprende mas de 12,000 especies. El hábitat predominante de estas especies son lugares templados y fríos, a medida que aumenta la altitud y la latitud disminuyen no solo el número de especies sino también el tamaño de cada una de ellas (1,2). Se conocen cerca de 300 especies del género Lupinus, que se caracterizan porque sus granos son amargos. Los Lupinus se cultivaron y utilizaron desde épocas preincas, ya sea para la alimentación o para tratar diversas afecciones (3,4,5,6). En el nuevo mundo el género Lupinus está distribuido principalmente en California y los Andes Peruanos. En el Perú se encuentran en la costa, sierra y selva principalmente en La Libertad, Cajamarca, Amazonas, Ancash, Huánuco, Puno, Cusco y Arequipa (2,7,8). Desde el punto de vista de su uso para el tratamiento de enfermedades cabe destacar que L. mutabilis tiene propiedades sobre la fertilidad; asimismo, a L. albus y L. sativus se les atribuyen propiedades afrodisiacas, vermifuga y antisoriásica, también son utilizadas en los casos de abscesos, eczemas y ulceraciones de la piel (10). Otros estudios relacionados, también son importantes en cuanto a la actividad biológica (11,12,13,14).
PARTE EXPERIMENTAL Lupinus ballianus, C. P. Smith, para los efectos de nuestro trabajo ha sido recolectada en febrero de 1997 en la localidad de Bellavista (Huarochirí) del departamento de Lima a 3800 msnm. La especie ha sido clasificada en el Museo de Historia Natural UNMSM. Para el estudio se utilizó las hojas que fueron desecadas y estabilizadas a bajas temperaturas. Fase estacionaria para eromatografia - Papel Whatman N.º 1 Sistema de solventes para cromatografía I. n-Butanol - Acido acético saturado con agua 50:7 v/v Reveladores cromatográficos a. Lámpara de Luz UV - Se utilizaron los equipos
Screening Fitoquímico El sercening fitoquímico se llevó a cabo sobre el extracto etanólico de las hojas, las que previamente fueron sometidas a maceración. El proceso se hizo siguiendo el diagrama de flujo correspondiente. Aislamiento de flavonoides La presencia de flavonoides fue detectada en el screening fitoquímico y en cromatograma de papel Whatman N.º 1, se observó 5 fracciones de flavonoides revelados con lámpara de luz UV y vapores de amoniaco. Las 5 fracciones fueron aisladas mediante cromatografía en escala preparativa utilizando papel Whatman N.º 127 x 11 cm y en forma descendente, como sistema de solventes el sistema 1. Los eluatos separados correspondientes a cada producto fueron purificados y desecados. La estructura de la fracción F4 que respondió preliminarmente al ensayo antimicrobiano, fue determinada mediante reacciones químicas, análisis cromatográfico de los productos hidrolizados y mediante espectroscopía UV-IR.
Aislamiento de alcaloides La extracción de los alcaloides, desde las hojas, se realizó macerando las hojas secas y en polvo (50 gramos) en alcohol etilico de 96º (500 ml). El solvente fue separado por evaporación a presión reducida en el evaporador rotatorio. Desde el extracto seco se obtuvo con éter los alcaloides totales. El análisis cromatográfico en cromatofolio de aluminio de silicagel GF254 y con el sistema de solventes II, dio 5 alcaloides. Los alcaloides fueron separados en eromatografía preparativa. Cada uno de los alcaloides fueron ensayados preliminarmente contra bacterias y hongos seleccionados; la fracción A2 respondió positivamente, fue alucidado estructuralmente, haciendo uso de reacciones químicas y espectroscopía IR.
Actividad antimicrobiana de flavonoides y alcaloides Método de excavación placa- cultivo Inoculación de las muestras Previamente se repicó los microorganismos de ensayo sobre el agar incubado (TSA) a 37º C. Después del periodo de incubación se prepararon las suspensiones de cultivo en agua bidestilada estéril, ajustando el inóculo hasta una concentración de microorganismos equivalente a 0,5 en la escala de Mac Farland. Para la preparación de las placas del medio TSA, previamente fue fundido y enfriado a 45'C, posteriormente se añadió 1 ml de la suspensión de inóculo por cada 100 ml de medio de cultivo, se homogenizó con movimientos de rotación. Luego de verter 25 ml sobre cada placa petri, se dejo solidificar a temperatura ambiente y se rotuló con el nombre del microorganismo testigo. Luego se hizo las excavaciones mediante el excavador de acero de 9 mm de diámetro procurando que su distribución en cada placa sea equivalente.
Determinación antimicrobiana de flavonoides y alcaloides
Determinación mínima inhibitoria Se trabajó con el extracto etanólico, con el flavonoide y el alcaloide, realizando las diluciones necesarias.
Determinación de la actividad antifúngica
RESULTADOS ANÁLISIS FITOQUÍMICO El análisis fitoquímico del extracto acuoso de las hojas se expresa en el siguiente cuadro:
Para elucidar la estructura del flavonoide F4 se empleó la cromatografía en papel y el comportamiento de la solución metanólica con metóxido de sodio, cloruro de aluminio, ácido clorhídrico, acetato de sodio, ácido bórico; determinado en el espectro UV- visible.
PICOS DE ABSORCIÓN DE LA FRACCIÓN F4 DE FLAVONOIDES CON LOS DIFERENTES REACTIVOS DE DESPLAZAMIENTO
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS FLAVONOIDES Y ALCALOIDES DE Lupinus ballianus En el siguiente cuadro se observa la medida del diámetro de los halos de inhibición.
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LAS FRACCIONES DE FLAVONOIDES Y ALCALOIDES DE Lupinus balinaus
DETERMINACIÓN DEL ÍNDICE DE LA ACTIVIDAD DE FLAVONOIDSES EN COMPARACIÓN CON ANTIMICROBIANO ESTÁNDAR
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE FLAVONOIDES DE
DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA FRENTE A
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA DE LOS FLAVONOIDES Y LOS ALCALOIDES DE Lupinus ballianus
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA DE ALCALOIDES DE Lupinus ballianus
DISCUSIÓN Loa análisis químicos que se han realizado en este estudio, han demostrado la presencia de taninos, saponinas, flavonoides y alcaloides. Los flavonoides y alcaloides se aislaron para nuestro objetivo a partir de un extracto etanólico, de las hojas de L. Ballianus. El fraccionamiento de los flavonoides se realizó por cromatografía en papel (descendente), se obtuvo 5 fracciones a las que denominamos F1, F2, F3, F4, F5. La fracción F4 fue luego analizada por espectroscopía UV- visible, por poseer esta dracción una mayor actividad antimicrobiana que las otras fracciones. En el espectro UV se observa los dos picos típicos de flavonoides denominados Banda II (276,5 nm) y Banda I (332,5 nm) en solución metanólica. Con el metóxido de sodio tanto el pico de absorción de la Banda II (283,5 nm) y Banda I (403 nm) se desplazan batocrómicamente debido a O-hidroxilos presentes en 3´y 4´. El acetato de sodio sirve para detectar los grupos hidroxilo más ácidos del flavonoide (7´ y 4´), se produce desplazamiento batocrómico de las Banda II (281,5 nm) y Banda I (365,5 nm), mientras que el AcONA/HBO es para detectar grupos O- dihidroxilo. La Banda II (274,5 nm), esto corroboraba la formación de un complejo muy estable entre el grupo carbonilo y el hidroxilo presente en C-5. Los resultados espectroscópicos y sus desplazamientos indica que se trata de una flavona o isoflavona. Sin embargo, por la fuerte fluorescencia del cromatograma frente a la luz UV y después de agregarle vapores de amoniaco, todo indicaría que se trata de Genisteína en forma libre de glicósido. Los alcaloides fueron sometidos a fraccionamiento cromatográfico, obteniéndose 5 fracciones de mayor concentración a los que denominamos A1, A2, A3, A4 y A5. La fracción A2 tiene mayor actividad antimicrobiana, fue analizada por espectroscopía IR. En el espectro IR se observa grupo OH a 3600,7 cm-1, grupo carbonilo a 1763 cm-1, por estas caracteríaticas del espectro se trataría de la estructura química de los alcaloides Lupinina o Hidroxilupanina debiendo ser necesario otros métodos espectroscópicos para diferenciar las estructuras.
En cuanto a la actividad antimicrobiana, la presencia de flavonoides y alcaloides, les confiere la actividad antibacteriana, y actividad antifúngica en el caso de los alcaloides. La mayor resolución de inhibición se debe al extracto alcohólico, al flavonoide y al alcaloide; con similar o igual poder de inhibición contra los Gram positivas (Staphilococcus aureus ATCC 6538, Microccoccus luteus ATCC 9341) y Gram negativas (Klebsiella pneumoniae), la acción antimicrobiana se debería a que los flavonoides por la presencia en su estructura de hidroxilos fenólicos, penetran fácilmente a través de la membrana celular bacteriana, se combina y precipitan las proteínas protoplasmáticas desnaturalizándolas y actuando como venenos protoplasmáticos. La acción antibacteriana y antifúngica de los alcaloides se podría deber a la presencia de nitrógeno en su estructura como amina o amida. Los resultados obtenidos de los ensayos antimicrobianos de los eluatos de flavonoides y alcaloides, muestran una resolución de inhibición menor a los extractos de flavonoides y alcaloides, estos resultados se deben probablemente que además de contener sustancias activas de propiedades químicas semejantes, existen otras sustancias como los taninos que incrementan en cierta forma esta actividad, también los resultados observados, podrían ser causados por un sinergismo de los constituyentes.
CONCLUSIONES 1. Las hojas de la especie Lupinus ballianus C.P. contiene flavonoides y alcaloides como principales metabolitos secundarios. 2. El flavonoide presente en las hojas es la gensteina y el alcaloide la lupinina o la hidroxilupinina. 3. El extracto alcohólico obtenido por reflujo, el flavonoide y el alcaloide, a la concentración de 200 mg/ml tiene actividad antimicrobiana frente a las Gram positivas (Staphylococcus aureus ATCC 5438, Bacillus cereus, Micrococus luteus ATCC 9342) y graM NEGATIVAS (Klebsiella pneumoniae). El alcaloide presenta actividad contra Aspergillus niger. 4. La actividad antimicrobiana del flavonoide a la concentración de 200 mg/ml frente al Staphiococcus aureus es 0,24 mcg/ml equivalente a 0,404 UI/ml de penicilina G sódica. 5. La cvoncentración mínima inhibitoria del extracto alcohólico obtenido por reflujo es de 40 mg/ml, para el flavonoide y para el alcaloide es de 20 mg/ml
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Soukup J. Vocabulario de los nombres vulgares de la flora peruana y catálogo de géneros 1970. Edit. Salesiano – Lima, pág. 250-251.2. Wit H.C.D. Plantas superiores 1965. Ed. Seix Barral Barcelona Tomo I. 3. Ferreyra R. Flora of Peru. UNMSM. pág. 53-59. 4. Gross G.R. y TuestA Vargas L. El contenido de alcaloides de Algunas seleciones de Lupinus. Informe N.º 4. Instituto nacional de Salud 1979. 5. Gross G.R. El cultivo y la utilización de Tarwi. Organización de las Naciones Unidas, Roma, 1982. 6. Rodríguez R. Plantas para leña en el sur occidente de Puno - Perú. Proyecto árbol andino Puno 1988. 7. Tapia M., Vargas C. Wild lupine of the Andes of peru. Agricultural and Nutrition 1980; pág. 24-28. 8. Salinas A. Estudio tecnológico para la instalación de una planta de aceite de Lupino. UNMSM 1979. 9. Plantas que curan. Edit. Tres livos e Fasciculos Brasil 1984, tomo I, pág. 56-57. 10. Finell R.H. Gay C-C. And Abbott L.C. Life Sciences 1991; 6, 27-39. 11. Hatfield G.M., Yang D.J., Ferguson P.W. Agric. Food Chem. 1985; 33(5), 909-912. 12. Smith R.A. Vet. Hum. Tox. 1987: 29(6), 444-445. 13. Tyski S., Markiewick M., Gulewicz K. Plant physiol. 1988: 133(2), 240-242. 14. Barnabs C. Fitoterapia 1988: 39(5), 393. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
