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Los organismos marinos son considerados una importante fuente de sustancias con potencial bioactivo. En este sentido, numerosas revisiones señalan a las algas como uno de los principales productores de estos compuestos (Bhakuni y Silva, 1974; Faulkner, 1984; Stein y Borden, 1984; Glombitza y Koch, 1989; Hay, 1996; González y Silva, 2001).
Los principales compuestos bioactivos producidos por las algas marinas están formados por una amplia gama de metabolitos secundarios, cada uno con una función específica dentro de su medio, atribuyéndoseles entre otras, la defensa química contra herbívoros marinos(Hay et al., 1987a; 1987b; Paul et al., 1987; Pereira et al., 1994). Estos metabolitos también están asociados a la disminución de epífitos, inhibiendo a los organismos competidores y patógenos microbianos (Hay, 1996; Vlachos et al., 1997).
El potencial antibacteriano de las algas se debe a su capacidad para sintetizar, entre otros, a los diterpenos en las algas verdes, terpenos halogenados en las algas rojas y metabolitos mixtos de origen terpeno-aromático en las algas pardas (Bhakuni y Silva, 1974; Fenical, 1975; Vlachos et al., 1997; Carvalho y Roque, 2000).
Estudios realizados en diferentes partes del mundo confirman que los exudados de algunas especies de Chlorophyta, Phaeophyta y Rhodophyta presentan actividad antimicrobiana (Caccamese et al., 1980; Rao y Parekh, 1981; Vlachos et al., 1996; 1997). Aunque el número de especies de macroalgas estudiadas únicamente alcanza alrededor de un 2% del total de las conocidas, en la actualidad los compuestos químicos caracterizados son aproximadamente dos mil, pero solamente en algunos se ha podido establecer claramente el mecanismo de acción (González y Silva, 2001).
En el Perú, las macroalgas Enteromorpha intestinalis (Chlorophyta) y Polysiphonia paniculata (Rhodophyta), han sido reportadas como especies con capacidad antibacteriana (Balta, 1988).
El objetivo del presente trabajo es determinar en 12 especies de macroalgas la presencia de sustancias antibacterianas.
Lugares de recolección
El material algal empleado en el presente estudio se recolectó durante
las horas de baja marea en la zona intermareal de seis playas de la
costa central: playa Atenas, Laguna Grande, Pucusana, San Francisco,
playa Hermosa y Los Yuyos (Tabla
1).
Recolección y procesamiento del material biológico
Se recolectaron manualmente plantas completas, incluyendo el disco de
fijación de 12 especies de macroalgas marinas representativas de las
Rhodophyta, Phaeophyta y Chlorophyta (Tabla
2).
La recolección se realizó durante el periodo comprendido entre agosto
y octubre del 2001 y en marzo del 2002. El material algal recién extraído
se transportó fresco al laboratorio, donde cada muestra se sometió a
una limpieza manual para eliminar arena, epífitos y fauna acompañante;
se lavó con agua corriente y enjuagó con agua destilada. Luego, las
algas se secaron durante 24 horas bajo luz artificial a 24 °C y
finalmente durante 24 horas en una estufa a 40 °C.
Cepas bacterianas de referencia
En el presente estudio se trabajó con 11 cepas bacterianas (Tabla
3),
cinco cepas de origen clínico proporcionadas por el Laboratorio de
Microbiología Molecular de la Facultad de Ciencias Biológicas de la
Universidad Nacional Mayor de San Marcos y 6 cepas no clínicas
proporcionadas por el Laboratorio de Microbiología del Instituto del
Mar del Perú.
Extracción etanólica de sustancias bioactivas de macroalgas marinas
Las algas secas fueron premolidas en un molinillo eléctrico, luego
endurecidas con nitrógeno líquido y molidas en un mortero hasta
obtener un polvo fino. Cada muestra se almacenó a -25 °C hasta el
momento de su empleo.
El proceso inicial de extracción (protocolo I) se realizó siguiendo la
metodología propuesta por Vlachos et al. (1996). Se mezclaron 10 g de
polvo de alga y 20 ml de etanol al 80%, luego se calentó a 80 °C en
una manta eléctrica durante 4 horas, luego se filtró en papel Whatman
# 1 y el volumen de extracto recuperado se enrasó a 5 ml adicionando
etanol al 80%.
Adicionalmente, para obtener un mayor volumen final del extracto, se
ensayaron 3 variantes del protocolo inicial. Las variantes realizadas
consistieron en modificar la cantidad y los tiempos de adición del
etanol. En el primero, se adicionó 10 ml de etanol al 80% dos horas
después de iniciado el proceso (protocolo II); en el segundo, se agregó
5 ml de etanol cada hora (protocolo III), y finalmente, en el tercero se
adicionó 5 ml una hora antes de culminar el proceso (protocolo
IV).
Para evaluar la efectividad de los protocolos se realizó un ensayo
experimental a fin de estandarizar un único protocolo de extracción.
El ensayo se llevó a cabo con el extracto del alga roja G. doryphora
contra la cepa S. aureus ATCC 6633, con tres réplicas por cada
protocolo.
Determinación de la actividad antibacteriana de los extractos algales
La actividad antibacteriana de los extractos etanólicos se evaluó
empleando la técnica de difusión en agar. La siembra de las cepas
bacterianas se realizó mediante el método de doble capa. Se adicionó
10 ml de medio TSA (agar tripticase de soya) en placas petri, luego de
solidificado el medio se agregó una segunda capa de agar que consistía
de 5 ml de agar TSA licuado (5 ml), previamente inoculado con la cepa
patrón (0,1 ml de caldo TSB de 24 horas). Esta segunda capa se
suplementó con 1% (p/v) de NaCl para las especies de Aeromonas y Vibrio.
Posteriormente, con un sacabocado estéril se hicieron pocillos de 6 mm
de diámetro sobre el agar. En cada pocillo se adicionaron 50 µl del
extracto algal. Además, se utilizó un pocillo con etanol 80% como
control en cada ensayo. Las placas se dejaron por 30 minutos a
temperatura ambiente para permitir la difusión del extracto.
Finalmente, las placas se incubaron a 30 °C (especies de Vibrio) y a 37
°C (las otras cepas) por 24 horas.
Las pruebas se realizaron por triplicado para cada cepa y extracto
ensayado. La presencia de un halo de inhibición definido alrededor del
pocillo con extracto indicó actividad antibacteriana positiva.
La lectura de las placas se realizó después de 24 horas. Se midieron
tres diámetros de cada halo de inhibición empleando un vernier. Los
valores obtenidos se promediaron hallándose el diámetro promedio que
fue utilizado como índice de actividad antibacteriana.
Análisis estadístico de los datos
El análisis de varianza (ANOVA) se realizó para los dos protocolos que
evidenciaron actividad antibacteriana. Se aplicó ANOVA unifactorial a
los diámetros totales y la significancia se reportó con un nivel de
confianza del 95%.
Extracción de sustancias bioactivas de macroalgas
El resultado de cada uno de los extractos etanólicos obtenidos con los cuatro protocolos ensayados se resumen en la
Tabla 4. Considerando estos resultados, se evaluaron los protocolos I y IV. El diámetro promedio de los halos de inhibición obtenidos con el extracto etanólico de G. doryphora frente a la cepa patrón S. aureus ATCC 6633 en ambos protocolos fue de 7,9 mm
(Tabla 5).
El análisis de varianza (ANOVA) determinó que no existen diferencias significativas entre los diámetros promedio de ambos protocolos. Sin embargo, debido a que el protocolo IV permitía recuperar un mayor volumen final de extracto se optó por emplearlo en todas las pruebas posteriores.
Determinación de actividad antibacteriana en los extractos algales
Del total de los extractos de macroalgas ensayadas, solamente 5 (42%) dieron actividad antibacteriana positiva contra las especies grampositivas
(Tabla 6). Las bacterias que reportaron sensibilidad fueron las cepas clínicas S. aureus ATCC 25923 y E. faecalis ATCC 29212 y la cepa no clínica S. aureus ATCC 6633.
En lo referente a la distribución de la actividad antibacteriana, se encontró que la producción de sustancias bioactivas era cubierta por los tres grupos de macroalgas. En las Rhodophyta, fueron G. doryphora, P. decipiens (Cryptonemiales) y A. durvellaei (Gigartinales) las especies con efecto antibacteriano. En las Phaeophyta, se registró actividad en el alga P. fascia (Scytosiphonales); y en las Chlorophyta, en la especie B. plumosa (Briopsidales).
La cepa clínica S. aureus ATCC 25923 fue inhibida por el extracto etanólico de P. fascia(Phaeophyta) y B. plumosa (Chlorophyta) con halos de 13,3 mm y 17,1 mm, respectivamente. Los extractos de G. doryphora y P. fascia también inhibieron el crecimiento de E. faecalis ATCC 29212 con halos de 15,7 mm y 11,7 mm respectivamente
(Fig. 1).
En el caso de la cepa no clínica S. aureus ATCC 6633, las especies P. fascia (Phaeophyta) y B. plumosa (Chlorophyta) presentaron los mayores halos de inhibición, con 13,8 mm y 13,9 mm de diámetro promedio, respectivamente. Entre las Rhodophyta se encontraron tres especies con potencial antibacteriano contra esta cepa, G. doryphora, A. durvillaei y P. decipiens, con halos de inhibición de 8,2 mm, 12,5 mm y 12,1 mm, respectivamente
(Fig. 2).
Los trabajos dirigidos a evaluar el potencial antibacteriano de
extractos algales, mencionan que el proceso de extracción en caliente
con etanol ofrece mayores ventajas en la obtención de sustancias
bioactivas (Rao y Parekh, 1981; Vlachos et al., 1996; 1997; González et
al., 2001). Así también, la adición del extracto en pocillos
realizados en el agar es un método, que a diferencia del uso de discos
de papel, concentra una mayor cantidad de extracto, facilitando la
evaluación de su potencial antibacteriano (Vlachos et al., 1996; 1997).
Los resultados del presente trabajo permiten afirmar que G. doryphora,
A. durvillaei, P. decipiens (Rhodophyta), P. fascia (Phaeophyta) y B.
plumosa (Chlorophyta) son productoras de sustancias bioactivas con
efecto antibacteriano. Estas especies se sumarían a las ya reportadas
previamente para el Perú por Balta (1988), Enteromorpha intestinales y
Polysiphonia paniculata, como algas promisorias por su potencial
bioactivo.
La mayoría de las investigaciones realizadas con extractos crudos de
algas marinas (Rao y Parekh, 1981; Caccamese et al., 1985; Vlachos et
al., 1996; 1997; González et al., 2001) mencionan gran actividad contra
bacterias grampositivas. Entre ellas, S. aureus es considerada como una
de las especies más susceptibles a los exudados y extractos algales (Hornsey
y Hide, 1974; 1976a; 1976b; Rao y Parekh, 1981; Balta, 1988; Vlachos et
al., 1996; 1997; 2001). Esto concuerda con nuestros resultados, los
cuales evidenciaron inhibición de las cepas clínicas S. aureus ATCC
25923 y E. faecalis ATCC 29212 y de la cepa no clínica S. aureus ATCC
6633.
Trabajos realizados en diversas partes del mundo con especies algales
afines y empleando diversos protocolos de extracción han obtenido
variados resultados. Así, los extractos de Grateloupia proteus (Caccamese
et al., 1980) y G. filicina (Vlachos et al., 1997) demostraron no tener
actividad antibacteriana contra las bacterias grampositivas y
gramnegativas ensayadas. A diferencia de lo registrado en nuestro
trabajo, González et al. (2001) y Vlachos et al. (1997), encontraron
respectivamente que G. doryphora y Prionitis nodifera no presentan
actividad antibacteriana.
De acuerdo a nuestros resultados, el alga parda P. fascia es la especie
con mayor espectro de actividad antibacteriana entre los tres grupos de
macroalgas ensayados. Esto difiere de lo manifestado por Caccamese et
al. (1985), quienes para esta misma especie no encontraron actividad
cuando enfrentaron su extracto a B. subtilis y Escherichia coli.
En nuestro trabajo, el alga verde B. plumosa demostró tener capacidad
inhibitoria frente a ambas cepas de S. aureus. Esto concuerda con los
resultados de Hornsey y Hide (1974), quienes reportaron que B. plumosa
tiene un gran espectro de actividad antibacteriana; pero en su caso además
registraron actividad contra bacterias gramnegativas.
Estudios realizados al sur de África e Italia, consideran a las algas
pardas y rojas como los grupos con mayor número de especies con
potencial antibacteriano (Caccamese et al., 1985; Vlachos et al., 1997).
Esto coincide con la distribución de la capacidad antibacteriana
registrada para las especies de macroalgas estudiadas. Aunque, en
nuestro caso, fue B. plumosa (Chlorophyta) la especie que presentó los
mayores halos de inhibición.
Los resultados del presente trabajo confirman la existencia de
macroalgas productoras de sustancias bioactivas con efecto
antibacteriano. Por esta razón, es necesaria la realización de
estudios orientados a registrar las especies algales peruanas
productoras de sustancias bioactivas, así como caracterizar e
identificar químicamente estas sustancias.
A los miembros del grupo DePSEA de la Facultad de Ciencias Biológicas - UNMSM por toda la colaboración brindada. A los profesores: Martha Valdivia C., Débora Alvarado I., Juan Tarazona B. y José Pino G. por su apoyo en el desarrollo del trabajo. Al Profesor Marco Guerrero A. de la Facultad de Química e Ing. Química por toda la ayuda prestada. A la Srta. Patricia Carbajal E. por el apoyo brindado durante la colecta del material biológico y en la revisión de este manuscrito. Esta investigación contó con el apoyo económico del CSI (Proyecto 021001131) y del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología.
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1 Laboratorio de Ficología Marina, Facultad de Ciencias Biológicas, UNMSM. Apartado 14-002, Lima - Perú.
2 Laboratorio de Microbiología, Instituto del Mar del Perú.
Email Claudio Magallanes: claudiomaga@hotmail.com
Tabla de contenido
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