ACCIÓN DE LA
TOXINA HL3 SOBRE MÚSCULO ESQUELÉTICO
Enrique Escobar, Carlos Rivera y Luz
Tincopa *
. RESUMEN
. INTRODUCCIÓN
. MATERIAL Y MÉTODOS
. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
RESUMEN
HI3 es una toxina que, en un trabajo anterior, fue aislada por nuestro grupo de
investigación a partir del veneno del escorpión Hadruroides lunatus mediante
cromatografía de intercambio iónico en CM-Sephadex C-25 a pH 7, y que se caracteriza por
producir contracción y parálisis en la extremidad inoculada de ratones albinos. En este
trabajo se ha determinado que la inoculación de Hl3 (26 mg) en el músculo gastrocnemius
produce la liberación, en el plasma, de creatina kinasa (CK) y lactato deshidrogenasa
(LDH). La actividad de CK se incrementa desde 210 UI/L hasta 8015 UI/L luego de 60
minutos, mientras que la actividad de LDH aumenta desde 174 UI/L hasta 1697 UI/L luego de
90 minutos.
Por PAGE-SDS, se ha demostrado que la incubación de Hl3 (26 mg) con el músculo
gastrocnemius aislado de ratones albinos, en medio fisiológico a pH 7, provoca también
la liberación de otras proteínas musculares. Además, Hl3 es capaz de incrementar mas de
3,5 veces los niveles normales de calcio intramuscular, luego de 45 minutos de acción.
Nuestros resultados sugieren que Hl3 actúa específicamente a nivel muscular, afectando
la permeabilidad del sarcolema y provocando la fuga de proteínas musculares. Además el
incremento de los niveles de calcio podría generar hipercontracción y la destrucción de
fibras musculares.
Palabras clave: Hadruroides lunatus, veneno de escorpión, Hl3, músculo, calcio.
SUMMARY
Hl3 is a toxin isolated by our investigation group from Hadruroides lunatus scorpion venom
by ion-exchange chromatography on CM-Sephadex C-25 to pH 7, and which produce contraction
and paralysis in the inoculated limb of white mice. In this work we have determined that
inoculation of Hl3 (26 mg) in gastrocnemius muscle from mice produces the release in
plasma of creatine kinase and lactate deshidrogenase. The creatine kinase activity
increases from 210 UI/L to 8015 UI/L in 60 minutes, whrereas the LDH activity increases
from 174 UI/L to 1697 UI/L in 90 minutes.
By PAGE-SDS it, was demonstrated that incubation of Hl3 with gastrocnemius muscle isolated
from white mice, in physiological solution to pH 7, produces the release of other
different muscular proteins as well. In addition Hl3 can increase the calcium
intramuscular 3,5 fold, after 45 minutes of action.
Our results suggest that Hl3 has specific action on the muscle, affecting the sarcolema
permeability and producing the release of muscle proteins. In addition the increase of
calcium could produce hipercontraction and destruction of muscular fibers.
Key words. Hadruroides lunatus, scorpion venom, Hl3, muscle, calcium.
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Todos los escorpiones son
arácnidos que producen un veneno constituido principalmente por toxinas que paralizan a
insectos y pequeños crustáceos; sin embargo algunas toxinas de estos venenos también
afectan a mamíferos, por lo que el veneno de algunas especies de escorpiones puede ser
incluso letal para el hombre. En general, estas toxinas afectan canales iónicos de Na+,
K+ Ca++ y Cl_(Borges et al., 1990; Ramírez-Domínguez et al., 2002).
Los primeros reportes sobre venenos de escorpiones de nuestro país datan de hace mas de
30 años y en ellos se describieron algunos efectos tóxicos y farmacológicos de ciertos
venenos, sin que las proteínas responsables de la toxicidad fueran aisladas ni
identificadas (Aguilar, 1968; Cáceres et al., 1972; Arboleda et al., 1973; Calderón y
Aguilar, 1988; Zavaleta, 1983). Sin embargo, pese a que incluso nuevas especies de
escorpiones han sido descubiertas para nuestro país (Acosta y Ochoa, 2000; Acosta y
Ochoa, 2001; Ochoa y Acosta, 2002), el único estudio sobre la separación de proteínas
de algún veneno de nuestra fauna escorpiónica es recién del año 2002, habiéndose
descrito en el veneno de H. lunatus, la identificación y purificación parcial de tres
toxinas, una de ellas con acción específica en ratones albinos (Escobar et al., 2002).
Esta toxina, capaz de producir contracción y parálisis reversible de la extremidad
inoculada de los roedores y que fue denominada Hl3, resultó ser la proteína responsable
del mismo efecto que ya en 1972 se había descrito por primera vez para el veneno crudo de
H. lunatus (Cáceres et al., 1972).
Como parte del interés en conocer la acción de esta toxina, en este trabajo se ha
estudiado el efecto de Hl3 en músculo gastrocnemius de ratones albinos y se ha encontrado
que la toxina provoca la fuga de diversas proteínas musculares y que además incrementa
los niveles de calcio intramuscular, el cual, como se sabe, es un segundo mensajero
involucrado en procesos de destrucción celular (Trump et al., 1981).
1) Toxina HI3.
La toxina Hl3 fue aislada del veneno de Hadruroides lunatus de acuerdo al método de
Escobar et al. (2002).
2) Cuantificación de proteína.
En todos los ensayos el contenido proteico se determinó por el método de Lowry et al.
(1951), usando albúmina bovina como proteína estándar.
3) Liberación de creatina kinasa (CK).
Tres grupos de cuatro ratones albinos cada uno y 20 g de peso por animal, fueron
inoculados en el músculo gastrocnemius con 100 mL de buffer acetato de amonio 0,05 M pH
7, 100 mL de veneno crudo (100 mg) o 100 mL de Hl3 (26,8 mg), respectivamente. Después de
1 hora, los ratones fueron anestesiados con éter e inmediatamente se colectó 0,4 mL de
sangre del corazón, y se mezcló con 40 mL de citrato de sodio 3,8%, luego de lo cual se
centrifugó durante 10 minutos a 300 × g para separar el plasma.
Para medir la actividad de CK, se aplicaron 25 mL de plasma a 1 mL del kit de creatina
kinasa de Pointe Scientific, registrándose el incremento en la absorbancia a 340 nm
durante 4 minutos. La actividad fue expresada en UI/L, que es la cantidad de enzima que
cataliza la transformación de 1 mmol de substrato por minuto.
4) Liberación de lactato deshidrogenasa (LDH).
Tres grupos de cuatro ratones albinos cada uno y 20 g de peso por animal, fueron
inoculados en el músculo gastrocnemius con 100 mL de buffer acetato de amonio 0,05 M pH
7, 100 mL de veneno crudo (300 mg) ó 100 mL de Hl3 (26,8 mg), respectivamente. Después
de 90 minutos, los ratones fueron anestesiados con éter e inmediatamente se colectó 0,4
mL de sangre del corazón, y se mezcló con 40 mL de citrato de sodio 3,8%, luego de lo
cual se centrifugó durante 10 minutos a 300 × g para separar el plasma.
Para medir la actividad de LDH, se aplicaron 25 mL de plasma a 1 mL del kit de lactato
deshidrogenasa de Pointe Scientific, y se registró el incremento en la absorbancia a 340
nm durante 3 minutos. La actividad fue expresada en UI/L que es la cantidad de enzima que
cataliza la transformación de 1 mmol de substrato por minuto.
5) Liberación de otras proteínas musculares.
La acción de Hl3 en el tejido muscular también fue evaluada in vitro, para lo cual se
aisló el músculo gastrocnemius y se incubó con 50 mg de Hl3 en 1 mL de buffer
fisiológico, bajo aireación constante. A diferentes tiempos (0, 30 y 60 min), se tomaron
alícuotas de 20 mL de la solución, para su análisis por PAGE-SDS (Laemmli, 1970) a fin
de evaluar la liberación de proteínas musculares (Pantigoso et al., 2002). En el
experimento control se procedió de la misma manera, excepto que no se utilizó Hl3. El
buffer fisiológico empleado contenía NaCl 6,92 g/L, KCl 0,35 g/L, MgSO4 0,29 g/L, CaCl2
0,28 g/L, KH2PO4 0,16 g/L, NaHCO3 2,1 g/L y glucosa 2 g/L a pH 7,2.
6) Variación en los niveles de calcio intramuscular.
Se trabajó con tres grupos de cuatro ratones albinos cada uno y 20 g de peso por animal.
A los animales del primer y segundo grupo se les inyectó en el músculo gastrocnemius 100
ml de Hl3 (26,8 mg), y luego de 45 y 90 minutos se sacrificaron los ratones de cada grupo,
respectivamente. Se separó 100 mg de músculo gastrocnemius y se colocó en 3 ml de
buffer Imidazol 10 mM, pH 7,1, conteniendo NaCl 140 mM, KCl 5 mM, digitonina 200 mg/ml y
Antipirilazo III 0,2 mM. Inmediatamente después de 8 minutos, el músculo se retiró y se
leyó la diferencia en la absorbancia a 710 y 790 nm (Murphy et al., 1980). Estos valores
fueron convertidos a nmoles de calcio, dividiéndolos entre un factor de calibración
correspondiente a 0,0031 nmoles-1. Con los ratones del tercer grupo se procedió de manera
similar, pero fueron inyectados con buffer acetato de amonio 0,05 M pH 7 y usados como
control.
1) Liberación de
creatina kinasa (CK), lactato deshidrogenasa (LDH) y otras proteínas musculares.
La medida de los niveles de CK en el plasma de los ratones tratados
durante 1 hora con el veneno crudo o con Hl3 mostró que esta actividad alcanza valores
promedio de 2126 UI/L en los ratones tratados con veneno crudo y 8015 en los ratones
tratados con Hl3. La actividad de CK en el plasma de los ratones usados como control fue
210 UI/L (Fig. 1). Por
otro lado los niveles de LDH en los ratones tratados durante 90 minutos con veneno crudo o
Hl3 fueron, 339 UI/L y 1697, respectivamente. Los valores normales de
LDH en ratones no tratados estuvieron alrededor de 174 (Fig. 2).
Asimismo, la evaluación por PAGE-SDS, del daño in vitro producido por Hl3 sobre el
músculo gastrocnemius aislado demostró que Hl3 es capaz de provocar la liberación de
diferentes proteínas musculares al medio de incubación. Este efecto
es rápido, ya que se hace evidente desde los 30 minutos. En la Figura 3 se pueden ver
estos resultados, y cabe señalar que si bien en los controles también se observan
algunas proteínas musculares liberadas, producto del daño natural que ocurre como
consecuencia del aislamiento, siempre en el músculo incubado con Hl3 la cantidad de
proteínas liberadas es mayor.
Estos resultados demuestran claramente que Hl3 es capaz de alterar la permeabilidad del
sarcolema produciendo como muchas otras miotoxinas la liberación no sólo de las enzimas
CK y LDH, sino además de muchas otras proteínas musculares. Sin embargo, no sabemos si
este efecto de Hl3 es a través de una acción directa en el sarcolema o indirectamente a
través de algunos intermediarios que generan el daño en el sarcolema y la fuga de estas
proteínas musculares. Del veneno de Tityus serrulatus se ha aislado una neurotoxina (Ts1)
letal para roedores que también provoca la fuga de CK y varias proteínas musculares. Sin
embargo, ya que la acción primaria de Ts1 es bloquear canales de sodio, se cree que la
liberación de proteínas musculares que produce ocurre a través de ciertos mediadores
químicos (Correa et al., 1997).
2) Variación en los niveles de calcio.
Al evaluar los niveles de calcio intramuscular en los ratones inyectados con Hl3, se
encontró un valor promedio de 47 nmoles de calcio, 45 minutos después de la inyección,
y un valor de 53,8 nmoles a los 90 minutos, lo cual respecto del valor
encontrado en los controles (13,2 nmoles), representa un incremento de hasta 4 veces (figura 4). Debemos
señalar que en estos ensayos es importante el tiempo que se mantiene el músculo aislado
en el buffer imidazol que contiene digitonina y antipirilazo III, pues durante ese tiempo
se produce la desorganización del sarcolema por la acción detergente de la digitonina, y
de este modo el calcio liberado, que puede ser detectado por el antipirilazo III, es
esencialmente del citosol de la fibras musculares. Si se incuba demasiado tiempo, la
acción detergente de la digitonina podría extenderse incluso a las membranas del
retículo sarcoplasmático y de este modo no se observarían diferencias entre el calcio
liberado de los músculos tratados con toxina y los controles.
El aumento de calcio producido por Hl3 es particularmente interesante, debido a que
podría estar relacionado con la hipercontracción que se observa en la extremidad del
ratón después de haber sido inoculado con la toxina; asimismo el incremento de calcio
podría activar a proteasas dependientes de Ca++ (Duncan, 1978) y fosfolipasas (Trump et
al., 1981). Sin embargo, el mecanismo exacto de cómo se genera y mantiene elevado los
niveles de este ion es un aspecto que aún desconocemos. Por otro lado se sabe que el
calcio actúa como un segundo mensajero disparando diferentes cascadas, algunas de ellas
relacionadas con procesos de destrucción y muerte celular, por lo que es posible que
también Hl3 genere cierto grado de necrosis muscular.
Bibliografía
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* Laboratorio de
Bioquímica y Genética Molecular. Facultad de Ciencias Biológicas. UNMSM. Apdo. 11-0058,
Lima 11, Perú.
Enrique Escobar: eescobarg@unmsm.edu.pe
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