EFECTO BIOINSECTICIDA
DEL EXTRACT ETANÓLICO DE LAS SEMILLAS DE ANNONA CHERIMOLIA MILLER
"CHIRIMOYA" Y A. MURICATA LINNEAUS "GUANABANA" SOBRE LARVAS DEL
IV ESTADIO DE ANOPHLES sp.
Bobadilla Álvarez, Miguel
(1); Gina Zavaleta Espejo (1); Fanny Gil Franco (1); Luis Pollack Velásquez (1); Manuel
Sisniegas Gonzales (2)
Resumen
En vista del incremento de la resistencia a los insecticidas químicos frente al control
de mosquitos vectores de enfermedades metaxénicas, es que se viene realizando la
búsqueda de métodos alternativos, utilizando extractos de plantas con actividad
larvicida debido a su capacidad de biodegradación generando menor daño ambiental. Bajo
esta premisa, el objetivo del presente trabajo fue evaluar la mortalidad de larvas del IV
estadio de Anopheles sp. mediante el extracto etanólico de las semillas de A. cherimolia
(E1) y A. muricata (E2). Los mayores porcentajes de mortalidad, corregidos por la fórmula
de Abbott, fueron de 100% a las 24 horas de exposición a la concentración de 0,8 y 0,12
ml/100 mL en E1 y E2, respectivamente, observándose un mayor efecto tóxico larvario a
favor de E2 sobre E1 en 4,58% de mortalidad. El análisis probit mostró un patrón de
respuesta heterogéneo de las larvas a las concentraciones letales al 50% (CL50) y al 90%
(CL90) a lo largo de todos los tiempos de evaluación y una mayor homogeneidad a los
tiempos letales al 50% (TL50) y al 90% (TL90) a medida que aumentaban las concentraciones
de los extractos. Asimismo, la forma de las rectas de regresión muestran individuos
larvarios con diferentes susceptibilidades a los extractos, lo que establece diferentes
poblaciones o genotipos intervinientes. El trabajo permitió demostrar el efecto larvicida
de ambas semillas y subraya la necesidad de realizar mayores ensayos in vitro como
alternativa al control de insectos de importancia en salud pública.
Palabras clave: Bioinsecticida, semillas,
mortalidad larvaria, Anopheles, Annona.
Abstract
In view of the increase of the resistance produced by chemical pesticides used against
mosquitoes as vectors of public health diseases, searching for alternative methods has
begun by using plant extracts with larvicidal activity which are environmentally safe and
biologically degradable. Under this premise, the aim of the present study was to evaluate
the mortality on fourth stage larvae of Anopheles sp. by using ethanolic extract of A.
cherimolia (E1) and A. muricata (E2) seeds. The bigger mortality percentages corrected by
Abbott's formula were 100% on the twelveth hour at 8,0 and 12,0 mL/100 mL concentrations
in E1 and E2. Morover E2 reached more larval toxic effect than E1 in about 4,58% of
mortality. The probit analysis showed an heterogeneous response of the larval individuals
towards 50% (LC50) and 90% (LC90) lethal concentrations throughout the evaluation period,
and an homogeneity response towards 50% (LT50) and 90% (LT90) lethal times when the
concentrations of the extracts were increased. Likewise, the slopes of the
log-dosage/probit lines showed larval individuals with different susceptibilities
demonstrating the presence of different populations and gene compositions. The work
allowed us to evaluate the efficiency of both extracts and to understand the necessity of
more assays to ensure the best larvicidal control in such mosquitoes.
Key words: Biopesticide, seeds, larval mortality,
Anopheles, Annona.
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Introducción
La malaria continúa siendo un importante problema de salud pública en numerosos
países de la región centro y sur de América donde es considerada una enfermedad
endémica de elevada prevalencia (Blanco et al., 2000), cuya distribución de casos en
Latinoamérica hasta el año 1999, sitúa al Brasil como el país con el mayor número
absoluto de casos de la enfermedad en un 50,5% seguido por los países de la región
subandina con 32,3% (OPS, 2001). En la actualidad, las estrategias mundiales para prevenir
y controlar la expansión de la enfermedad se fundamentan en la utilización de
insecticidas químicos en el control del vector Anopheles, pero el inconveniente en su uso
indiscriminado es el desarrollo de mecanismos de resistencia (INS/MINSA, 2000). En efecto,
según la Organización Mundial de la Salud (1992) en América se ha demostrado la
resistencia de especies vectores tales como A. albimanus, A. pseudopunctipennis, A.
darlingi y A. vestitipennis hacia carbamatos, piretroides y organofosforados; este último
grupo responsable de la resistencia en más de veinte especies de mosquitos a nivel
mundial (Wirth, 2000) y es utilizado hoy en día en el Perú bajo el nombre comercial de
abate (Temephos) en los programas de control larvario (Moquillaza, 1998), constituyendo un
elemento de riesgo en salud pública debido a su toxicidad en humanos y persistencia en el
ambiente (Gomero et al., 2000).
En muchos países, el empleo de controladores biológicos ha cobrado gran relevancia y se
los considera con frecuencia alternativas ideales a los insecticidas (De Barjac, 1987). Se
sabe por ejemplo de la capacidad infectiva del hongo Beauveria bassiana, del nematodo
Romanomermis culicivorax (Frederickson, 1993), de la bacteria Bacillus thuringiensis var.
Israelensis H-14 (Ventosilla et al., 2000) y de la capacidad predatora del crustáceo
Chlamydoteca sp.(Torres et al., 2002), entre otros, sobre larvas de anofelinos. Asimismo,
los productos naturales de origen vegetal están siendo investigados en cuanto a su
actividad como repelentes en mosquitos adultos (Novak, 2000), y como intoxicantes e
inhibidores del crecimiento frente a larvas, entre los que se encuentran el extracto de
hojas de Ipomoea carneafistolasa eficaz en larvas y pupas de Anopheles gambiae (OPS,
1999), además de la actividad de Azadirachta indica (Alva y Boyer, 2000) y Lonchocarpus
utilis (Mariños et al., 2000).
En este contexto, las especies del género Annona, además de controlar a insectos de
importancia agrícola, también son efectivas sobre insectos de importancia médica tales
como los mosquitos del género Anopheles (Rodríguez, 2000), Pediculus humanus, Pulex
irritans, Cimex lectularius (Vásquez, 1944) y Blattella germanica (Alali et al., 1998),
entre otros. Para esto se emplea diversos extractos orgánicos y no orgánicos de varias
partes del vegetal (Jacobson, 1958), cuyos principios activos son considerados inhibidores
del crecimiento (Gleye et al., 2000) y con efecto antialimentario comparables en actividad
a los mostrados por la isoflavona rotenona (Guadano et al., 2000) e incluso superables en
toxicidad a Azadirachta indica "nim" (Rodríguez, 2000).
Por esta razón, se hace necesario incentivar e incrementar la búsqueda de insecticidas
naturales con especificidad en las especies de la familia Annonaceae y demostrar así su
utilidad en salud pública para aportar mayores experiencias dirigidas al combate de
insectos vectores de enfermedades al hombre, debido a su bajo costo, capacidad de
biodegradación y como elemento racionalizador en el uso de insecticidas químicos,
permitiendo de esta manera replantear nuevas estrategias a través del control selectivo
de vectores propuesto por la Organización Mundial de la Salud (OMS, 2001). Bajo estas
consideraciones, el objetivo del presente trabajo fue evaluar in vitro la mortalidad de
larvas de Anopheles sp. empleando el extracto etanólico de las semillas de A. cherimolia
Mill. "chirimoya" y A. muricata L. "guanabana", así como determinar
la especie con mayor toxicidad larvaria.
Material y métodos
Obtención de larvas de Anopheles sp.
Las larvas de Anopheles sp. se colectaron según la metodología propuesta por Ogosuko,
(2002) a partir de criaderos naturales ubicados en las localidades de Santa Victoria y
Menocucho, distrito de Laredo, provincia de Trujillo, departamento de La Libertad; luego
se las trasladó al Laboratorio de Zoología de la Facultad de Ciencias Biológicas de la
Universidad Nacional de Trujillo
Crianza de larvas
La crianza de larvas se realizó en fuentes de porcelana de 40 x 28 x 5 cm con agua
potable declorinada reciclada interdiariamente. La alimentación a base de conejina
esterilizada a 80 ºC se agregó una vez por día y era proporcional al número de larvas
criadas (Ventosilla et al., 2002).
Obtención de las semillas
Las semillas de A. cherimolia y A. muricata se obtuvieron de un lote de frutos maduros
seleccionados al azar en los mercados de la ciudad de Trujillo.
Preparación de los extractos
30 gramos del endospermo de las semillas fueron finamente cortados y macerados en 150 mL
de etanol al 96% a temperatura ambiente durante una semana. Luego el solvente fue
evaporado mediante baño maría a 50 °C y el extracto seco obtenido fue redisuelto en 30
mL de agua destilada a la misma temperatura de evaporación, obteniéndose una solución
al 100% en peso del endospermo de las semillas por volumen de agua (% p/v).
Bioensayos
Se utilizaron 825 larvas del IV estadio de Anopheles sp. cuya distribución fue en dos
bloques: un bloque tratado con el extracto etanólico de las semillas de A. cherimolia
(E1) y el otro bloque tratado con el extracto etanólico de las semillas de A. muricata
(E2). Cada bloque se subdividió en 05 grupos experimentales con un solo grupo testigo
para ambos bloques, todos sometidos a tres repeticiones con 25 especímenes por
repetición. A los grupos experimentales se les agregó 0,01; 0,05; 0,1; 0,8 y 1,2 mL de
los extractos, respectivamente, aforados hasta 100 mL en agua destilada contenida en vasos
de tecknopor de 250 mL de capacidad. Todos los grupos se mantuvieron con un rango de
temperatura entre 23 y 26 ºC y humedad entre 75 y 80 %.
Evaluación de la mortalidad
Las lecturas de mortalidad se realizaron a la 1, 6, 12, 24, 36 y 48 horas. Las larvas se
consideraban muertas cuando no reaccionaban al momento de ser tocadas con un puntero romo
en la región cervical (Consoli y Lourenço de Oliveira, 1994).
Análisis estadístico
Los cálculos de la mortalidad corregida se realizaron mediante la fórmula de Abbott en
caso de muerte natural en el grupo testigo cuando éste era menor al 10%. Las
concentraciones letales al 50% (CL50) y 90% (CL90) y los tiempos letales al 50% (TL50) y
90 % (TL90), así como los valores de las pendientes con sus limites de confianza,
coeficientes de determinación y valores "chi" cuadrado (c2) se determinaron
utilizando el EPA Probit Analysis Program Ver. 1.5.
El efecto unitario y de interacción de las variables se determinaron mediante un
análisis de varianza bifactorial para un diseño de medidas de repetidas de observación
y el mayor efecto tóxico larvario se calculó dividiendo la suma del total de larvas
muertas en unidades probit de E2 sobre E1, expresados en porcentaje:
E1 total de larvas muertas en unidades probit
de x 100
E2 total de larvas muertas en unidades probit de
Resultados y discusión
La Tabla 1 muestra los porcentajes de mortalidad de las larvas del IV estadio de
Anopheles sp. corregidas por la fórmula de Abbott. Dicha mortalidad fue total a partir de
as 24 horas a las concentraciones de 0,8 y 1,2 mL/100 mL en ambos extractos y superior al
50% en las demás concentraciones a partir de las 36 horas de exposición. Además, el
extracto etanólico de las semillas de A. muricata (E2) alcanzó mayor toxicidad en
relación al extracto etanólico de las semillas de A. cherimolia (E1) en un 4,58%, según
el número total de larvas muertas en unidades probit, obtenido mediante la fórmula
anteriormente indicada.
Los datos de concentraciones letales (CL50 y CL90) y de tiempos letales (TL50 y TL90) se
encuentran en las Tablas 2 y 3, respectivamente. A las seis horas de exposición, se
empleó 0,41 mL de E1 y 0,314 mL de E2 para obtener una CL50 y 3,302 mL de E1 y 1,129 mL
de E2 para obtener una CL90. En tanto a las 48 horas de exposición, se empleó 0,009 mL
de E1 y 0,001 mL de E2 para conseguir una CL50 y se utilizó 0,038 mL de E1 y 0,016 mL de
E2 para obtener una CL90. En cuanto a la concentración de 0,01 mL/100 ml, se necesitó 31
h 28' empleando E1 y 19 h 43' haciendo uso de E2 para obtener un TL50, y 128 h 09'
utilizando E1 y 74 h 47' recurriendo a E2 para conseguir un TL90. Del mismo modo con la
concentración de 1,2 mL, se necesitó 3 h 13' empleando E1; 3 h 06' con E2 para obtener
un TL50; 9 h 42' utilizando E1, y 7 h 26' con E2 para conseguir un TL90. Por lo tanto, se
requerirá más cantidad de los extractos para producir mayor as 24 horas a las
concentraciones de 0,8 y 1,2 mL/100 mL en ambos extractos y superior al 50% en las demás
concentraciones a partir de las 36 horas de exposición. Además, el extracto etanólico
de las semillas de A. muricata (E2) alcanzó mayor toxicidad en relación al extracto
etanólico de las semillas de A. cherimolia (E1) en un 4,58%, según el número total de
larvas muertas en unidades probit, obtenido mediante la fórmula anteriormente indicada.
Los datos de concentraciones letales (CL50 y CL90) y de tiempos letales (TL50 y TL90) se
encuentran en las Tablas 2 y 3, respectivamente. A las seis horas de exposición, se
empleó 0,41 mL de E1 y 0,314 mL de E2 para obtener una CL50 y 3,302 mL de E1 y 1,129 mL
de E2 para obtener una CL90. En tanto a las 48 horas de exposición, se empleó 0,009 mL
de E1 y 0,001 mL de E2 para conseguir una CL50 y se utilizó 0,038 mL de E1 y 0,016 mL de
E2 para obtener una CL90. En cuanto a la concentración de 0,01 mL/100 ml, se necesitó 31
h 28' empleando E1 y 19 h 43' haciendo uso de E2 para obtener un TL50, y 128 h 09'
utilizando E1 y 74 h 47' recurriendo a E2 para conseguir un TL90. Del mismo modo con la
concentración de 1,2 mL, se necesitó 3 h 13' empleando E1; 3 h 06' con E2 para obtener
un TL50; 9 h 42' utilizando E1, y 7 h 26' con E2 para conseguir un TL90.
Por lo tanto, se requerirá más cantidad de los
extractos para producir mayor mación Probit de aplicación muy extensa en toxicología y
en ensayos biológicos (Mather, 1971). Este modelo implica llevar a logaritmo las
distintas intensidades del estímulo y transformar la respuesta a unidades Probit (Silva y
Casals, 2001). Los valores obtenidos para determinar si éstos se ajustan o no a dicha
transformación se demostraron mediante el cálculo de los valores c2calculados los cuales
fueron inferiores a los c2 tabulados con un a = 0,05. En las mismas tablas se indican los
valores de los intervalos de confianza y de las pendientes, cuyo recorrido no incluyó al
valor cero, demostrando el efecto tóxico de los extractos sobre las larvas (Ventosilla et
al., 2001). De otro lado, los valores propiamente dichos de las pendientes de la Tabla 4,
indicaron susceptibilidad heterogénea de las larvas hacia las concentraciones letales al
50% y 90% a lo largo de todos los tiempos de evaluación. Caso contrario sucede con los
valores de la pendientes de la Tabla 5, el cual muestra un mayor patrón de
susceptibilidad y por lo tanto de homogeneidad de las larvas a los tiempos letales al 50%
y 90% a medida que aumentaban las concentraciones de los extractos.
La forma de las rectas ajustadas, tal y como se observan en las Figuras 1a y b, indican la
presencia de una sola población de individuos cuya sensibilidad se distribuye normalmente
hasta las seis horas de exposición a los extractos, estableciendo homogeneidad en su
composición genética (Montada et al., 1989). Sin embargo, después de las 12 horas de
exposición (Fig. 1c) se observan ligeras inflexiones o partes horizontales que muestran
los diferentes genotipos o poblaciones intervinientes con susceptibilidades disímiles a
ambos extractos. La tendencia es repetitiva a medida del avance de los tiempos de
evaluación, tal y como se aprecian en las Figuras 1d, e y f correspondientes a las 24, 36
y 48 horas, respectivamente, manteniéndose aún dichas inflexiones y partes horizontales.
La situación anteriormente explicada, sumada a los valores bajos y un tanto diferentes de
las pendientes enumeradas en la Tabla 6, establecen una respuesta biológica heterogénea
de las larvas hacia las concentraciones de los extractos y estarían en relación directa
con la procedencia geográfica de los individuos (Menocucho y Santa Victoria), los cuales
fueron colectados a nivel de género, cuyos resultados podrían estar sobre o En relación
con lo anteriormente señalado, el efecto de los insecticidas vegetales es dependiente de
algunos factores extrínsecos, tales como la especie y variedad de la planta, época de
recolección, parte cosechada y forma de preparación, extracción y aplicación
(Rodríguez, 1996). En nuestro caso, el material biológico empleado en los bioensayos
fueron las semillas, reconocidas por utilizarse con mayor frecuencia en razón de su mayor
toxicidad y por almacenar mayor cantidad de principios activos en relación con las otras
partes del vegetal (Rodríguez, 2000). Asimismo, la extracción orgánica y redisolución
del extracto seco en agua destilada fue para neutralizar los posibles efectos biológicos
del solvente de extracción (Hoss, 1992). Ahora, entre los factores inherentes al
organismo de prueba, es de destacar la variación de la susceptibilidad de acuerdo a la
edad, estado de desarrollo, reorganización anatómica y a las variaciones propias de la
muda; existe además, una tasa metabólica muy baja en individuos cercanos a la pupación
(Lagunes y Villanueva citado por Silva y Casals, 1994), como las larvas.
De otro lado, la actividad tóxica de los principios activos de las annonas sería de
ingesta y de contacto (Stoll, 1989; Rodríguez, 2000). De ingesta, porque al alimentarse
las larvas mediante filtración y al no poseer una ingestión selectiva de partículas,
los larvicidas pueden ingresar libremente produciendo toxicidad digestiva (Forattini
citado por Consoli y Lourenço de Oliveira, 1994); y de contacto, mediante tres mecanismos
interdependientes: transporte desde la cutícula al sitio de acción, inhibición
enzimática y efecto sobre el sistema nervioso central, respiratorio u otro sistema
involucrado como una consecuencia bioquímica del primer mecanismo (Gunther y Jeppson,
1962). En ese sentido, la actividad insecticida puede deberse a una interacción o efecto
sinérgico de principios activos dada por un complejo alcaloidal
benciltetrahidroisoquinoleínico (Chen et al.,2001) de acción citotóxica (Bruneton,
1994) y por acetogeninas, conocidas por tener propiedades insecticidas, antifúngicas y
anticancerígenas (Alali et al., 1998); (Yao et al., 2000), cuya acción es la de inhibir
a la NADH ubiquinona oxidoreductasa del complejo I mitocondrial de la cadena respiratoria
(Tormo et al., 1999), además de la acción de diterpenos del tipo kaurano conocidos por
ser inhibidores del desarrollo de larvas (Valencia, 1994). En general, existen marcadas
diferencias en la velocidad de acción de los principios activos en individuos de una
misma especie de insectos, así como del grado de desarrollo de su sistema excretor y de
la capacidad de almacenamiento de éstos (Gunther y Jeppson, 1962), dados por los túbulos
de Malpighi y cuerpos grasos de los anofelinos, respectivamente (Consoli y Lourenço de
Oliveira, 1994).
En general, los resultados sugieren que se deben realizarrealizar mayores estudios in
vitro considerando ahora la diferenciación de especies para determinar susceptibilidades
a cada una de ellas, empleando otros métodos de extracción, utilizando diferentes partes
del vegetal o, en su defecto, realizar un screening o tamizaje fitoquímico empleando
otras especies de la familia Annonaceae en especial con las autóctonas registradas en
nuestra amazonía.
Conclusiones
¾ Se demostró el efecto bioinsecticida de ambos extractos sobre las larvas del IV
estadio de Anopheles sp., siendo el extracto etanólico de las semillas de A. muricata
más tóxico en relación al extracto etanólico de las semillas de A. cherimolia.
¾ El 100% de la mortalidad de las larvas se efectuó a partir de las 24 horas a las
concentraciones de 0,8 y 1,20 mL/100 mL en ambos extractos.
¾ La respuesta de las larvas hacia los extractos demostró diferentes susceptibilidades y
composición genética distintas.
Bibliografía
(1) Laboratorio de
Zoología. Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Nacional de Trujillo. Avenida
Juan Pablo II s/n. Trujillo. Perú. e-mail: mcba@terramail.com.pe
(2) Departamento de Estadística. Facultad de Ciencias Físicas y Matemáticas.
Universidad Nacional de Trujillo.
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