BACTERIAS MARINAS CON CAPACIDAD
ANTIMICROBIANA AISLADAS
INTRODUCCIÓN Los microorganismos marinos, así como algunos invertebrados han sido considerados virtuales productores de metabolitos biológicamente activos. Numerosos trabajos han revelado la existencia de cepas de bacterias marinas que producen diversos metabolitos secundarios, entre ellas las sustancias antibacterianas (Gauthier y Flatau, 1976; Dopazo et al., 1988; Lemos et al., 1985b; Marty y Martin, 1992). En ambientes marinos la búsqueda de bacterias nativas con capacidad inhibitoria se ha realizado a partir de diversas muestras (agua, sedimentos, plancton, vertebrados e invertebrados) (Toranzo et al., 1982; Lemos et al., 1985b; Nair y Simidu, 1987; Dopazo et al., 1988). Las superficies y espacios internos de organismos marinos son considerados microhábitats donde se encuentran regularmente los microorganismos, que son considerados objeto de estudio para el aislamiento de diversas bacterias con potencial biológico (Bonar et al., 1986). Los cultivos de bivalvos marinos, tales como Argopecten purpuratus “concha de abanico” y Crassostrea gigas “ostras”, se ven obstaculizados por la elevada mortalidad larval que se atribuye a la presencia de bacterias patógenas marinas como Vibrio anguillarum y Vibrio alginolyticus (Navarro et al., 1991; Riquelme et al., 1995). Por otro lado, los antibióticos son usados por los acuicultores como una forma de prevenir el establecimiento de bacterias patógenas y en el tratamiento de especies afectadas (Jeanthon et al., 1988; Karunasagar et al., 1994). Sin embargo, el uso de estos antibióticos tiene también aplicabilidad limitada en esta actividad, debido a que los patógenos marinos al igual que otras bacterias desarrollan la capacidad de resistencia a dichos antibióticos (Riquelme et al., 1996) como consecuencia de la transferencia rápida de resistencia mediada por plásmidos (Westerdahl et al., 1991). Un método alternativo para controlar los diferentes problemas microbiológicos que se presentan en los sistemas de cultivos, podría ser la adición de cultivos puros de bacterias nativas productoras de sustancias inhibitorias de bacterias patógenas marinas (Riquelme et al., 1996; Douillet y Langdon, 1994; León, 1996). El presente trabajo, describe el aislamiento, el potencial inhibitorio y caracterización fenotípica de la flora nativa bacteriana asociada a cultivos de Argopecten purpuratus “concha de abanico” y Crassostrea gigas “ostra”. MATERIALES Y MÉTODOS LUGAR DE MUESTREO Y RECOLECCIÓN DE MUESTRAS Para el aislamiento y estudio de bacterias marinas con capacidad inhibitoria se colectaron 70 muestras de Argopecten purpuratus “concha de abanico” y 15 de Crassostrea gigas “ostra” cultivadas en las zonas denominadas El Carbón (12°27’06”S y 76°47’07”W) y La Tiza (12°26’00”S y 76°46’30”W) en Pucusana y la Isla San Lorenzo (12°05’30”S y 77°11’28”W) en el Callao. Las muestras fueron recolectadas en forma aséptica y conservadas en hielo hasta su procesamiento en el laboratorio. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS MARINAS Las muestras se procesaron mediante la técnica descrita por León (1996). Se realizó la disección respectiva de los bivalvos bajo condiciones estériles y se prepararon diluciones al décimo a partir de un primer homogenizado de tejido blando (25 g de tejido en 225 ml de agua de mar filtrada y esterilizada). Para el aislamiento de bacterias marinas las muestras diluidas se homogenizaron en un “vortex mixer”, y se diseminaron alícuotas (0,1 ml) de cada dilución sobre la superficie de placas con Agar Marino Modificado (MA) (g/l: Bacto-peptona 5,0; Extracto de levadura 2,0; Bactoagar 15,0; agua de mar añeja 750ml y agua destilada 250 ml. pH final: 7,6). Las placas fueron sembradas por duplicado e incubadas a 20 °C durante 6 días.
SELECCIÓN Y CONSERVACIÓN DE BACTERIAS INHIBITORIAS Para la selección de bacterias marinas productoras de sustancias inhibitorias se aplicó el método de “doble capa” según Dopazo et al. (1988) utilizando como cepa control a Staphylococcus aureus ATCC 6633. Las colonias de bacterias marinas que presentaron halos de inhibición frente a la cepa control fueron consideradas inhibitorias y conservadas en el medio MA semisólido para cultivos de rutina en estudios posteriores. PRUEBAS DE ANTIBIOSIS FRENTE A BACTERIAS PATÓGENAS DE PECES Y MOLUSCOS Para las pruebas de antibiosis frente a bacterias patógenas de peces y moluscos se utilizaron 9 cepas patógenas de colección (donadas por la University of Maryland Biotechnology Institute, USA, y Universidad de Santiago de Compostela, España) (Tabla 1). El espectro de antibiosis de las cepas marinas aisladas fue evaluado por el método modificado de Westerdahl et al. (1991). Según este método las cepas en estudio se cultivaron para formar macrocolonias en el medio MA y fueron incubadas a 20 °C durante 5 días. Después de la incubación las placas con los cultivos fueron sometidos a vapores de cloroformo por 45 minutos e inmediatamente se agregó una segunda capa de agar semisólido previamente inoculado con la bacteria patógena en prueba. Los cultivos fueron incubados a 30 °C durante 24-30 horas. La presencia de un halo de inhibición definido alrededor de las macrocolonias fue considerada actividad antibacteriana. CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA DE BACTERIAS INHIBITORIAS Las cepas inhibitorias de bacterias patógenas de peces y moluscos previamente seleccionadas fueron sometidas a caracterización fenotípica. Estas cepas fueron evaluadas mediante pruebas morfológicas fisiológicas y bioquímicas siguiendo los procedimientos descritos por Baumann et al. (1972), Oliver (1982), Ortigosa et al. (1994), Jensen y Fenical (1995). La caracterización fenotípica se realizó mediante las siguientes pruebas convencionales: morfología celular, motilidad, carácter Gram, formación de pigmentos, luminiscencia, citocromo-oxidasa, catalasa, metabolismo oxido-fermentativo (OF), reducción de nitrato, actividades enzimáticas extracelulares (hidrólisis de gelatina, caseína, almidón, DNA, celulosa, tween 80, queratina y lecitina), requirimiento de agua de mar para el crecimiento y otras pruebas complementarias. El medio base para todas las pruebas fue Caldo Marino (MB) o Agar Marino (MA). La temperatura de incubación fue de 23 °C y la lectura final se realizó a los 4-5 días, excepto para la producción de enzimas extracelulares, caso en que el tiempo de incubación se prolongó hasta 10 días.
ANTIBIOSIS FRENTE A BACTERIAS
PATÓGENAS DE PECES Y MOLUSCOS
En cuanto al metabolismo OF de la glucosa el comportamiento fue variable; sin embargo, sólo la cepa CA.19 mostró metabolismo oxidativo. Ninguna de las cepas produjo gas a partir de glucosa. Con relación a la producción de enzimas extracelulares, la mayoría de cepas mostraron ser productores de algunas de estas enzimas tales como gelatinasa, tween esterasa, fosfolipasa, DNAsa, lecitinasa, caseinasa, amilasa y quitinasa. Ninguna cepa fue positiva en la producción de ureasa y celulasa. En la prueba de requerimiento de agua de mar, la mayoría de las cepas requirieron de agua de mar para crecer, a excepción de las cepas OS.49, CA.12 y CA.19. IDENTIFICACIÓN DE LAS CEPAS INHIBITORIAS Las 20 cepas inhibitorias seleccionadas y caracterizadas fenotípicamente fueron identificadas como miembros de los géneros Vibrio (40%), Aeromonas (15%), Flavobacterium (10%), Pseudomonas (5%), Moraxella (5%) y Flexibacter (5%). Cuatro cepas no fueron identificadas (20%) (Tabla 4). Los resultados con el sistema de identificación API 20NE fueron similares a los obtenidos mediante pruebas bioquímicas convencionales. DISCUSIÓN Trabajos orientados a la búsqueda de bacterias nativas con capacidad inhibitoria describen a dichas cepas como epibiontes, epífitas o parte de la microflora nativa del tracto digestivo del hospedero (Lemos et al., 1985b; Bonar et al., 1986). En consecuencia, nuestros resultados ratifican que invertebrados marinos como Argopecten purpuratus y Crassostrea gigas son también hospederos de una variada flora microbiana y entre ellas aquellas que tienen actividad antibacteriana. Se afirma que en la interacción invertebrados-bacterias el rol que desempeñan los microorganismos está relacionado con actividades como simbiosis, sinergismo, antagonismo u otra modalidad de interacción (Bonar et al. 1986; Nair y Simidu, 1987). En el caso particular del presente trabajo, la capacidad inhibitoria de amplio espectro mostrada por las cepas evaluadas podría servir como base para estudios posteriores de la interacción antagonista de las bacterias frente a posibles patógenos en el hospedero. La metodología aplicada utilizando como cepa testigo a Staphylococcus aureus ATCC 6633 fue clave en el aislamiento y selección inicial de un número considerable de cepas inhibitorias (83). El uso de esta bacteria (Gram positiva) como indicadora de antagonismo permitió recuperar mayor número de cepas marinas gracias a la alta sensibilidad inhibitoria mostrada en comparación con las bacterias Gram negativas (resultado no descrito). En este sentido, nuestros resultados son coincidentes con los trabajos de Lemos et al. (1985); Nair y Simidu (1987) y Barja et al. (1989) quienes a su vez utilizaron también bacterias Gram positivas como Bacillus subtilis, Staphylococcus sp. y Streptococcus. El antagonismo ensayado entre cepas de bacterias marinas y cepas referenciales de patógenos marinos Gram negativos han sido considerados de interés en acuicultura por Dopazo et al. (1988), Lemos et al. (1985), Westerdahl et al. (1991) y Riquelme et al. (1996, 1997). Resultados similares son obtenidos en las pruebas de antibiosis entre bacterias seleccionadas en el presente trabajo y la colección de patógenos de peces y moluscos. En consecuencia, la observación de una marcada efectividad inhibitoria sobre ictiopatógenos es evidentemente significativo tratándose además de cepas nativas aisladas de posibles hospederos de patógenos como es en este caso Argopecten purpuratus y Crassostrea gigas. Por otro lado los patógenos marinos Aeromonas sobria P-281, Vibrio anguillarum ATCC 19264 y V. anguillarum NCMB 2133 evidenciaron mayor sensibilidad en comparación con los patógenos Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442 y Yersinia ruckeri PP-31. Datos similares fueron obtenidos también por Lemos et al. (1985b), Nair y Simidu, (1987) y Fabregas et al. (1991). Trabajos previos (Gauthier (1976), Barja et al. (1989) y Lemos et al. (1985) señalan que bajo condiciones de subcultivos prolongados muchas cepas ambientales pierden su capacidad antagónica en forma gradual, llegando inclusive a una pérdida total de actividad. En nuestro caso, si bien es cierto que se notó una ligera disminución de esta actividad en algunas cepas, la gran mayoría conservó el potencial inhibitorio en cultivos mantenidos hasta por 90 días (no descrito en el presente trabajo). Esta particularidad es importante tomar en cuenta para casos de una posible aplicación práctica. Un aspecto particular de muchas bacterias ambientales es el comportamiento frecuentemente variable frente a la tinción Gram (“Gram variable”). En nuestro caso, la mayoría de las cepas inhibitorias se observaron como Gram negativas durante la fase logarítmica pero como “Gram positivas” en cultivos tardíos. Esta característica para bacterias marinas es citada también por Gauthier (1975) e Imada et al. (1985). A pesar de que la pigmentación de cepas no fue un criterio de selección en el presente trabajo, las cepas OS.16, OS.26 y CA.13 fueron pigmentadas y presentaron fuerte actividad inhibitoria con todos los patógenos ensayados. Autores como Gauthier (1975), Gauthier y Flatau (1976), Lemos et al. (1985), Dopazo et al. (1988), entre otros, seleccionaron sus cepas considerando la pigmentación, obteniendo en la mayoría de los casos cepas fuertemente inhibitorias. A partir de estos resultados podríamos suponer que ciertas bacterias marinas pigmentadas representarían cepas con mayores potencialidades de producir sustancias inhibitorias de bacterias patógenas de organismos marinos. El género predominante de las cepas inhibitorias fue Vibrio (40%). Este resultado no hace más que corroborar la microflora nativa que predomina en medios acuáticos asociados a organismos marinos. Sobre la base de estudios realizados por otros autores, los vibrios son comúnmente la fuente de sustancias inhibitorias y por tanto antagonistas a otras especies bacterianas del mismo hábitat sean o no patógenos de peces y moluscos (Buck y Meyers, 1965, Doggett,1968, Olsson et al. 1992, León 1996, Riquelme et al. 1995, 1997). Cepas inhibitorias identificadas en el presente trabajo como Flavobacterium (OS.16 y OS.26) resultaron ser los mejores antagonistas y merecen sin duda estudios complementarios, a diferencia de aquellas reportadas por Okami (1986), quien a su vez resalta en Flavobacterium su actividad antiparasitaria. Un aspecto de las bacterias marinas que ha sido tomada en cuenta muy escasamente es la capacidad de producir enzimas extracelulares. Al respecto, Ogawa y Shimazu (1999) consideran esta característica de suma importancia sobre todo por las aplicaciones que éstas tendrían en biotecnología. Nuestros aislados, además del potencial inhibitorio, resultaron tener capacidad en la producción de exoenzimas que actúan frente a diversos polímeros. Los resultados obtenidos en este trabajo representan un aporte a las investigaciones recientes sobre bacterias marinas productoras de sustancias inhibitorias y su posible aplicación en acuicultura intensiva. En este sentido, queda abierta la posibilidad de que las cepas seleccionadas sean evaluadas en el control de patógenos que afectan a cultivos intensivos de invertebrados como de larvas de Argopecten purpuratus y Crassostrea gigas. Referencias ________________________________ 1 Lab. Microbiología Ambiental y Biotecnología, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima – Perú.2 Lab. Microbiología, Instituto del Mar del Perú – IMARPE. |
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