| Rev. per. biol.
Vol. 8 • Nº 2 • 2001 © Facultad de Ciencias Biológicas UNMSM |
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EVALUACIÓN DE ANTÍGENOS DE
Fasciola hepatica POR TRES MÉTODOS INMUNOLÓGICOS
Erasmo Colona, Libertad Alzamora y Julia Castro
RESUMEN
Se evaluaron los antígenos de excreción-secreción (AES) de Fasciola hepatica en
muestras de heces de ganado vacuno procedente de áreas endémicas de la Región Andrés
Avelino Cáceres (Sierra Central), mediante los métodos inmunológicos de ELISA
(“Fascidig”), hemaglutinación indirecta (HAI) y aglutinación en látex (AL).
Los resultados obtenidos se correlacionaron con el método coproparasitológico de Dennis
(CD). Se tomaron 106 muestras de heces de bovino en diferentes distritos, entre octubre y
noviembre de 1995 (época lluviosa).
El método de AL no detectó los AES; mediante HAI la especificidad fue del 63,6% y la
sensibilidad del 35% en relación al CD; por ELISA (“Fascidig”) se obtuvo una
especificidad del 68,2% y sensibilidad del 60% en relación al método CD y con respecto a
HAI la especificidad fue 61,7% y la sensibilidad 50%.
Se determinó una correlación significativa entre el método de ELISA
(“Fascidig”) y el CD, lo que indica que un diagnóstico por ELISA permite
conocer la enfermedad durante la fase prepatente o patente en relación al CD, que
diagnostica la enfermedad durante la fase patente.
El diagnóstico de la infección o prevalencia por HAI, ELISA y CD fue 35,8%, 42,5% y
37,7% respectivamente. El índice encontrado corresponde a una zona de alta prevalencia de
Fasciola hepatica.
El presente estudio permitió evaluar tres métodos inmunológicos y determinar la
eficiencia de ELISA-Fascidig como el método que posibilitaría el diagnóstico de la
fasciolosis durante la fase prepatente y patente de la enfermedad por hallazgo de
coproantígenos.
Palabras clave: Fasciola hepatica, Fascidig, Fascioliosis, Coproantígenos, Antígenos
de excreción-secreción.
ABSTRACT
Excretion–secretion antigens (ESA) of Fasciola hepatica were evaluated in bovine
feces samples from endemic area (Andrés Avelino Cáceres, Central Peruvian Andean). We
employed ELISA (Fascidig), Indirect hemagglutination (IHA) and Latex agglutination (LA);
the results were correlationated with Dennis coproparasitologic method (DC). A number of
106 bovine feces samples were obtained from diferent places of the Region between October
and November 1995 (rain time).
AES was not detected for LA, the specificity for IHA was 63,6% and the sensibility 35% in
relation to DC; the specificity for Elisa (Fascidig) was 68,2% and the sensibility was 60%
with regard to DC; and in relation to IHA the specificity was 61,7% and the sensibility
50%.
The correlation between ELISA (Fascidig) and DC was significative, it indicates that ELISA
is the best method for the fasciolosis diagnostic in the prepatent and patent phases,
while DC only is recommended for the patent phase diagnostic.
Diagnostic of infection or prevalence for IHA, ELISA and DC was 35,8%, 42,5% and 37,7%
respectively. The results indicate that in the investigated area the prevalence of
Fasciola hepatica is high.
Thanks to this investigation it was possible to evaluate three immunologic methods and to
determine the performance of ELISA-Fascidig for the diagnostic of fasciolosis both
prepatent and patent infection phases by means of the demonstration of coproantigens.
Key words: Fasciola hepatica, Fascidig, Fasciolosis, Coproantigens,
Excretion-secretion antigens.
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La fasciolosis o distomatosis hepática es una parasitosis cosmopolita de importancia
médico-veterinaria ocasionada por Fasciola hepática, tremátode que localizándose en
los conductos biliares afecta a mamíferos silvestres, domésticos (ganado vacuno y ovino)
y al hombre.
Esta parasitosis generalmente presenta dos fases: la fase prepatente o aguda y la fase
patente. La fase prepatente es el período durante el cual las fasciolas inmaduras migran
a través de la cavidad peritoneal, ingresan al hígado y luego al parénquima hepático;
y permanecen en los conductos biliares hasta su madurez. En esta fase no se eliminan
huevos del parásito en heces o fluido biliar.
La fase prepatente de la enfermedad puede diagnosticarse mediante exámenes
coproparasitológicos. Aunque la intermitencia en la expulsión de los huevos no permite
un diagnóstico exacto, si durante esta fase se realiza una ingesta constante de un
pequeño número de metacercarias el organismo produce resistencia al parásito, lo que se
evidencia con una marcada fibrosis y engrosamiento de los canalículos biliares.
La dificultad en diagnosticar el parasitismo por métodos coproparasitológicos e
inmunológicos convencionales (detección de anticuerpos) ha llevado al estudio de los
antígenos parasitarios en diferentes muestras biológicas (Castro et al., 1994).
Durante las fases prepatente y patente de la enfermedad no se hacen notorios los signos
patognomónicos, por lo cual la detección de antígenos parasitarios es de importancia,
ya que estos se relacionan con una infección reciente (parasitosis activa), lo que
constituye una ventaja con respecto a la determinación de anticuerpos.
Debido al incremento de esta parasitosis, la que es favorecida por las condiciones
ambientales y factores socioeconómicos de nuestro país, este trabajo tiene por objeto la
evaluación de tres métodos inmunológicos (ELISA-Fascidig, Hemaglutinación Indirecta y
Aglutinación en látex) que permitan diagnosticar la fasciolosis durante el período
prepatente de la enfermedad, comparando la eficiencia de los mismos con el examen
coproparasitológico.
MATERIALES Y MÉTODOS
1. Obtención de Fasciola hepatica
Se obtuvieron fasciolas vivas de hígados parasitados de ovino y se utilizaron en la
preparación del antígeno de excreción-secreción (AES).
2. Colección de muestras de heces
Se colectaron 106 muestras de heces de bovino provenientes de los distritos de La Oroya,
San Lorenzo, Cullpa Alta, Chaquicocha, Matahuasi, Huantaro, Acostambo, Sapallanga, Chongos
Alto y el entonces Instituto Peruano de Seguridad Social (hoy EsSalud) de Huancayo,
ubicados en la Región Andrés Avelino Cáceres, durante los meses de octubre y noviembre
de 1995 denominada época lluviosa por Leguía et al. (1988).
3. Procesamiento de las muestras de heces
Se pesó un gramo de heces de bovino en viales de penicilina y se homogenizó con 3 mL de
agua desionizada (pH 6,6), se filtraron en gasa recogiéndose el filtrado en tubos. Los
tubos se dejaron sedimentar durante toda la noche a 4 °C. El sobrenadante fue colectado y
se procedió a la determinación de AES por ELISA y HAI.
4. Preparación del antígeno de excreción-secreción empleado para la obtención
de suero anti-AES
Las fasciolas vivas de ovinos se colectaron en solución salina amortiguadora de fosfatos
(SSAF) estéril pH 7,2, con 100 mg/mL de estreptomicina y de ampicilina (solución de
mantenimiento: SM), se lavaron 6 veces con SM, se seleccionaron fasciolas vivas en un
matraz con SM y se incubaron a 37 °C por 24 horas.
La solución se colectó a 4 °C (en baño de hielo) y se centrífugó a 3500 rpm por 45
minutos, el sobrenadante fue colectado a 4 °C y almacenado a –20 °C hasta su uso.
El dosaje de proteínas se realizó por el método de Biuret.
5. Obtención del suero hiperiunmune anti-AES
Se inmunizó un conejo albino con AES (0,25 mg, por dosis) por vía intramuscular
empleando Coadyuvante Completo de Freund. El suero fue repartido en alícuotas que se
almacenaron a –20 °C hasta su uso.
6. Diagnóstico de Fasciolosis
6.1 MÉTODO COPROPARASITOLÓGICO
Se utilizó la técnica de concentración y cuantificación de Dennis (Dennis et al.,
1954).
Cinco gramos de heces de bovino se diluyeron en 2 mL de agua potable y se filtraron en
tamices metálicos con gasa. El filtrado se colocó en una copa de sedimentación y se
diluyó con agua potable dejándose en reposo durante 10 minutos. El sobrenadante se
eliminó y se agregó al sedimento agua potable hasta llenar la copa de sedimentación.
Este proceso se repitió dos veces consecutivas con la finalidad de clarificar el
sobrenadante. Al finalizar el tercer pasaje se obtuvieron 2 a 3 mL de sedimento, y se
observó al microscopio.
6.2 MÉTODOS INMUNOLÓGICOS
a) Aglutinación en Látex (pasiva reversa)
Se mezclaron 1,5 mL de látex estandarizado (Bacto látex 0,81µ, DIFCO) con 1,5 mL de
suero hiperinmune sin diluir y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos con
agitación suave cada 10 minutos (Alzamora et al., 1999). El látex sensibilizado con
anti-AES se empleó para detectar AES en las muestras de heces procesadas.
b) Hemaglutinación indirecta (HAI-pasiva reversa)
Se emplearon glóbulos rojos de carnero tanizados y sensibilizados (GRCS) con suero
hiperinmune de conejo anti-AES. La mezcla se incubó en baño María a 37 °C durante 30
minutos. Los GRCS se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 minutos, el sobrenadante se
eliminó y las células se lavaron 2 veces usando SSAF con 1% de suero normal
descomplementado de conejo (SNC); a 1500 rpm por 5 y 10 minutos. Del paquete obtenido se
preparó una suspensión en SSAF-SNC 1%.
La determinación del AES se realizó mezclando 40 µL del sobrenadante de la muestra de
heces y 40 µL de GRCS. Las placas se dejaron en reposo a 4 °C durante 18 horas.
c) ELISA (Tipo Sandwich)
Se empleó el kit diagnóstico “Fascidig” elaborado por el Instituto Pedro Kouri
de La Habana-Cuba. Este método, que se aplicó según la técnica descrita por Espino et
al.(1992 y 1994), se basa en la detección de antígenos en heces (coproantígenos) usando
el anticuerpo monoclonal ES-78 de subclase IgG 2a.
De cada muestra de heces se extrajeron 100 µL, se colocaron en los pocillos de la placa
de ELISA, y se incubaron dos horas a temperatura ambiente en cámara húmeda. Se la varon 6 veces con el buffer de lavado del kit. Luego, a cada pocillo se agregaron
100 µL del conjugado y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente en cámara
húmeda. Los pocillos se lavaron 6 veces con el buffer de lavado y se añadió a cada
pocillo 100 µL de sustrato ortofenilendiamina (OPD) y posteriormente peróxido de
hidrógeno al 30%.
Tabla 1
Tabla 2.
Determinación de parasitosis por F. hepática según el lugar de procedencia
|
PROCEDENCIA
(Región Andrés A. Cáceres) |
N.° de
Casos Positivos |
| HAI |
ELISA |
DENNIS |
| La Oroya |
1 |
2 |
2 |
| San Lorenzo |
3 |
5 |
1 |
| Cullpa Alta |
2 |
3 |
4 |
| Chaquicocha |
10 |
13 |
7 |
| Matahuasi |
1 |
2 |
2 |
| Huantaro |
1 |
3 |
2 |
| Acostambo |
1 |
4 |
10 |
| Sapallanga |
3 |
0 |
1 |
| Chongos Alto |
7 |
0 |
3 |
| IPSS-Huancayo |
9 |
13 |
8 |
| Total |
38 |
45 |
40 |
|
La placa se incubó por 30 minutos
a temperatura ambiente, en oscuridad, y se procedió a la lectura.
7. Procesamiento y análisis estadístico de los resultados
En pruebas diagnósticas en las que se manejan variables categóricas dicotómicas (+,-)
la validez se conceptualiza en los términos de sensibilidad y especificidad. Para
determinar la especificidad y la sensibilidad se emplearon las tablas de contingencia
2×2.
El valor predictivo positivo Vp(+) es definido como la proporción de sujetos con
resultados positivos para la prueba y que realmente son positivos.
El valor predictivo negativo Vp(-) es definido como la proporción de sujetos con
resultados negativos para la prueba y que realmente son negativos.
Para determinar si existe correlación significativa entre los resultados de los 3
métodos inmunológicos y el examen coproparasitológico, se aplicó el método
estadístico del Chi cuadrado.
RESULTADOS
I. Detección de AES en muestras de heces de ganado vacuno por los métodos de
Aglutinación en Látex (AL), Hemaglutinación Indirecta (HAI) y ELISA (Fascidig)
Los resultados obtenidos en las pruebas de Elisa, HAI y CD por cada caso y distrito, se
presentan en las tablas 1 y 2. El método de aglutinación en látex no detectó el AES.
Mediante el método de HAI la especificidad fue del 63,6% y la sensibilidad del 35% en
relación al coproparasitológico. Los valores predictivos positivos y negativos fueron
34,2% y 61,8% respectivamente (Tabla 3).
Tabla 3.
Especificidad y sensibilidad del método Hemaglutinación indirecta (HAI) con respecto al
coproparasitológico de Dennis para coproantígenos de Fasciola hepatica en bovinos.
|
| |
Coproparasitológico
de Dennis |
| |
Positivo |
Negativo |
Total |
|
| Positivo |
14 |
24 |
38 |
| Negativo |
26 |
42 |
68 |
| Total |
40 |
66 |
106 |
| s=35% |
|
e=63,6% |
|
|
|
Vp (+) = 34,2% Vp (-) 61,8%
c2= 0,016 |
El método de ELISA (“Fascidig”) mostró una especificidad del 68,2% y
sensibilidad del 60% en relación al método coproparasitológico. Los valores predictivos
positivos y negativos fueron del 53,3% y 73,8% respectivamente (Tabla 4).
El método ELISA mostró con respecto a HAI una especificidad del 61,7%, sensibilidad 50%
y valores predictivos positivos y negativos del 42,2% y 68,9% respectivamente (Tabla 5).
II. Detección de huevos de Fasciola hepatica en muestras de heces por el método CD.
En cuarenta muestras, se determinaron de 1 a 5 huevos por gramo de heces.
III. Comparación de los métodos de Hemaglutinación Indirecta (HAI) y ELISA
(“Fascidig”) con el método coproparasitológico de Dennis (CD)
Con la finalidad de determinar la correlación entre los 3 métodos inmunológicos y el CD
se obtuvo el Chi cuadrado con un nivel de significación estadística del 10% que
corresponde a un valor de 2,71.
La HAI con respecto al CD mostró un valor de 0,016, que no es significativo (menor que
2,71), mientras que ELISA en relación al CD obtuvo un valor de 8,19, que si es
significativo (mayor que 2,71).
Cuando se correlacionaron ELISA y HAI se encontró un valor de 1,45 que no es
significativo (Tabla 5).
Tabla 4. Especificidad
y sensibilidad del método ELISA (Fascidig) con respecto al coproparasitológico de Dennis
para coproantígenos de Fasciola hepatica en bovinos.
|
E
L
I
S
A |
Coproparasitológico
de Dennis |
| |
Positivo |
Negativo |
Total |
| Positivo |
24 |
21 |
45 |
| Negativo |
16 |
45 |
61 |
| Total |
40 |
66 |
106 |
| s=60% |
|
|
|
|
|
Vp(+)=53,3%
Vp(-)=73,8%
c2=8,19 |
Tabla 5.
Especificidad y sensibilidad del método ELISA (Fascidig) con respecto al de
Hemaglutinación Indirecta (Pasiva Reversa) para coproantígenos de Fasciola hepatica en
bovinos.
|
| |
Coproparasitológico
de Dennis |
| Positivo |
Negativo |
Total |
E
L
I
S
A |
| Positivo |
24 |
21 |
445 |
| Negativo |
16 |
45 |
61 |
| Total |
40 |
66 |
106 |
| s=60% |
|
e=68,2% |
|
| Vp(+)=53,3%
Vp(-)=73,8% c2=8,19 |
IV. Detección del estado de infección con F. hepatica (casos positivos) según el
lugar de procedencia.
En las tablas 1 y 2 se describe la incidencia en los distintos lugares de procedencia.
Los lugares de mayor incidencia, según HAI y ELISA fueron Chaquicocha e IPSS-Huancayo;
mientras que por el CD fueron Acostambo e IPSS-Huancayo. Los de menor incidencia según
HAI fueron la Oroya, Matahuasi, Huantaro y Acostambo; por Elisa Sapallanga y Chongos Altos
y por el CD San Lorenzo y Sapallanga.
Se mostró una similar incidencia en los lugares de la Oroya y Matahuasi con los métodos
de ELISA y CD.
V. Evaluación del estado de infección por los métodos inmunológicos de
Hemaglutinación Indirecta y ELISA (Fascidig) y el coproparasitológico de Dennis.
Por medio de HAI se determinaron un total de 38 casos positivos lo que corresponde al
35,8% del total de casos evaluados (Tabla 5).
EL método de ELISA detectó 45 casos positivos, lo que equivale al 42,5 % del total de
casos evaluados. El mayor número de muestras positivas fueron determinadas por este
método. El CD determinó una prevalencia del 37,7% (Figura 1)
Se presentaron 9 casos negativos a CD y positivos tanto para HAI como para ELISA. Esto
pondría en evidencia la fase prepatente o aguda de la enfermedad en la que la presencia
de huevos del parásito es nula.
Los casos positivos por los tres métodos se relacionarían con la fase patente de la
enfermedad. Los casos positivos se incrementaron en un 19,8% y 22,6% al relacionar el
método de ELISA con el CD respectivamente.
DISCUSIÓN
Los métodos inmunológicos convencionales y coproparasitológicos han sido lo
suficientemente eficaces en el diagnóstico de las infecciones activas por parásitos; la
alternativa para la detección se ha basado en la presencia de antígenos parasitarios en
diversas muestras biológicas (Deplazes, et al. 1991; Espino, et al. 1994). En el caso
particular de la fasciolosis , la fase prepatente se caracteriza por la ausencia de huevos
del parásito y la fase patente por la intermitencia en la expulsión de los mismos
(Levine et al., 1980; Chenm y Mott 1990).
La detección de antígenos parasitarios en muestras fecales (coproantígenos) debido a su
fácil obtención, manejo y transporte resulta de gran ayuda para un diagnóstico certero.
 |
Figura 1. Resultados
comparativos entre los métodos inmunológicos y el Dennis para el diagnóstico de la
fascioliosis bovina (Región A.A. Cáceres - 1995) |
Con relación a la hemaglutinación indirecta (pasiva reversa) se mostró una
especificidad de 63,6% y una sensibilidad del 35%, datos determinados tomando como método
de referencia al coproparasitológico.
No hay reportes en los que se detecten antígenos en suero o heces por hemaglutinación
indirecta que permitan comparar los resultados obtenidos en el presente estudio.
Sin embargo Knobloch (1985), evaluando anticuerpos en sueros de humanos con fasciolosis
crónica, determinó por hemaglutinación indirecta una sensibilidad del 56%, mientras que
Gorman et al., en 1990 encontraron en sueros de ovinos una sensibilidad del 55,4%.
De acuerdo a los resultados, el método HAI no es muy sensible (35%) respecto al CD y
ELISA; sin embargo, para la determinación de la fase prepatente mostró mayor eficiencia
que el CD (Tabla 2), con casos negativos por CD pero coincidentemente positivos por ELISA
y HAI. La baja sensibilidad podría deberse a que otras proteínas del suero hiperinmune
utilizado interfieren en la prueba al unirse al glóbulo rojo de carnero tanizado,
evitando una sensibilización uniforme con los anticuerpos anti-AES, se podría mejorar el
método de HAI-pasiva reversa, ya que constituiría una alternativa económica para el
diagnóstico de esta parasitosis.
Mediante la prueba de ELISA (“Fascidig”) la especificidad y sensibilidad que se
obtuvo con respecto al coproparasitológico de Dennis fue del 68,2% y 60% respectivamente.
Estos datos son menores que los reportados por Castro et al., en 1994, los cuales
utilizando el kit “Fascidig” para coproantígenos encontraron una especificidad
del 99% y sensibilidad de 95,3%. La diferencia de resultados podría tener relación con
la baja densidad parasitaria encontrada, a diferencia de lo reportado por Castro (1993),
quien halló una elevada carga parasitaria por el método de Dennis (26 a 156 huevos/g de
heces).
El método de ELISA en relación con HAI demostró una especificidad del 61,7% y
sensibilidad del 50%. No existen referencias que permitan discutir los datos encontrados.
Se determinó una correlación significativa entre el “Fascidig” y el método de
Dennis (Tabla 3), lo que indica que se puede realizar el diagnóstico de la enfermedad
durante la fase prepatente o patente; cabe recalcar que el método de Dennis sólo permite
el diagnóstico de la enfermedad durante la fase patente. Esta correlación se compara a
lo reportado por Castro (1993) que encontró una relación significativa entre ambos
métodos.
Con respecto a la incidencia, el mayor número de casos coincidentemente según HAI y
ELISA fueron Chaquicocha e IPSS-Huancayo mientras que por CD fueron Acostambo e
IPSS-Huancayo (Tabla 2), datos que no se relacionan con los obtenidos por Castro y Colona
(1996), quienes determinaron el mayor número casos por ELISA en las comunidades de
Chongos Alto y Matahuasi. Estos resultados indican variación de la parasitosis en
relación al tiempo.
El menor número de muestras colectadas explicaría la diferencia demostrada con el
reporte de Castro y Colona (1996); sin embargo, en Chongos Alto aunque el número de
muestras fue mayor, no se detectaron casos positivos por el método de ELISA probablemente
debido a una baja densidad parasitaria por individuo, ya que no se puede descartar
totalmente el parasitismo, además de las investigaciones realizadas por Castro (1993),
que demostró en animales de matadero la existencia de una correlación estadísticamente
significativa entre la intensidad de la infección, la excreción de huevos y la
concentración de antígenos en heces.
El estado de infección o prevalencia determinado por HAI fue del 35,8% mientras que el
obtenido por ELISA y el método de Dennis fue del 42,5% y 37,7% respectivamente (Figura
1). El índice encontrado corresponde a una zona de alta prevalencia de fasciolosis de
acuerdo a los datos reportados por Leguía et al, 1988.
Estos investigadores clasificaron la prevalencia de distomatosis por áreas, y se
considera el departamento de Junín (Región A. A. Cáceres) como un lugar de alta
prevalencia.
Los resultados obtenidos en el presente estudio (42,5%) y en el realizado por Castro y
Colona en 1996 (74,02%) también demuestran que la zona investigada es de alta prevalencia
para Fasciola hepatica.
El presente estudio permitió evaluar tres métodos inmunológicos (HAI, ELISA y CD) y
determinar la eficiencia de ELISA-“Fascidig” para diagnosticar la fasciolosis
durante la fase prepatente y patente de la enfermedad por hallazgo de coproantígenos.
AGRADECIMIENTOS
Al Dr. Jorge Ruiz Salomé, Jefe de la Oficina Veterinaria del Frigorífico Moderna S. A.,
y al Sr. Edinson Villanueva por la ayuda prestada para la obtención del material
biológico.
A la Bach. María Maysundo Reyes por su apoyo en la colección y transporte del material
biológico.
Reeferencias
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* Laboratorio de Inmunoparasitología y
Epidemiología. Instituto de Investigación de Ciencias Biológicas “Antonio
Raimondi”. UNMSM. Lima-Perú.
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